JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 2:39 min • June 17th, 2025
Prenez une lamelle avec des neurones primaires génétiquement modifiés dans une chambre d’imagerie remplie d’un tampon d’imagerie.
Ces cellules expriment un indicateur redox basé sur des protéines fluorescentes dans la matrice mitochondriale.
Placez la chambre sous un microscope à fluorescence, identifiez les cellules sous la lumière visible, puis passez à l’imagerie par fluorescence.
Appliquez deux longueurs d’onde d’excitation pour stimuler l’indicateur et mesurer l’émission de fluorescence.
Le rapport d’intensité de fluorescence à ces longueurs d’onde reflète l’état d’oxydation mitochondriale.
Introduire le NMDA pour activer les récepteurs NMDA cellulaires, provoquant un afflux de calcium intracellulaire.
L’augmentation déclenche l’absorption de calcium mitochondrial, induisant la production de ROS et
l’oxydation mitochondriale.
Le ROS oxyde l’indicateur, modifie sa fluorescence et augmente le rapport du signal.
Introduisez des agents oxydants pour oxyder complètement l’indicateur, maximisant ainsi le rapport de signal.
Retirez le tampon, puis introduisez des agents réducteurs pour réduire complètement le colorant, minimisant ainsi le rapport de signal.
Utilisez les rapports de signal maximum et minimum pour calibrer et quantifier l’oxydation mitochondriale induite par NMDA.
Pour l’imagerie en direct, réglez l’intervalle de temps sur 30 secondes et la durée sur 25 minutes. Ensuite, montez les cellules, placez la chambre sur le microscope et concentrez les cellules comme démontré précédemment. Passez en mode balayage et utilisez le canal 488 nanomètres dans la vue en direct pour faire la mise au point et localiser les cellules pour l’imagerie. Si vous le souhaitez, pour augmenter le nombre de cellules enregistrées par passage, utilisez la fonction multipoint pour imager deux à trois champs de vision par lamelle.
Démarrez l’acquisition en accéléré et enregistrez cinq images en tant qu’enregistrement de référence de deux minutes. Ajoutez 500 microlitres de solution NMDA trois fois dans la chambre pour atteindre la concentration finale de 30 micromolaires et enregistrez 20 images supplémentaires en réponse NMDA en 10 minutes. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution quatre fois DA dans la chambre et enregistrez six autres images. Aspirez le tampon de la chambre d’imagerie et remplacez-le par 1 millilitre de solution DTT. Après avoir enregistré 10 autres images, terminez l’enregistrement et sauvegardez la série d’images.