Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l'induction de petites molécules

L’objectif général de l’expérience suivante est de dériver une descendance neuronale directement et exclusivement à partir de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes en utilisant l’induction de petites molécules. Ceci est réalisé en ajoutant de l’acide rettino aux cellules indifférenciées maintenues dans des conditions définies. Ensuite, le processus de différenciation se poursuit en détachant les cellules dans une culture en suspension où elles forment des amas cellulaires flottants appelés neuroblastes.

Si les neuroblastes sont autorisés à se fixer à une plaque de culture tissulaire dans un milieu de neurodifférenciation, ils développent des caractéristiques de neurones matures. En fin de compte, l’immunofluorescence et la déconvolution ou la microscopie confocale peuvent être utilisées pour montrer l’effet du traitement à l’acide rettino sur la morphologie et l’expression des marqueurs des cellules souches embryonnaires humaines traitées. Dans d’autres techniques, seule une petite fraction de cellules poursuit un phénotype neuronal, alors que notre méthode permet une induction efficace et bien contrôlée de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes exclusivement vers une lignée neuronale par simple apport de petites molécules.

Il y a quelques étapes à suivre lors de la réparation des solutions mères. Prenez soin de ralentir la décongélation du matrigel et de la laminine humaine de moins 80 degrés Celsius à quatre degrés Celsius, de stocker le support pendant la nuit, de le conserver à quatre degrés Celsius et de toujours le réchauffer à 37 degrés Celsius avant de l’utiliser. De plus, lors de la préparation de milieux ESL humains, certains des suppléments sont ajoutés juste avant qu’ils ne soient utilisés.

Il s’agit notamment de BFGF, d’acide ascorbique, d’insuline humaine active dans A et de transfert. Ensuite, préparez les solutions de travail du gel matra ou de la laminine humaine immédiatement avant le revêtement de la plaque. Incuber les plaques à 37 degrés SIU dans 5 % de dioxyde de carbone Après la préparation des plaques de culture tissulaire pré-enrobées de gélatine.

La gélatine peut être remplacée par la solution de travail du matrigel ou de la laminine. Enduisez ces assiettes en les laissant incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Commencez par laisser les colonies de cellules ES humaines se développer pendant cinq à sept jours, puis préparez-vous à se séparer.

Certains d’entre eux Colonies sélectionnées avec plus de 75 %Sous cellules ES humaines différenciées, elles sont généralement légèrement opaques avec des colonies à bords définis contenant des cellules empilées. Une indication du début de la différenciation semble généralement être des colonies blanches contenant principalement des cellules différenciées semblent généralement être claires. Ne choisissez pas de colonies blanches ou claires.

Tenez les plaques à la lumière et utilisez un marqueur pour délimiter les colonies légèrement opaques au bas des plaques le long des contours. Utilisez le bord d’une pointe de pipette P double stérile pour détacher la couche de fibroblastes environnante de la colonie de cellules ES humaines. Ensuite, retirez les cellules fibroblastiques environnantes et retirez également toutes les parties différenciées de la colonie.

Maintenant, aspirez l’ancien milieu contenant les cellules différenciées détachées. Ensuite, dans chaque puits, lavez une fois les cellules indifférenciées avec un milieu cellulaire humain dépourvu de BFGF, puis ajoutez trois millilitres de milieu ESL humain frais contenant B-F-G-F-B-F-G-F est ajouté au milieu frais immédiatement avant utilisation. Utilisez maintenant une pointe de pipette P double stérile pour couper les colonies en petits morceaux et les détacher de la plaque.

Tirez les morceaux de colonie détachés dans leur milieu dans un tube conique de 50 millilitres. Tirez-en un supplémentaire. Millilitre de média bien rincer.

Les cellules sont maintenant prêtes pour une différenciation plus poussée à l’aide de petites molécules. Commencez par réchauffer les assiettes fraîchement enrobées à 37 degrés Celsius. Aspirez la solution d’enrobage des plaques et ajoutez une aliquote de quatre millilitres de milieu contenant des morceaux de colonie dans chaque puits, puis transférez doucement les plaques dans un incubateur sans les secouer.

Ne dérangez pas les plaques pour qu’elles puissent semer. Après avoir semé pendant trois jours, faites un nouveau substrat contenant de l’acide omique. Retirez ensuite la plupart des anciens supports, en laissant juste assez de support pour que les cellules restent immergées.

