Name: Imagerie des récepteurs destrogènes α chez le rat artérioles Pial aide dun microscope numérique immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Apprenez à optimiser la détection immunofluorescente du récepteur aux œstrogènes α dans les artérioles piales de rat. Cette technique améliore la visualisation des récepteurs nucléaires pour les études en neurosciences vasculaires.

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Les travaux pour ce projet a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health R01-NR5339 et de la Uniformed Services University de la Santé de Sciences-R061LD.

1. L'isolement et la préparation des artères Pial <ol><li> Alors que le rat est anesthésié et insérez sécurisé d'un cathéter dans une artère et perfuser avec 1% de bleu Evans dans du PBS 1X. Vaisseaux Pial tache bien avec le bleu Evans rendant plus faciles à isoler. </li><li> Extrait du cerveau et de conserver à -70 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Idéalement, les cerveaux doivent être stockés plus de 2 mois. </li><li> En utilisant un microscope à dissection retirer artérioles piales (diamètre moyen de 35 à 50 um) de la surface du cerveau. Retirer avec précaution toutes les artérioles colorées en bleu à partir dorsale et latérale de la surface du cortex à l'aide à pointe fine pince. Retirez l'excès de tissu cortical adhérente avant de placer dans le fixateur. </li><li> Fixer les artérioles récoltés dans du paraformaldéhyde à froid à 2% dans 0,1 M PBS pendant 30 min. </li><li> Pour préparer les artérioles pour sectionner versez milieu d'inclusion sur le gel du disque / Chuck (fixé à -20 ° C). </li><li> Placez la section artériole à plat sur le mandrin uneND attendre qu'il gèle. Fermement placer le récipient en haut à droite sur le disque de gel cryostat sur l'intégration des médias avec le bout de l'artère en face de vous. Tenez avec des pincettes jusqu'à ce qu'il soit solidement gelé. </li><li> Placez le disque de congélation avec le navire dans la tête et couper cryostat 8 anneaux um artériole piales avec le cryostat. </li><li> Montez les sections artériole sur le chrome-potassium-gélatine diapositives subbed. </li><li> Stocker les lames préparées dans une boîte de glisser dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit. </li></ol> 2. ER-α en immunofluorescence Jour 1 <ol><li> Retirez les diapositives du réfrigérateur et amener chacun à température ambiante. </li><li> Pour laver les lames versez 1 à 1,5 ml de PBS 0,1 M (assez pour couvrir toutes les sections) laissez reposer pendant 10 minutes, égoutter et répéter la procédure à deux reprises. Chaque bord de la diapositive a un marqueur hydrophobe. Par conséquent, le liquide reste sur la surface de la lame. Avec chaque lavage, le liquide est verséet remplacé par du PBS frais 0,1 M. </li><li> Incuber les lames dans 1 ml de chlorure d'ammonium 50 mM pendant 30 min à température ambiante pour réduire la fluorescence endogène. </li><li> Laver les lames dans du PBS 0,1 M 3x10 min. telle que décrite au point 2.2 </li><li> Diapositives bloc de 0,1% de Triton X-100, plus 1% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS pendant 30 min. pour réduire la liaison non spécifique. </li><li> Incuber les échantillons avec l'anticorps primaire (polyclonal de lapin anti-ER-α; 1:500) dans du PBS + 0,1% de Triton-X + 1% de NGS nuit à 4 ° C. </li></ol> Jour 2 <ol start="7"><li> Retirez les diapositives du réfrigérateur et amener chacun à température ambiante. </li><li> Laver les lames dans du PBS 0,1 M 3x10 min. telle que décrite au point 2.2 </li><li> Incuber avec Oregon Green 488 secondaire anti-lapin de NGS 1% 0.1% de Triton-X100 + PBS pendant 2 heures dans le noir à température ambiante. A partir de cette étape, les prochaines étapes qui doit être fait dans l'obscurité. </li><li> Laver les lames dans du PBS 0,1 M 3x10 min. telle que décrite au point 2.2 </li><li> Sous un VECapuche ntilated, placez 1 goutte de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), plus les médias de montage sur les navires et ensuite placer une lamelle sur l'échantillon. </li><li> Appliquer à ongles vernis transparent pour sceller les bords de la lamelle. Ne pas déplacer les diapositives jusqu'à séchage complet, ce qui prend environ 24 heures. </li></ol> 3. Numérique imagerie par fluorescence <ol><li> Pour l'imagerie ER-α dans la cuve piales tranche, nous utilisons un Nikon Eclipse 80i numériques microscope à fluorescence avec des filtres pour 3 couleurs (bleu, vert et rouge) équipé d'une caméra numérique. </li><li> Insérer les diapositives préparées avec les segments tachés navire piales sous le microscope et à s'adapter à visualiser les zones marquées par fluorescence d'intérêt. Démarrer à un grossissement x100 x600, puis augmenter à un grossissement. </li><li> Utilisez l'appareil photo pour capturer des images dans DAPI (bleu) et FITC (vert) pour les chaînes de noyaux de cellules (DAPI) et ER-α (Oregon Green) en utilisant le logiciel Nikon étendue accent Profondeur de convertir de vue multipless de segments de navire dans images 2-D. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Nous avons localisé récepteurs d'estrogènes α dans les artères piales aide de sondes fluorescentes et optimisé notre visualisation des récepteurs numériques en utilisant la microscopie à fluorescence. Pour détecter la présence du récepteur, un lapin d'anticorps polyclonaux primaire et une verte l'Oregon 488 anticorps secondaire marqué a été utilisé pour l'image des récepteurs dans les artères piales isolé de la surface du cerveau. En outre, un colorant nucléaire (DAPI) a été utilisé pour identifier les noyaux des cellules et déterminer si nous avons pu détecter des récepteurs situés dans le noyau depuis ER-α a été signalé à être présents dans les cellules cyotosol et le noyau. En outre, nous avons mené des expériences de confirmation pour valider la spécificité de l'anticorps primaire et de vérifier la liaison de l'secondaires à l'anticorps primaire. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. La coloration par immunofluorescence pour ER-α (vert) et une contre-coloration au DAPI (bleu) dans un anneau artères piales isolées de cerveau de rat femelle. Figure 1A montre les images fusionnées suggérant la présence de certains oestrogènes récepteurs intranucléaires une. (Flèche) Fig 1B et 1C sont l'image focalisée sur ER-α qui est une combinaison d'images Z-stack. Les images ont été prises à un grossissement x600 et de l'anneau de coupe de la même navire dans des plans différents. Les flèches indiquent les récepteurs d'estrogènes α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. La coloration par immunofluorescence pour les groupes de contrôle dans un anneau de l'artère piales isolées de cerveau de rat femelle. Figure 2D montre le navire sans anticorps primaire. 2E figure montre le navire sans l'anticorps secondaire (autofluorescence noter distincts le long du côté endothélial). Les images ont été prises à un grossissement x600 et de l'anneau de coupe de la même navire dans différent des avions.

