Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l'induction de petites molécules

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir directement et exclusivement des cellules neuronales à partir de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes en utilisant une induction par de petites molécules. Cela est réalisé en ajoutant de l'acide rétinoïque à des cellules non différenciées maintenues dans des conditions définies. Ensuite, le processus de différenciation est poursuivi en détachant les cellules dans une culture en suspension où elles forment des agrégats cellulaires flottants appelés neuroblastes.

Si l'on permet aux neuroblastes de s'attacher à une plaque de culture tissulaire dans un milieu de différenciation neuronal, ils développent des caractéristiques propres aux neurones matures. En fin de compte, l'immunofluorescence associée à la microscopie de déconvolution ou à la microscopie confocale peut être utilisée pour montrer l'effet du traitement par l'acide rétinoïque sur la morphologie et l'expression des marqueurs chez les cellules souches embryonnaires humaines traitées. Dans d'autres techniques, seule une faible fraction des cellules adopte un phénotype neuronal, tandis que notre méthode permet une induction efficace et bien contrôlée des cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes exclusivement vers une lignée neuronale, grâce à l'ajout simple de petites molécules.

Quelques étapes requièrent une attention particulière lors de la préparation des solutions mères. Veillez à décongeler lentement la matrigel et la laminine humaine en passant de moins 80 degrés Celsius à quatre degrés Celsius. Conservez les milieux à quatre degrés Celsius et réchauffez toujours les milieux à 37 degrés Celsius avant utilisation. En outre, lors de la préparation du milieu ESL humain, certains suppléments sont ajoutés juste avant l'utilisation.

Ces composants incluent le BFGF, l'acide ascorbique, l'insuline humaine active dans l'élément A et la transferrine. Ensuite, préparez immédiatement le gel matrigel ou les solutions travail de laminine humaine avant l'enduction des plaques. Incubez les plaques à 37 degrés SIUs dans 5 % de dioxyde de carbone après avoir préparé les plaques de culture tissulaire pré-enduites de gélatine.

La gélatine peut être remplacée par une solution de matrigel ou de laminine. Recouvrir ces plaques en les incubant toute la nuit à quatre degrés Celsius. Commencer par laisser les colonies de cellules souches embryonnaires humaines se développer pendant cinq à sept jours, puis préparer la division.

Choisissez certaines colonies présentant plus de 75 % de cellules souches humaines indifférenciées ; elles sont généralement légèrement opaques, avec des bords bien définis et contiennent des cellules empilées. Un signe du début de la différenciation apparaît généralement sous forme de colonies blanches, tandis que les colonies contenant majoritairement des cellules différenciées apparaissent généralement claires. N'effectuez pas de sélection sur les colonies blanches ou claires.

Tenez les plaques à la lumière et utilisez un marqueur pour délimiter les colonies légèrement opaques à l’arrière des plaques. Utilisez le bord d’une pipette stérile de type P2 pour détacher la couche de fibroblastes environnante de la colonie de cellules souches embryonnaires humaines. Ensuite, retirez les cellules fibroblastes environnantes ainsi que toutes les parties différenciées de la colonie.

Aspirez maintenant l'ancien milieu contenant les cellules différenciées détachées. Ensuite, lavez une fois les cellules indifférenciées dans chaque puits avec du milieu pour cellules souches embryonnaires humaines dépourvu de BFGF, puis ajoutez trois millilitres de milieu humain ESL frais contenant du B-F-G-F ; le B-F-G-F est ajouté au milieu frais immédiatement avant utilisation. Utilisez maintenant une pipette stérile P2 dont la pointe permet de découper les colonies en petits morceaux et de les détacher de la plaque.

Transférez les fragments de colonies détachées avec leur milieu dans un tube conique de 50 millilitres. Effectuez un rinçage supplémentaire avec un millilitre de milieu par puits.

Les cellules sont désormais prêtes pour une différenciation supplémentaire à l’aide de petites molécules. Commencez par réchauffer les plaques récemment revêtues à 37 degrés Celsius. Aspirez la solution de revêtement des plaques et ajoutez un aliquot de quatre millilitres de milieu contenant des fragments de colonies dans chaque puits, puis transférez délicatement les plaques dans un incubateur sans les agiter.

Ne pas perturber les plaques afin de permettre l'ensemencement. Après trois jours d'ensemencement, préparer un nouveau milieu contenant de l'acide oméga. Ensuite, retirer la majeure partie de l'ancien milieu, en laissant juste assez de milieu pour que les cellules restent immergées.

