Injection sous-rétinienne de vecteurs viraux dans l’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle murin

Commencez avec une souris anesthésiée et appliquez un agent dilatateur des pupilles.

Au microscope, ouvrez la paupière et faites légèrement saillir l’œil pour exposer le site d’injection.

Appliquez une goutte de solution viscoélastique ophtalmique, puis placez une lamelle pour visualiser la rétine.

À l’aide d’une aiguille fine, créez un trou derrière la jonction cornée-sclérotique, en évitant d’endommager les vaisseaux sanguins et le cristallin.

À travers ce trou pré-perforé, insérez une seringue émoussée tangentiellement dans l’espace sous-rétinien près de l’épithélium pigmentaire rétinien ou EPR, qui soutient les neurones rétiniens.

Injecter le vecteur lentiviral porteur des gènes cibles dans l’espace sous-rétinien.

Observez la formation d’une bulle sous-rétinienne due à l’accumulation de liquide, confirmant la réussite de l’administration du vecteur.

Fermez doucement la paupière pour couvrir le site d’injection et permettre à la souris de récupérer.

Le lentivirus pénètre dans l’EPR par endocytose, libère son matériel génétique et le convertit en l’ADN correspondant, qui s’intègre au génome de l’hôte, permettant l’expression des gènes.

Tout d’abord, préparez une seringue d’un microlitre avec une aiguille émoussée de calibre 33. Stérilisez-le à l’aide d’oxyde d’éthylène. Ensuite, préparez une dilution des vecteurs viraux dans le PBS dans un tube de micro-fuge à environ 1 million d’unités de titre par microlitre. Maintenant, lorsque vous chargez la seringue, rincez-la plusieurs fois avec la solution pour éliminer tout espace mort dans la seringue. Obtenez 1,5 à 2 microlitres prêts à injecter.

Avec l’injection de vecteur viral préparée, anesthésez une souris adulte avec une injection intrapéritonéale de tilétamine, de zolazépam et de xylazine. Confirmer que l’animal a été anesthésié par l’absence de réflexes. Une fois l’anesthésie confirmée, dilater ses pupilles avec une goutte de 0,5 % de phényléphrine et de 0,5 % de tropicamide. Maintenant, sous un microscope opératoire, ouvrez la paupière et faites saillir l’œil pour exposer l’équateur. Maintenez l’œil dans cette position en plaçant vos doigts à l’extérieur du bord orbital.

Ensuite, appliquez une solution viscoélastique ophtalmique sur la surface de la cornée et placez une petite lame de couverture ronde sur la cornée. Ainsi, la rétine peut être visualisée. Maintenant, légèrement en arrière du limbe, et en dessous dans l’œil droit, ou en haut dans l’œil gauche, utilisez une demi-aiguille stérile de calibre 30 pour faire un petit trou. Les trous placés temporairement ou par voie nasale ne sont pas de bons choix car ils sont difficiles à couvrir.

Lors de la perforation, ne frappez pas le vaisseau limbique ou le cristallin, et n’insérez pas tout le biseau de l’aiguille.

Pour les injections sous-rétiniennes, insérez l’aiguille d’injection du vecteur à travers le trou à un angle de 45 degrés par rapport au plan de l’iris. Poussez l’aiguille vers l’arrière vers la zone péripapillaire, en suivant le chemin balisé pour traverser la cavité vitréenne. Approchez l’aiguille dans l’espace sous-rétinien jusqu’à ce qu’une légère résistance se fasse sentir, ce qui indique que la couche d’EPR a été atteinte.

Ne pénétrez pas dans le tissu scléral avec une pression excessive car l’aiguille doit être placée dans l’espace sous-rétinien potentiel. Si l’aiguille perfore le tissu crânien avec une puissance excessive, elle pénètre dans l’espace orbitaire extraoculaire sans résistance.

Maintenant, injectez doucement le vecteur viral dans l’espace sous-rétinien. Gardez l’aiguille très immobile pour éviter d’endommager les tissus, ce qui est d’une importance vitale. Ensuite, retirez l’aiguille tout aussi doucement. Maintenant, le globe oculaire peut être libéré. Une bulle sous-rétinienne indiquant une accumulation de vecteur devrait être visible. Enfin, fermez doucement la paupière pour couvrir le site d’injection. L’auto-scellement du trou se produira.