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</ol>

Les opinions exprimées sont celles des auteurs et ne reflètent pas la politique ou la position officielle de l&#39;Uniformed Services University Health Sciences de l&#39;, le ministère de la Défense ou le gouvernement des Etats-Unis.

Auparavant, nous avons montré que, après une lésion cérébrale transitoire globale ischémique de la capacité des artères piales de changer de diamètre en réponse aux deux vasodilatateurs 7, 8 et 9 vasoconstricteurs est nettement déprimée chez les jeunes rats ayant subi une ovariectomie. Réplétion oestrogène chronique restaure réponses vasomotrices 7-9. En outre, le remplacement d&#39;oestrogène retardé renverse les effets bénéfiques des œstrogènes sur l&#39;artère la capacité de vasodilatation piales 10 nous conduit à se demander si l&#39;épuisement oestrogènes à long terme affecte ER-α densité dans le cerebrovasculature. Nous avions prévu d&#39;utiliser l&#39;étiquetage immunofluorescence combiné avec Western blot pour évaluer les changements dans les ER-α expression en réponse à l&#39;épuisement des oestrogènes chronique. Parce que nous avons eu quelques difficultés dans la visualisation des groupes discrets de récepteurs, nous avons modifié la méthode que nous démontrons ici. Par conséquent, notre objectif principal dans cette étude était de développer d&#39;abord une méthode relativement simple pour optimiser le visuelsation des récepteurs dans les artérioles piales. En accord avec plusieurs rapports 6,11,12 nous avons jugé nécessaire de faire des ajustements pour le type de tissu nous sonder, l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon, la répartition des ER-α dans la cuve, ainsi que le degré de liaison non-spécifique . Notre méthode est très efficace de visualiser la présence de ER-α en tranches navire piales. Mais comme d&#39;autres l&#39;ont déjà souligné la bonne utilisation de ces méthodes est très dépendante de la spécificité et des concentrations de l&#39;anticorps, la localisation subcellulaire des protéines d&#39;intérêt, la fixation et le blocage des protocoles et 12 manipulation des tissus. Avant de visualisation de nos préparatifs, nous avons passé des navires de temps pour travailler sur toutes ces variables. Nous avons souligné combien nous avions besoin d&#39;ajuster certains de notre approche dans ce document. Nous avons cherché à visualiser de manière optimale ER-α dans les artérioles piales et cela a présenté un certain nombre de défis.Tout d&#39;abord, la taille moyenne d&#39;une artère de rat piales est entre 35-50 um faisant l&#39;isolement et le retrait de la surface du cerveau assez délicat. Nous avons constaté que la perfusion avec bleu Evans avant le sacrifice fait la dissection des artères plus facile. Bleu Evans peut affecter la fluorescence, mais nous pensons que l&#39;avantage d&#39;utiliser ce colorant l&#39;emportent sur ses inconvénients mineurs. Dans notre protocole, les navires sont lavées plusieurs fois. Cela minimise le colorant résiduel dans les vaisseaux et réduit les effets possibles de la teinture sur la fluorescence. Une autre difficulté rencontrée est que l&#39;épaisseur de la pie-mère fait les segments de flotte visualisation claire des récepteurs difficile. De plus, nous n&#39;avons pas pu obtenir des images particulièrement claires probablement dû au fait que les ER-α a été dispersée à travers plusieurs couches de cellules. Nous avons essayé de travailler avec des tranches de navires longitudinales (comme d&#39;autres l&#39;ont), mais en raison de la petite taille piales il était difficile de gérer les navires et éviter la torsion des vaisseaux pendant le montagesur des lames, même à l&#39;aide d&#39;un microscope. Enfin, nous avons réussi modifié notre technique en utilisant un cryostat et la découpe du navire de la Croix-sage dans les anneaux à 8 um d&#39;épaisseur. Les anneaux sont plus faciles à manipuler et à plusieurs peut être monté sur une glissière. Une fois que nous avons acquis les bateaux nous avons jugé nécessaire de tester l&#39;efficacité du premier flash geler le tissu, puis fixer les vaisseaux comme suggéré par Danseshatalb et associés 11. Bien que nous avons