Visualisation protéines et de complexes macromoléculaires par EM négatif Tache: de la préparation de grille pour l'acquisition d'images

L'objectif général de cette procédure est de visualiser des échantillons purifiés de protéines par microscopie électronique en coloration négative. Cela est réalisé en préparant tout d'abord les grilles de microscopie électronique qui supporteront l'échantillon. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer la solution de coloration négative.

Ensuite, l'échantillon est appliqué sur la grille de microscopie électronique et coloré par contraste négatif. Enfin, la grille de ME est insérée dans un microscope électronique, et des images sont enregistrées dans des conditions optiques appropriées. Les images classiques en champ clair et en ME sont à fort contraste et très détaillées, montrant des macromolécules individuelles dispersées sur un fond sans caractéristiques.

La microscopie électronique en coloration négative est une méthode simple permettant de visualiser votre protéine favorite. Elle peut être utilisée comme test de routine pour examiner votre protéine purifiée, que ce soit pour une analyse structurale ou d'autres essais biochimiques et biophysiques. Nous montrons ici comment préparer un échantillon en coloration négative pour la microscopie électronique.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile, car certaines étapes sont difficiles à apprendre à partir de descriptions textuelles et de figures. Commencez par utiliser une pipette en verre pour déposer une seule goutte de collodion à la surface de l'eau dans un grand bécher. Lorsque le collodion s'étend, il peut piéger la poussière présente à la surface de l'eau.

Retirez et remplacez une pellicule poussiéreuse de collodion plastique par une autre goutte. Ensuite, placez entre 50 et 100 grilles de microscopie électronique une par une sur la pellicule plastique flottante, côté brillant vers le bas. Sélectionnez des grilles de 400 mailles pour une coloration négative de routine et des grilles de 200 mailles.

Pour la collecte d'images en paire inclinée. Sélectionnez un morceau de papier à faible absorption, sans plis, légèrement plus grand que la surface des grilles. Placez le papier au-dessus des grilles et attendez jusqu'à ce que le papier soit complètement imbibé.

Le papier ne doit pas absorber l'eau trop rapidement. Nous utilisons du papier provenant d'un bloc-notes bon marché. Les grilles sont désormais placées entre le film plastique et le papier.

Utilisez une paire de pinces pour placer le papier dans une boîte de Pétri afin de le faire sécher lentement à l'air. Évitez les méthodes de séchage plus rapides, car elles peuvent provoquer des plis. La machine de dépôt de carbone utilisée dans notre laboratoire est une machine à carbone sous vide élevé Creston 2 0 8 C équipée d'une pompe turbo.

Équipé d'un moniteur de l'épaisseur de film Creston. Ce moniteur utilise un équilibre à quartz sensible aux dépôts de carbone. Toutefois, le protocole décrit ici ne nécessite pas cet appareil. Commencez par aiguiser et charger les tiges de carbone dans une machine de revêtement au carbone.

Enduisez ensuite une lame de verre avec de la graisse à vide, en laissant la moitié de la zone givrée non recouverte. Après le revêtement au carbone, les régions graissées de la lame servent à estimer l'épaisseur du dépôt de carbone. Placez le papier avec les grilles sur le plateau sous le dôme de la machine de dépôt au carbone. Positionnez la lame graissée.

Faites glisser à côté des grilles. Pompez la chambre à vide jusqu'à atteindre au moins 10 microns de mercure, sinon des étincelles généreront de nombreuses grandes particules sur la grille. Augmentez maintenant très lentement le courant.

La pointe effilée de la tige en carbone deviendra extrêmement lumineuse. Ne l’observez pas à l’œil nu lorsque le revêtement commence. La lame de verre changera de couleur et deviendra gris foncé à mesure que la couche de carbone s’épaissit. Coupez le courant lorsque l’épaisseur de carbone souhaitée est atteinte, en tenant compte de la transparence du globe en verre. Une fois que l’intensité foncée de la lame est calibrée en fonction de l’épaisseur de carbone, cette méthode est aussi précise que le moniteur d’épaisseur de film, plus coûteux.

Lorsque le processus est terminé, relâchez la chambre à vide et retirez les grilles revêtues pour une utilisation ultérieure. La fine couche de plastique n'affectera pas la qualité de l'image obtenue par coloration négative, mais peut être éliminée en trempant les grilles dans du chloroforme pendant plusieurs heures avant de poursuivre. Préparez une solution fraîche de formiate d'urane ou utilisez une solution qui a été conservée à l'abri de la lumière pendant moins de deux semaines.

Une bonne solution fraîche présente une couleur jaune, un pH d'environ quatre et s'écoule très proprement sans précipités. Commencez par utiliser un système disponible dans le commerce pour produire une lueur. Déchargez les grilles recouvertes de carbone.

Ensuite, placez deux gouttes de 20 microlitres d'eau distillée et deux gouttes de 25 microlitres de solution fraîche de formiate urinaire sur un morceau de perfil. À l'aide de pinces à force inversée anti-capillaires, tenez une grille préalablement soumise à un éclat lumineux, côté revêtement de carbone vers le haut. Il est essentiel que ces pinces n'aspiration pas le liquide des grilles.

Appliquez maintenant deux microlitres d'échantillon protéique sur la grille et attendez que les protéines soient absorbées par la grille. Ce processus prend généralement 30 secondes, mais les échantillons très dilués nécessitent davantage de temps, ce qui peut influencer les concentrations en tampon. Une fois terminé, éliminez l'échantillon protéique à l'aide de papier filtre.

Ensuite, lavez la grille deux fois en touchant brièvement sa surface avec une goutte d'eau et en l'essuyant soigneusement à sec en quelques secondes. Après que l'eau ait touché brièvement la grille, appliquez une goutte de colorant et essuyez rapidement à sec. En utilisant la même technique, laissez la grille en contact avec une seconde goutte de colorant pendant 20 secondes.

Enfin, laissez sécher à l'air libre la grille dans la hotte de laboratoire, ou mieux, sous vide avant la séance de microscopie électronique, vérifiez l'alignement du microscope électronique en chargeant un fichier d'alignement optimisé si disponible, ce qui devrait le ramener à un état proche de la perfection. Placez ensuite la grille de microscopie électronique sur un porte-objet standard à inclinaison simple. Ensuite, insérez le porte-objet dans le porte-objet du microscope.

Ensuite, attendez la fin du cycle de pompage et insérez le porte-échantillon dans la colonne. Recherchez maintenant une zone d'échantillon présentant une bonne coloration. Focalisez manuellement en utilisant la méthode du contraste minimal ou à l’aide d’une caméra CCD et calculez le quadruple en direct.

Votre spectre de puissance. Réglez ensuite la mise au point profonde selon les besoins, généralement à -1,5 micromètre. La concentration de la coloration pouvant varier selon les zones de la grille, recherchez les protéines présentant un contraste blanc.

Évitez les zones présentant une coloration irrégulière ou une coloration positive où le contraste des protéines devient noir. En utilisant l'approche décrite pour la fabrication des grilles et la visualisation d'échantillons colorés négativement, plusieurs protéines bien connues ont été imagées à des fins de démonstration.

Prenez note de leurs détails et de leur fort contraste. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des échantillons de macromolécules colorées négativement pour les observer au microscope électronique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre heures.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes comme la reconstruction 3D peuvent être réalisées afin de mieux comprendre les structures moléculaires.