Les cellules ne doivent jamais être laissées sécher. Ajoutez quatre millilitres de milieu frais pour cellules souches embryonnaires humaines contenant du BFGF et de l'acide rétinoïque. Remplacez le milieu tous les deux jours et laissez les colonies de cellules souches embryonnaires humaines traitées à l'acide rétinoïque se développer.

Après sept ou huit jours, les cellules auront subi des changements morphologiques et se seront transformées en grandes cellules différenciées. Ensuite, procédez à la préparation d'une culture cellulaire en suspension : pour créer une culture en suspension, commencez par détacher les colonies ESL des cellules qui se sont différenciées spontanément et ont migré pour former une couche de fibroblastes. Utilisez la technique mentionnée ci-dessus avec une pointe de pipette stérile, puis aspirez le milieu ancien contenant les cellules de fibroblastes détachées en suspension.

Lavez les cellules une fois avec le milieu HESC et resuspendez-les dans trois millilitres de milieu HESC. À l’aide d’une pipette stérile P2, découpez les colonies en petits morceaux et détachez-les de la plaque.

Transférez le milieu contenant les colonies détachées dans un seul tube conique de 50 millilitres. Rincez les puits avec un millilitre de milieu et ajoutez le rinçage au milieu collectif. Ensuite, aliquotez quatre millilitres des cellules regroupées dans chaque puits d'une plaque à six puits à attachement ultra-faible pendant quatre à cinq jours, et maintenez la plaque dans un incubateur.

Pendant cette période, des agrégats cellulaires flottants ou des neuroblastes se formeront, favorisant l'évolution du neuroblaste vers un phénotype neuronal plus mature. Transférez le milieu les contenant dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 1 400 tr/min pendant cinq minutes.

Aspirez, pesez autant que possible de l'ancien milieu et ajoutez une quantité égale de milieu frais pour cellules souches neurales contenant le VEGF N NT trois et le BDNF. Homogénéisez les cellules en suspension par pipetage, puis répartissez quatre millilitres de la suspension par puits dans des plaques de culture cellulaire à six puits. Transférez les plaques dans un incubateur humide à 37 degrés Celsius.

Le neuroblaste adhérera aux plaques de culture pendant la nuit pour une culture en 3D sur Matrigel ou laminine humaine ajoutée à la suspension de neuroblastes. Et une matrice en 3D polymérisera à 37 degrés Celsius. Remplacez le milieu de culture tous les deux jours.

En deux semaines, d'importants réseaux de cellules neuronales portant des neurites et de cellules pigmentées apparaîtront. L'acide rétinoïque est suffisant pour induire chez les cellules ES humaines maintenues dans un système de culture défini une transition de la pluripotence vers un phénotype exclusivement neuro-épidermique. Lors de l'exposition de cellules ES humaines non différenciées à l'acide rétinoïque, toutes les cellules de la colonie subissent des changements morphologiques pour devenir de grandes cellules différenciées qui cessent d'exprimer le marqueur associé à la pluripotence OCT4. Ces cellules commencent également à exprimer divers marqueurs associés au neuroectoderme, tels que HNK-1a, P2 et TRKC.

Ces grandes cellules différenciées ont continué à se multiplier et les colonies ont augmenté de taille, exprimant spontanément le marqueur précoce neuronal bêta-tubuline trois. Le marqueur neuronal plus mature MAP2 a commencé à apparaître dans les zones des colonies où les cellules s’étaient accumulées. Concomitamment à l’apparition des cellules neuro-ectodermiques, le facteur de transcription spécifique aux neurones NER1, impliqué dans la différenciation neuronale dopaminergique et l’activation du gène de la tyrosine hydroxylase, s’est transloqué dans le noyau.

Après détachement, les cellules souches embryonnaires humaines traitées à l'acide rétinoïque ont formé des neuroblastes en culture en suspension suite à l'élimination du FGF basique, et après avoir permis aux neuroblastes de s'attacher à une plaque de culture, d'importants réseaux de cellules neuronales portant des neurites ainsi que des cellules pigmentées, typiques du SNC, ont commencé à apparaître avec une augmentation marquée de l'efficacité et ont pu être cultivés pendant plus de trois mois. Ces cellules neuronales dérivées de cellules souches embryonnaires humaines exprimaient la tubuline bêta trois par rapport à la différenciation spontanée multilignée de cellules non traitées à l'acide rétinoïque, et coexprimaient MAP2 une fois maîtrisées. Cette technique peut être utilisée pour générer de manière uniforme des progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes en environ quatre semaines, à condition qu'elle soit correctement réalisée.

N'oubliez pas que le travail avec des cellules humaines peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que la vérification de l'absence de pathogènes et de mycoplasmes dans les lignées cellulaires, doivent toujours être prises avant de réaliser cette procédure.