trouvé immunofluorescence de fond un peu moins, nous avons également noté que les récepteurs tachés moins intensément rendant la visualisation des récepteurs plus difficile. Par conséquent, nous préférons d&#39;abord de geler l&#39;ensemble du cerveau et de stocker jusqu&#39;à ce que nécessaire (généralement entre 1-2 mois). Nous avons ensuite retirer les vaisseaux tels que décrits et fixer les bateaux avant le tranchage avec le cryostat. comme nous le démontrons ici. Une étape nécessaire consiste à exécuter des contrôles à la fois avec le primaire et l&#39;anticorps secondaire séparémentpour déterminer la spécificité et l&#39;immunofluorescence fond. Récepteurs aux œstrogènes α-anticorps peut être difficile de travailler avec. En fait, nous avons essayé trois différents anticorps primaires (1 et 2 monoclonal polyclonaux) avant que nous soyons satisfaits de la réussite de notre coloration récepteur. Dans le cadre de nos contrôles nous avons d&#39;abord vérifié la spécificité de l&#39;anticorps primaire par omission de l&#39;ajout de l&#39;anticorps primaire. Figure 2D montre le navire sans anticorps primaire. Il n&#39;ya pas de coloration et juste un signal de fond peu. Depuis l&#39;anticorps primaire est polyclonale, il ya une certaine coloration fond diffus non spécifique. Deuxièmement, nous avons ajouté l&#39;anticorps primaire, mais pas l&#39;anticorps secondaire (Fig. 2E). On peut voir une belle marge représentant la autofluoresence le long des frontières endothéliales des vaisseaux. Ceci est cohérent avec le travail de Dan et associés 5. Toutefois, ni les petits points de l&#39;immunofluorescence qui représentent ER-α, ni la ref aspect granuleuxlecting la présence de nombreux récepteurs peuvent être détectées sans la combinaison de deux anticorps primaires et secondaires. Nous avons noté une tendance distincte des autofluoresence le long des marges endothéliales des vaisseaux. Ces tests indépendants pour la spécificité des anticorps sont importants car ils confirment la spécificité de l&#39;anticorps pour ER-α et l&#39;anticorps secondaire se lie à la primaire. En conclusion, comme l&#39;a démontré par d&#39;autres 4, 5 vaisseaux sanguins du cerveau contiennent de nombreux ER-α sous-type de récepteurs. Dans nos mains, la préparation de la Croix-8μm tranches transversales du isolées artères piales améliore la coloration et la visualisation des récepteurs. Les méthodes traditionnelles utilisent la microscopie confocale pour examiner les échantillons. Ayant la capacité de visualiser des sections optiques de série à partir de spécimens d&#39;épaisseur est un avantage important de la microscopie confocale. Toutefois, l&#39;achat d&#39;un microscope confocal à bonne peut être très coûteux. En utilisant Extended Depth (FED) de logiciels, nous avons constaté quepourraient réduire nos coûts d&#39;équipement. En utilisant un microscope à fluorescence avec EDF, nous avons obtenu des images claires et sont capables de visualiser piales artérielle ER-α sur plusieurs niveaux en utilisant Z-piles. Un avantage significatif du logiciel d&#39;EDF est qu&#39;il permet la capture d&#39;image de manière à créer efficacement une image 3-D à partir des images. Pour les laboratoires qui n&#39;ont pas accès à un microscope confocal ou les fonds pour acheter un microscope numérique fluorescent avec le logiciel approprié peut être une option pratique et moins coûteux en fonction des objectifs de l&#39;enquêteur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Bleu Evans </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek octobre Compound </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Le chlorure d&#39;ammonium </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> Anticorps de lapin polyclonal ER-α </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon Green 488 chèvres de lapin anti-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> O-11038 </td></tr><tr><td> Vectashield de montagemoyenne pour fluorescence avec DAPI </td><td> Vecteur Lab </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imagerie des récepteurs d&#39;estrogènes α chez le rat artérioles pial aide d&#39;un microscope numérique immunofluorescence

