Imagerie des récepteurs d'estrogènes α chez le rat artérioles Pial aide d'un microscope numérique immunofluorescence

L'objectif général de cette procédure est de décrire une technique simple permettant d'optimiser la coloration et la visualisation du récepteur des œstrogènes alpha à l'aide de coupes transversales d'artérioles de la pie-mère obtenues à partir de cerveaux de rats femelles. Cette méthode consiste d'abord à prélever les artérioles de la pie-mère marquées au bleu d'Évans à la surface du cerveau, puis à les découper en anneaux de huit microns à l'aide d'un cryostat après inclusion. Les coupes transversales sont montées sur des lames et incubées avec un anticorps primaire dirigé contre le récepteur des œstrogènes alpha.

Ensuite, les sections sont incubées avec l'anticorps secondaire et une contre-coloration en utilisant un milieu de montage contenant dpi. Enfin, les segments de vaisseaux pelés marqués par fluorescence sont observés et convertis en images 2D à l'aide d'un logiciel de mise au point sur une profondeur étendue. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant le récepteur d'œstrogène alpha des artérioles pelées, grâce à l'utilisation d'un microscope immunofluorescent Nikon équipé d'un logiciel de profondeur de mise au point étendue.

Je m'appelle le Dr Marguerite Littleton Kearney. Aujourd'hui, le Dr Neil Far ani, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, va démontrer une procédure simple afin d'optimiser la visualisation et la coloration du récepteur des œstrogènes alpha dans l'écorce.

Artères thoraciques d'un cerveau de rat qui a été perfusé avec un colorant bleu d'Évans et stocké à moins 70 degrés Celsius. À l'aide d'un microscope stéréoscopique, identifier les artères péliculaires à la surface du cerveau et les retirer à l'aide de pinces fines. Enlever soigneusement tout tissu cérébral adhérent.

Placer les artères dans un petit tube à essai sur de la glace. Fixer les artères dans du formaldéhyde glacé à 2 % dans 0,1 mole de PBS pendant 30 minutes. Pour préparer les artères au découpage, verser le milieu d'inclusion sur un disque de congélation réglé à moins 20 degrés Celsius.

Placer un fragment d'artère à plat sur le chug et attendre qu'il gèle. Une fois solidement congelé, positionner l'artère verticalement dans le milieu d'inclusion sur le plateau de congélation du cryostat. Veiller à ce que l'extrémité de l'artère soit orientée vers l'avant.

Tenez l'artère avec une pince jusqu'à ce qu'elle soit solidement congelée. Placez le disque de congélation avec l'artère dans la tête du cryostat, puis découpez des anneaux artériels de huit micromètres directement sur une lame. Montez les sections artérielles sur une gélatine au chromate de potassium.

Déplacez les lames à l’aide de deux pinceaux afin d’aligner les anneaux artériels. Conservez les lames préparées dans une boîte à lames au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Retirez les lames du réfrigérateur et laissez-les atteindre la température ambiante sur le plan de travail.

Lavez les lames avec un à 1,5 millilitre de PBS 0,1 molaire. Après 10 minutes, éliminez le PBS et répétez l'opération deux fois supplémentaires. Après le dernier lavage au PBS, incubez les lames dans un millilitre de chlorure d'ammonium 50 millimolaire pendant 30 minutes à température ambiante afin de réduire la fluorescence endogène. Lavez ensuite les lames au PBS 0,1 molaire trois fois pendant 10 minutes par lavage, comme décrit précédemment. Ensuite, bloquez les lames dans une solution de PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 et 1 % de sérum de chèvre normal pendant 30 minutes pour réduire la liaison non spécifique de l'anticorps primaire.

Après le blocage, incuber les lames avec l'anticorps primaire dirigé contre ER alpha dilué à une concentration de 1/500 dans la solution de blocage toute la nuit à quatre degrés Celsius. Retirer les lames du réfrigérateur et les ramener à température ambiante. Éliminer tout anticorps primaire non lié en lavant avec 1 à 1,5 millilitre de PBS 0,1 % trois fois pendant 10 minutes.

À chaque fois, incubez les lames avec le secondaire anti-lapin Oregon Green 488 dans la solution de blocage pendant deux heures à l’obscurité et à température ambiante. Après l’incubation, lavez les lames trois fois dans du PBS 0,1 molaire, 10 minutes par lavage, puis placez-les sous une hotte ventilée. Déposez une goutte de milieu de montage contenant du DAPI sur les préparations, puis posez une lame de couverture sur l’échantillon. Scellez les bords de la lame de couverture avec du vernis incolore et laissez sécher complètement.

Insérez les lames préparées contenant les segments de vaisseaux de pelure colorés sous le microscope et effectuez les réglages nécessaires pour visualiser les zones d'intérêt marquées par fluorescence. La visualisation de l'ER alpha coloré constitue l'étape la plus délicate de cette procédure. Repérez le plan du vaisseau coupé présentant les récepteurs les plus nets.

Commencez avec un grossissement de 100 fois, puis augmentez le grossissement jusqu'à 600 fois. Utilisez la caméra pour capturer des images dans les canaux DPI et ZI respectivement pour les noyaux cellulaires et DR alpha, puis utilisez un logiciel pour convertir plusieurs vues de segments vasculaires en images 2D. Ici, les résultats de la coloration immunofluorescente pour ER alpha sont montrés en vert et la contre-coloration avec DPI.

En bleu, dans un anneau d'artère piale isolé du cerveau d'un rat femelle, les images fusionnées suggèrent la présence d'un récepteur nucléaire des œstrogènes alpha. En combinant des images Zack, il est possible d'obtenir une image nette de l'immunofluorescence du récepteur ER alpha, en tenant compte de l'autofluorescence. Des contrôles négatifs d'autofluorescence doivent être réalisés pour les anticorps primaire et secondaire. Remarquez l'autofluorescence distincte le long du côté endothélial d'une artère qui n'a pas été incubée avec l'anticorps secondaire.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'isoler et de décoller les artères de la surface du cerveau, puis de préparer des anneaux transversaux de huit micromètres d'épaisseur. De plus, vous devriez être familiarisé avec l'utilisation du récepteur des œstrogènes alpha marqué par fluorescence, ainsi qu'avec la visualisation des récepteurs à l'aide d'un microscope immunofluorescent numérique et du logiciel Nikon NIS-Elements.