Il ne faut jamais laisser les cellules se dessécher chacune. Eh bien, ajoutez quatre millilitres de milieu cellulaire humain frais ES avec BFGF et acide rettino. Remplacez le milieu tous les deux jours et laissez les colonies de cellules ES humaines traitées à l’acide rettino se développer.

Après sept ou huit jours, les cellules auront subi des changements morphologiques en grandes cellules différenciées. Ensuite, procédez à la réalisation d’une culture cellulaire en suspension pour qu’une culture en suspension commence par détacher les colonies ESL des cellules qui se sont spontanément différenciées et ont migré pour former une couche de fibroblastes. Utilisez la technique susmentionnée avec une pointe de pipette stérile, puis aspirez l’ancien support contenant des cellules fibroblastiques détachées flottantes.

Lavez les cellules une fois avec un média HESC et mettez-les en suspension dans trois millilitres de média HESC. Maintenant, à l’aide d’une pointe de pipette P double stérile. Coupez les colonies en petits morceaux et détachez-les de l’assiette.

Tirez le milieu avec les colonies détachées dans un seul tube conique de 50 millilitres. Rincez les puits avec un millilitre de média et ajoutez le rinçage à la piscine. Ensuite, aliquote quatre millilitres des cellules regroupées dans chaque puits d’une plaque à fixation ultra-basse à six puits pendant quatre à cinq jours, conservez la plaque dans un incubateur.

Pendant ce temps, des amas cellulaires flottants ou neuroblastes se formeront pour faire progresser le neuroblaste vers un phénotype neuronal plus mature. Tirez le support qui les contient dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 1 400 tr/min pendant cinq minutes.

Aspirez, pesez autant de vieux milieux que possible et ajoutez une quantité égale de milieux NSC frais contenant VEGF N NT three et BDNF. Mélangez les cellules dans une suspension par pipetage, puis aliquote quatre millilitres de la suspension par puits en six millilitres. Les plaques de culture tissulaire transfèrent les plaques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius.

Le neuroblaste se fixera aux plaques de culture pendant la nuit pour une culture 3D à Matrigel ou un stratifié humain à la suspension de neuroblastes. Et une matrice 3D polymérisera à 37 degrés Celsius. Remplacez le support tous les deux jours.

En l’espace de deux semaines, de vastes réseaux de cellules neuronales porteuses de neurites et de cellules pigmentées apparaîtront : l’acide rettino est rendu suffisant pour induire les cellules ES humaines maintenues dans le système de culture défini à passer d’une pluripotence exclusivement à un phénotype neuroépidermique. Lors de l’exposition de cellules humaines indifférenciées à l’acide rétinoïque, toutes les cellules de la colonie ont subi des changements morphologiques en grandes cellules différenciées qui ont cessé d’exprimer le marqueur de pluripotence associé OCT quatre. Les cellules ont également commencé à exprimer divers marqueurs associés au neuroectoderme tels que HNK un a, P deux et TRKC.

Ces grandes cellules différenciées ont continué à se multiplier et les colonies ont augmenté en taille spontanément, exprimant le marqueur neuronal précoce bêta trois tubuline. La deuxième carte de marqueurs neuronaux, plus mature, a commencé à apparaître dans les zones des colonies où les cellules s’étaient empilées. Coïncidence, avec l’apparition des cellules neuroectodermiques, le facteur de transcription neuronal spécifique NER un impliqué dans la différenciation neuronale dopaminergique et l’activation du gène tyrosine hydroxylase transloqué dans le noyau.

Après détachement, les cellules ES humaines traitées à l’acide rettino ont formé un neuroblaste dans une culture en suspension lors de l’élimination du FGF basique et après avoir permis au neuroblaste de se fixer à une plaque de culture tissulaire, de vastes réseaux de cellules neuronales porteuses de neurites et de cellules pigmentées, typiques du SNC, ont commencé à apparaître avec une augmentation drastique de l’efficacité et ont pu être cultivés sur trois mois. Ces cellules neuronales dérivées de cellules ES humaines ont exprimé la tubuline bêta trois par rapport à la différenciation spontanée de plusieurs lignées de cellules sans traitements à l’acide rettino et à la carte deux co-exprimée une fois maîtrisé. Cette technique peut être utilisée pour générer des progéniteurs neuronaux dans les cellules neuronales uniformément à partir de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes en environ quatre semaines si elle est effectuée correctement.

N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que s’assurer que les lignées cellulaires sont exemptes d’agents pathogènes et de mycoplasmes doivent toujours être prises avant d’effectuer cette procédure.