Imagerie de la dynamique calcique dans les cellules ciliées de la ligne latérale des larves de poisson-zèbre

Prenez une larve de poisson-zèbre transgénique paralysée montée dans une chambre de perfusion.

La larve exprime des indicateurs calciques localisés dans la membrane dans les cellules ciliées du neuromaste, un composant du système de la ligne latérale qui détecte le mouvement de l’eau.

Les cellules ciliées comprennent des faisceaux de cheveux apicaux et des régions présynaptiques basales, qui forment des synapses avec des neurones afférents pour transmettre des signaux.

Sous un microscope confocal, utilisez un faible grossissement pour positionner une pipette à jet de fluide près de la larve.

Augmentez le grossissement pour localiser un neuromaste, repositionnez la pipette près de celui-ci et passez à l’imagerie par

fluorescence.

Délivrer des impulsions fluides pour dévier les faisceaux de cheveux, ouvrant des canaux de mécanotransduction pour l’afflux de cations apicals, y compris les ions calcium.

Les indicateurs faiblement fluorescents se lient au calcium, provoquant une augmentation localisée de la fluorescence.

L’afflux de cations dépolarise la cellule, déclenchant l’entrée du calcium par des canaux voltage-dépendants au niveau de la présynapse basale, où il se lie aux indicateurs et augmente la fluorescence localement.

Visualisez la dynamique du calcium apical et basal en temps réel.

Dans cette procédure, remplissez 10 microlitres de tampon neuronal dans une aiguille à jet de fluide correctement cassée à l’aide d’une pointe de chargement de gel. Chargez la solution uniformément jusqu’à la pointe sans bulles. Insérez ensuite l’aiguille dans le porte-pipette fixé au micromanipulateur motorisé.

Placez la chambre de perfusion dans un adaptateur de chambre circulaire sur la platine du microscope. Déplacez la platine motorisée de manière à ce que la larve soit au centre du champ de vision. Par la suite, tournez l’adaptateur de chambre circulaire de sorte que l’axe A-P de la larve soit à peu près aligné avec la trajectoire de l’aiguille de jet de fluide.

À l’aide de la lumière transmise et du contraste interférentiel différentiel, faites la mise au point sur la larve et centrez-la sous l’objectif 10x. Augmentez ensuite l’objectif 10x. À l’aide du micromanipulateur motorisé, abaissez l’aiguille du jet de fluide au centre du champ de vision, de sorte qu’elle soit éclairée par la lumière transmise et qu’elle touche à peine le tampon neuronal.

Abaissez l’objectif 10x pour vous concentrer sur la larve afin de confirmer sa localisation. Concentrez l’objectif sur l’aiguille à jet de fluide. Déplacez l’aiguille à jet de fluide avec le micromanipulateur dans les axes x et y jusqu’à ce qu’elle soit positionnée parallèlement à la face dorsale de la larve.

Ensuite, concentrez-vous à nouveau sur la larve. Abaissez l’aiguille dans l’axe z et positionnez-la le long de la face dorsale du poisson, à 1 millimètre du corps. Déplacez avec précaution l’adaptateur de chambre circulaire pour vous assurer que l’aiguille du jet de fluide est alignée le long de la ligne médiane A-P de la larve.

Ensuite, passez à l’objectif d’eau 60x. Assurez-vous que l’objectif est immergé dans le tampon neuronal. Utilisez la mise au point fine pour localiser un neuromaste. Par la suite, déplacez la platine motorisée pour placer le neuromaste d’intérêt au centre du champ de vision.

Gardez la pointe de l’aiguille à jet de fluide le long de la face dorsale du poisson. Ne touchez pas la pointe de l’aiguille du jet de fluide à la larve ou à la surface de la chambre. Positionnez l’aiguille à jet de fluide avec le micromanipulateur de manière à ce qu’elle soit à 100 micromètres du bord extérieur du neuromaste.

Concentrez-vous ensuite jusqu’aux pointes des faisceaux de poils apicals. Le bas de l’aiguille du jet de fluide doit être au point dans ce plan. Réglez la pince de pression à grande vitesse du mode manuel au mode externe pour recevoir les données du logiciel d’imagerie. Mettez à zéro la pince de pression à grande vitesse en appuyant sur le bouton zéro et utilisez le bouton de point de consigne pour régler la pression de repos légèrement positive. Confirmez la sortie de repos de la pince de pression à grande vitesse à l’aide d’un manomètre PSI fixé à la sortie de l’étage avant.

Pour déterminer la pression nécessaire pour stimuler les faisceaux de cheveux, appliquez un stimulus de test avec une sortie de 0,125 et 0,25 volt pendant 200 à 500 millisecondes. Pour chaque stimulus de test, mesurez la distance de déviation des pointes des faisceaux de poils (les kinocils). Choisissez une pression qui déplace les faisceaux sur une distance d’environ 5 micromètres. Assurez-vous que les pointes du kinocilia restent nettes tout le temps.

Pour acquérir des images à plan unique, sélectionnez un stimulus à délivrer lors de l’acquisition de 80 images après l’image 30 pendant trois secondes. Pour mesurer les réponses calciques mécanosensibles, concentrez-vous sur la base des faisceaux de poils apicaux et commencez l’acquisition d’images. Pour mesurer les réponses calciques présynaptiques, concentrez-vous sur la base des cellules ciliées et commencez l’acquisition d’images.