Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:04 min • August 20th, 2025
La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) permet d’étudier l’auto-assemblage des peptides en structures supramoléculaires maintenues ensemble par des interactions non covalentes.
Commencez par prélever un échantillon de protéines non assemblé - une suspension de peptides amyloïdes ayant la capacité de former une structure supramoléculaire riche en feuillets bêta. Placez l’échantillon dans un instrument FTIR équipé d’un cristal ATR.
Dirigez un faisceau infrarouge à un angle critique sur le cristal ; le faisceau le traverse et frappe l’interface entre le cristal et l’échantillon. Les cristaux ayant un indice de réfraction plus élevé que l’échantillon provoquent une réflexion interne du faisceau.
Une petite fraction du faisceau s’étend dans l’échantillon sous la forme d’une onde évanescente - une onde stationnaire aux points de réflexion. L’interaction de cette onde avec l’échantillon provoque l’absorption de l’énergie de l’onde, conduisant à une atténuation du faisceau réfléchi, enregistrée par un détecteur.
En fonction de la structure du peptide, l’échantillon absorbe dans des régions spécifiques du spectre infrarouge. Le spectre d’absorption – obtenu par transformation de Fourier du signal – montre un large pic à un nombre d’onde spécifique, caractéristique de l’échantillon de protéine non assemblé.
Incuber l’échantillon, permettant l’auto-assemblage, pour former des fibres amyloïdes riches en feuilles bêta. Après l’incubation, notez le spectre d’absorption.
Un pic aigu à un numéro d’onde différent du pic large précédent indique une conversion en un assemblage de feuille bêta.
Pour préparer une solution à assembler soi-même, dissolvez 1 milligramme de poudre de peptide lyophilisé dans un mélange de 20 % d’acétonitrile et de 10 millimolaires d’HEPES dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, vortex la solution d’assemblage et laissez l’échantillon s’assembler à température ambiante.
Lorsque l’assemblage peptidique atteint sa maturité, séchez 8 à 10 microlitres de la solution d’assemblage sous forme de film mince sur le cristal de diamant à réflexion totale atténuée, et surveillez la disparition d’un grand et large pic d’eau de 1 640 à 1 630 centimètres inverses au fur et à mesure que le film sec se forme.
Acquérez des spectres d’arrière-plan et infrarouges de 1 500 à 1 800 centimètres inverses, en effectuant en moyenne 50 balayages avec une résolution de 2 centimètres inverses, en soustrayant les balayages d’arrière-plan avant chaque balayage d’échantillon.
La signature infrarouge pour l’assemblage de la feuille bêta doit être observée comme un pic net entre 1 625 et 1 635 centimètres inverses.