Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 2:33 min • June 17th, 2025
Prenez une lamelle recouverte de polymère contenant une culture mixte neurone-astrocyte dans la chambre d’enregistrement.
Ces cellules transfectées expriment des protéines sensibles au calcium sur les membranes plasmiques et RE, fluorescentes lors de la liaison au calcium pour suivre la dynamique subcellulaire du calcium.
Ajoutez un fluide contenant des ions calcium et couvrez la chambre pour éviter l’évaporation.
Placez la chambre sous un microscope à fluorescence.
Les ions calcium se lient aux protéines sensibles au calcium. Lors de l’irradiation à la lumière bleue, les protéines sensibles au calcium sur la membrane externe du RE deviennent vertes fluorescentes. Utilisez cette fluorescence verte pour localiser les astrocytes.
Ensuite, irradiez avec de la lumière verte. Les protéines sensibles au calcium sur la membrane plasmique deviennent fluorescentes. Confirmez la présence d’une fluorescence rouge dans le même astrocyte présentant une fluorescence verte.
Enregistrez des images en accéléré des protéines sensibles au calcium sur la membrane plasmique, suivies des protéines sensibles au calcium sur la membrane externe du RE.
Analysez les images pour observer l’activité calcique spontanée spécifique au compartiment dans l’astrocyte sélectionné.
Montez la lamelle contenant les cellules transfectées avec Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f dans la chambre d’enregistrement du microscope. Ajoutez 400 microlitres de support d’imagerie et placez un couvercle sur le dessus de la chambre. Choisissez le jeu de filtres pour GCaMP6f et la source lumineuse. Localisez les astrocytes exprimant OER-GCaMP6f.
Ensuite, choisissez un ensemble de filtres et une source lumineuse pour RCaMP2. Et confirmez si Lck-RCaMP2 est exprimé dans les mêmes astrocytes. Enregistrez des images en accéléré de Lck-RCaMP2 à 2 hertz pendant deux minutes et enregistrez les données d’imagerie.
Après cela, remplacez le filtre par celui de GCaMP6f. Enregistrez des images en accéléré de l’OER-GCaMP6f à 2 hertz pendant deux minutes. Enregistrez ensuite les données d’imagerie.