Visualisation protéines et de complexes macromoléculaires par EM négatif Tache: de la préparation de grille pour l'acquisition d'images

L’objectif général de cette procédure est de visualiser des échantillons de protéines purifiées par microscopie électronique à coloration négative. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les grilles de microscopie électronique qui soutiendront l’échantillon. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer la solution de coloration négative.

Ensuite, l’échantillon est appliqué sur la grille de microscopie électronique et coloré négativement. Enfin, la grille EM est chargée dans un microscope électronique, et les images sont enregistrées dans des conditions optiques appropriées. Les images DEM conventionnelles en fond clair sont très contrastées et très détaillées, montrant une seule macromolécule dispersée sur un arrière-plan sans relief.

La microscopie électronique à coloration négative est une méthode simple pour visualiser votre protéine préférée. Il peut être utilisé comme test de routine pour examiner votre protéine purifiée, soit pour une analyse structurelle, soit pour d’autres tests biochimiques et biophysiques. Nous montrons ici comment préparer un échantillon coloré négativement pour la microscopie électronique.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile, car certaines étapes sont difficiles à apprendre à partir de descriptions textuelles et de figures. Commencez par utiliser une pipette en verre pour placer une seule goutte de collodion dans un grand bécher d’eau à la surface de l’eau. Au fur et à mesure que le collodion se propage, il peut capturer la poussière de la surface de l’eau.

Retirez et remplacez un film poussiéreux de plastique collodion par une autre goutte. Ensuite, placez entre 50 et 100 grilles EM une par une sur le film plastique flottant côté brillant vers le bas. Sélectionnez 400 grilles de mailles pour une coloration négative de routine et sélectionnez 200 grilles de mailles.

Pour collecter des images de paires d’inclinaisons. Choisissez un morceau de papier non froissé à absorption lente qui est légèrement plus grand que la surface des grilles. Placez le papier sur les grilles et attendez que le papier soit complètement mouillé.

Le papier ne doit pas absorber l’eau trop rapidement. Nous utilisons du papier provenant d’un bloc-notes bon marché. Les grilles sont maintenant prises en sandwich entre le film plastique et le papier.

À l’aide d’une paire de pinces, placez le papier dans une boîte de Pétri pour le sécher lentement à l’air libre. Évitez les méthodes de séchage plus rapides car elles peuvent entraîner des plis. La machine de revêtement carbone utilisée dans notre laboratoire est une Creston 2 0 8 C turbo carbone sous vide.

Équipé d’un moniteur d’épaisseur de film Creston. Le moniteur utilise une balance à quartz sensible aux dépôts de carbone. Cependant, le protocole décrit ici ne nécessite pas cet appareil Commencez par affûter et charger les tiges de carbone dans une machine de revêtement de carbone.

La couche suivante, une lame de verre avec de la graisse sous vide laissant la moitié de la zone givrée non revêtue Après le revêtement au carbone, les régions graissées de la diapositive sont utilisées pour estimer l’épaisseur de la couche de carbone. Placez le papier avec des grilles sur la scène sous la cloche de la machine de revêtement de carbone. Positionnez le verre graissé.

Faites glisser à côté des grilles. Pompez la chambre à vide jusqu’à au moins 10 microtours, sinon des étincelles généreront de nombreuses grosses particules dans la grille. Maintenant, augmentez le courant très lentement.

La pointe pointue de la tige de carbone deviendra extrêmement brillante. Ne l’observez pas à l’œil nu lorsque le revêtement commence, la diapositive de verre changera de couleur en gris foncé au fur et à mesure que la couche de carbone s’accumule, coupez le courant à l’épaisseur de carbone souhaitée et tenez compte de la transparence de la cloche. Lorsque vous portez ce jugement, une fois que l’obscurité de la diapositive est calibrée en fonction de l’épaisseur du carbone, cette méthode est aussi précise que le moniteur d’épaisseur de film plus coûteux.

Une fois le processus terminé, ventilez la chambre à vide et retirez les grilles revêtues pour une utilisation ultérieure. La fine couche de plastique n’affectera pas la qualité de l’image tachée négativement, mais peut être enlevée en trempant les grilles dans du chloroforme pendant plusieurs heures avant de continuer. Préparez une solution fraîche de formiate d’urin L ou utilisez une solution conservée à l’obscurité pendant moins de deux semaines.

Une bonne solution fraîche a une couleur jaune, un pH d’environ quatre et fonctionne très proprement sans précipités. Commencez par utiliser un système disponible dans le commerce pour briller. Déchargez les grilles recouvertes de carbone.

Ensuite, deux gouttes de 20 microlitres d’eau distillée et 2 gouttes de 25 microlitres de solution de formiate d’urinoir frais sur un morceau de perfil. À l’aide d’une pince anti-capillaire à force inversée, tenez une grille déchargée de lueur, côté carbone vers le haut. De manière critique, ces pinces ne siphonnent pas le liquide des grilles.

Appliquez maintenant deux microlitres d’échantillon de protéines sur la grille et attendez que les protéines soient absorbées dans la grille. Cela prend généralement 30 secondes, mais les échantillons très dilués nécessiteront plus de temps, ce qui peut avoir un impact sur les concentrations de tampon. Lorsque vous avez terminé, épongez l’échantillon de protéines à l’aide de papier filtre.

Ensuite, lavez la grille deux fois en touchant brièvement sa surface à une goutte d’eau et en la séchant en quelques secondes. Après que l’eau ait brièvement touché la grille jusqu’à une goutte de tache et séchez-la rapidement. En utilisant la même technique, laissez la grille être en contact avec une deuxième goutte de teinture pendant 20 secondes.

Enfin, faites sécher à l’air libre la grille sur la hotte du paillasse, ou de préférence sous vide avant la séance EM, vérifiez l’alignement du microscope EM en chargeant un fichier d’alignement parfait si disponible, devrait le remettre dans un état presque parfait. Chargez maintenant la grille EM sur un porte-échantillon standard à inclinaison unique. Ensuite, insérez le support dans la scène.

Attendez ensuite la fin du cycle de pompage et insérez le support dans la colonne. Commencez maintenant à chercher une zone d’échantillon avec une bonne teinture. Faites la mise au point manuellement à l’aide de la méthode de contraste minimum ou à l’aide d’une caméra CC, D et en calculant les quatre en direct.

Votre spectre de puissance. Réglez ensuite la mise au point profonde selon vos besoins, généralement à moins 1,5 micron. La concentration des taches peut varier sur la grille, alors recherchez des protéines avec un contraste blanc.

Évitez les zones avec des taches inégales ou des taches positives où le contraste protéique devient noir. Utilisation de l’approche décrite pour créer des grilles et visualiser des échantillons colorés négativement. Plusieurs protéines familières ont été imagées à des fins de démonstration.

Prenez note de leurs détails et de leur contraste net. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des échantillons de macromolécules colorées négativement pour l’observation au microscope électronique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures environ.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la reconstruction 3D peuvent être effectuées afin de mieux comprendre les structures moléculaires.