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Beaucoup d&#39;effets de l&#39;oestrogène sur la réactivité vasculaire sont médiés par l&#39;interaction avec une récepteurs d&#39;oestrogène, 2, 3. Bien que deux sous-types existent (récepteurs des œstrogènes α-β et l&#39;), récepteurs d&#39;estrogènes α a été identifié dans les muscles lisses et des cellules endothéliales de la pie-mère segments artériels utilisant une coloration fluorescente combinée avec la microscopie confocale à balayage laser 4. Par ailleurs, ER-α est située dans les noyaux et dans le cytoplasme des artères basilaires de rat 5. Les récepteurs sont abondantes et fluorescentes vives, mais la visualisation claire des groupes discrets de récepteurs est difficile sans doute à cause du nombre de couches de cellules situées dans de nombreux segments de vaisseaux piales. De plus, de nombreux rapports en utilisant des techniques d&#39;immunohistochimie couplé à la microscopie confocale mal en détail les exigences essentielles pour la reproduction des expériences 6. Notre objectif pour cet article est de décrire une technique simple pour optimiser tIl coloration et la visualisation des ER-α en utilisant transversale des tranches de artérioles piales obtenir de cerveaux de rats femelles. Nous avons d&#39;abord perfuser rats avec bleu Evans pour identifier facilement les artères piales de surface dont nous isolons dans un microscope à dissection. L&#39;utilisation d&#39;un cryostat à la tranche de 8 um sections des artères nous permet d&#39;obtenir des coupes fines cuve pour que les avions des navires différents sont plus clairement visibles. Coupe à travers le navire plutôt que l&#39;utilisation d&#39;un segment de vaisseau petite a l&#39;avantage de faciliter la visualisation des couches endothéliales et musculaires lisses. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un microscope numérique immunofluorescence avec le logiciel de profondeur prolongée produit des images claires de dix à douze avions navire différente et est moins coûteuse que l&#39;utilisation d&#39;un microscope confocal à balayage laser.

Le but de cet article est de démontrer une méthode pour optimiser la détection par immunofluorescence des récepteurs d&#39;estrogènes α (ERa) chez le rat piales tranches artérielle en utilisant un microscope numérique immunofluorescence.

Imagerie des récepteurs d&#39;estrogènes α chez le rat artérioles Pial aide d&#39;un microscope numérique immunofluorescence

De nombreux effets des œstrogènes sur la réactivité vasculaire sont médiés par l'interaction avec les récepteurs aux œstrogènes 1, 2, 3. Bien que deux sous-types existent (œstrogène...

