Spectroscopie Raman anti-Stokes cohérente pour visualiser les neurones myélinisés dans le tissu cérébral de souris

Prenez une tranche de cerveau de souris fixée chimiquement dans une plaque multipuits.

Le tissu contient des axones entourés de gaines de myéline riches en lipides. Les corps cellulaires contiennent des corps de Nissl composés d’un réticulum endoplasmique rugueux et de ribosomes.

Incuber dans une solution de perméabilisation contenant un colorant fluorescent Nissl. La solution perméabilise les membranes cellulaires, permettant au colorant de se lier à l’ARN ribosomique dans les corps de Nissl et de marquer les corps cellulaires.

Placez le tissu sous un microscope confocal avec un système d’imagerie cohérent anti-spectroscopie Raman de Stokes, ou CARS.

La pompe synchronisée directe et les faisceaux laser de Stokes sur le tissu, réglés pour exciter les liaisons moléculaires dans la gaine de myéline riche en lipides.

Introduire un faisceau laser de sonde pour interagir avec les liaisons excitées et produire un signal anti-Stokes spécifique à la myéline.

Un photodétecteur capte le signal pour générer une image spécifique à la myéline.

Utilisez l’imagerie confocale pour capturer les signaux des corps de Nissl marqués.

Superposez les images confocales et CARS pour visualiser l’architecture neuronale.

Après avoir préparé les tissus comme décrit dans le manuscrit, colorez des coupes flottantes pour Nissl et les milieux d’anticorps afin de visualiser les corps cellulaires. Ensuite, incubez les sections sur un agitateur de laboratoire standard pendant 30 minutes à température ambiante. Avant d’amener les échantillons au microscope, allumez et réchauffez le laser CARS pendant au moins une heure. Ensuite, alignez le laser CARS en chevauchant spatialement les faisceaux laser de la pompe et de Stokes, et ajustez le délai entre les deux faisceaux laser.

Kohler : l’optique du condenseur et le diaphragme du microscope pour l’imagerie CARS avancée. Ensuite, ajustez le périscope externe pour centrer les deux lasers qui se chevauchent dans l’espace sur les miroirs de la tête de balayage du microscope. Pour une meilleure détection avant des voitures non balayées, assurez-vous que le condenseur est kohlered.

Pour l’imagerie confocale d’immunofluorescence et l’imagerie CARS, équipez le laser CARS de détecteurs non débalayés avant et épi-CARS en incorporant un microscope confocal équipé de lasers visibles pour l’imagerie par fluorescence. Maintenant, placez les sections dans une boîte de culture avec un fond de lamelle et du PBS pour éviter de dessécher les tissus. Utilisez également un poids en verre pour maintenir le tissu près de la lamelle.

Utilisation de l’interface utilisateur graphique. Définissez les paramètres d’acquisition d’images pour l’imagerie confocale par fluorescence CARS et Nissl. Placez l’échantillon sur la platine du microscope. Concentrez l’échantillon et capturez les images.