L'objectif général de cette procédure est de décrire une technique simple permettant d'optimiser la coloration et la visualisation du récepteur des œstrogènes alpha à l'aide de sections transversales de vaisseaux peel prélevés sur des cerveaux de rats femelles. Cette méthode consiste tout d'abord à extraire les vaisseaux peel colorés au bleu d’Evan depuis la surface du cerveau, puis à les découper en anneaux de huit microns à l’aide d’un cryostat après sectionnement. Les coupes transversales sont montées sur des lames et incubées avec l’anticorps primaire dirigé contre le récepteur des œstrogènes alpha.Ensuite, les sections sont incubées avec l'anticorps secondaire et une contre-coloration en utilisant un milieu de montage contenant dpi. Enfin, les segments de vaisseaux pelliculés marqués par fluorescence sont observés et convertis en images 2D à l'aide d'un logiciel de mise au point sur profondeur étendue. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant le récepteur des œstrogènes alpha des artérioles pelliculées, grâce à l'utilisation d'un microscope immunofluorescent Nikon associé à un logiciel de profondeur de mise au point étendue.Je m'appelle le Dr Marguerite Littleton Kearney. Aujourd'hui, le Dr Neil Far ani, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, va démontrer une procédure simple afin d'optimiser la visualisation et la coloration du récepteur des œstrogènes alpha. In peel.Artères thoraciques d'un cerveau de rat qui a été perfusé avec un colorant bleu d'Évans et stocké à moins 70 degrés Celsius. À l'aide d'un microscope stéréoscopique, identifier les artères péliculaires à la surface du cerveau et les retirer à l'aide de pinces fines. Enlever soigneusement tout tissu cérébral adhérent.Placer les artères dans un petit tube à essai sur de la glace. Fixer les artères dans du formaldéhyde glacé à 2 % dans 0,1 mole de PBS pendant 30 minutes. Pour préparer les artères au sectionnement, verser le milieu d'incorporation sur un disque de congélation réglé à moins 20 degrés Celsius.Placer un fragment d'artère à plat sur le chug et attendre qu'il gèle. Une fois qu'il est solidement congelé, positionner l'artère verticalement dans le milieu d'inclusion sur le plateau de congélation du cryostat. Veiller à ce que l'extrémité de l'artère soit orientée vers l'avant.Tenez l'artère avec une pince jusqu'à ce qu'elle soit solidement congelée. Placez le disque de congélation avec l'artère dans la tête du cryostat, puis découpez des anneaux artériels de huit micromètres directement sur une lame. Montez les sections artérielles sur une gélatine au chromate de potassium.Déplacez délicatement les lames à l’aide de deux pinceaux afin d’aligner les anneaux artériels. Conservez les lames préparées dans une boîte à lames au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant toute la nuit. Retirez les lames du réfrigérateur et laissez-les atteindre la température ambiante sur la paillasse.Lavez les lames avec un à 1,5 millilitre de PBS 0,1 molaire. Après 10 minutes, éliminez le PBS et répétez l'opération deux fois supplémentaires. Après le dernier lavage au PBS, incubez les lames dans un millilitre de chlorure d'ammonium 50 millimolaire pendant 30 minutes à température ambiante afin de réduire la fluorescence endogène. Lavez ensuite les lames au PBS 0,1 molaire trois fois, 10 minutes par lavage, comme décrit précédemment. Ensuite, bloquez les lames dans une solution de PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 et 1 % de sérum de chèvre normal pendant 30 minutes pour réduire la liaison non spécifique de l'anticorps primaire.Après la saturation, incuber les lames avec l'anticorps primaire dirigé contre ER alpha, dilué à une concentration de 1/500 dans la solution de blocage, toute la nuit à quatre degrés Celsius. Retirer les lames du réfrigérateur et les ramener à température ambiante. Éliminer tout anticorps primaire non fixé par lavage avec 1 à 1,5 millilitre de PBS 0,1 % effectué 3 fois pendant 10 minutes.À chaque fois, incuber les lames avec le second anticorps anti-lapin conjugué à Oregon Green 488 dans la solution de blocage pendant deux heures, à l’abri de la lumière et à température ambiante. Après l’incubation, laver les lames trois fois dans du PBS 0,1 M, avec 10 minutes par lavage, puis les placer sous une hotte ventilée. Déposer une goutte de milieu de montage contenant du DAPI sur les échantillons, puis poser une lamelle par-dessus. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis incolore et laisser sécher complètement.Insérez les lames préparées contenant les segments de vaisseaux de pelure colorés sous le microscope et effectuez les réglages nécessaires pour visualiser les zones d'intérêt marquées par fluorescence. La visualisation de l'ER alpha coloré constitue l'étape la plus délicate de cette procédure. Repérez le plan du vaisseau coupé présentant les récepteurs les plus nets.Commencez avec un grossissement de 100 fois, puis augmentez le grossissement jusqu'à 600 fois. Utilisez la caméra pour capturer des images dans les canaux DPI et ZI respectivement pour les noyaux cellulaires et DR alpha, puis utilisez un logiciel pour convertir plusieurs vues de segments vasculaires en images 2D. Ici, les résultats de la coloration immunofluorescente pour ER alpha sont montrés en vert et la contre-coloration avec DPI.En bleu, dans un anneau d'artère peel isolé du cerveau d'un rat femelle, les images fusionnées suggèrent la présence d'un récepteur nucléaire des œstrogènes alpha. En combinant des images Zack, il est possible d'obtenir une image nette de l'immunofluorescence du récepteur ER alpha, tout en tenant compte de contrôles négatifs d'autofluorescence. Des contrôles négatifs doivent être réalisés pour les anticorps primaire et secondaire. Remarquez l'autofluorescence distincte le long du côté endothélial d'une artère qui n'a pas été incubée avec l'anticorps secondaire.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'isoler et de décoller les artères de la surface du cerveau, puis de préparer des anneaux transversaux de huit microns. De plus, vous devriez savoir comment détecter le récepteur des œstrogènes alpha marqué au fluorochrome et visualiser les récepteurs à l'aide d'un microscope immunofluorescent numérique et du logiciel Nikon Extended.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Cet article décrit un modèle simple pour stimuler l'angiogenèse dans le mésentère de rat. Le modèle produit des augmentations spectaculaires de la germination capillaire, la zone vasculaire et la densité vasculaire au cours d'une évolution dans le temps relativement court dans un tissu qui permet la visualisation en face de l'ensemble des réseaux microvasculaires vers le niveau de la cellule unique.

Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse

La fonction des cellules vasculaires dépend de l’activité des messagers intracellulaires.  Il s’agit d’une méthode d’imagerie ex vivo à deux photons qui permet de mesurer les niveaux intracellulaires de calcium et d’oxyde nitrique en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques dans les cellules endothéliales et musculaires lisses individuelles d’une aorte isolée.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Nous présentons ici un protocole pour décrire la localisation des récepteurs de l’angiotensine II de type 1 dans le cerveau du rat par autoradiographie quantitative, densitométrique et in vitro des récepteurs à l’aide d’un analogue de l’angiotensine II marqué à l’iode-125.

Receptor Protocole autoradiographie pour la visualisation Localisée de l&#39;angiotensine II Receptors

Nous présentons ici un protocole de cellules d'image exprimant vert fluorescent type récepteurs de l'angiotensine 1a protéine marqués pendant endocytose initiés par le traitement de l'angiotensine II. Cette technique comprend les lysosomes d'étiquetage avec un second marqueur fluorescent, puis en utilisant un logiciel pour analyser la co-localisation du récepteur et lysosome en trois dimensions au fil du temps.

En direct d&#39;imagerie cellulaire et l&#39;analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale

Nous montrons trois techniques de préparation de tissus différents pour la visualisation d’immunohistochemical des péricytes microvasculaire rétine de rat, c'est-à-dire, cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique isolement du réseau vasculaire.

Rétiniennes Cryo-sections, ensemble-montages et préparations hypotonique vaisseaux isolés pour la visualisation d’Immunohistochemical des péricytes microvasculaire

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire

Ici, nous présentons un protocole pour la coloration d'immunofluorescence pour observer les cellules endothéliales de l'aorte de souris directement. Cette technique est utile lors de l'étude du phénotype cellulaire et moléculaire des cellules endothéliales dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose.

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Le protocole présente un modèle murine TNBS-induit complet de Crohn' la maladie de s et des méthodes pour visualiser des récepteurs d’oestrogène par immunohistochemistry utilisant l’immunofluorescence des sections formelles-fixes de colon incorporées dans la paraffine.

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Entretien et nettoyage du microscope

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Imagerie des récepteurs d'estrogènes α chez le rat artérioles Pial aide d'un microscope numérique immunofluorescence

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