Name: Cartographie hétérogénéité dexpression des protéines dans les tumeurs par immunofluorescence quantitative (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Découvrez la cartographie de l'hétérogénéité des biomarqueurs dans les tissus tumoraux par immunofluorescence quantitative. Cette méthode permet d'évaluer finement les variations d'expression protéique et d'améliorer le développement de thérapies ciblées.

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Ce travail a été soutenu en partie par le Conseil écossais de financement (subvention Nombre HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), la recherche médicale en Ecosse ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), le cancer recherche expérimentale contre le cancer au Royaume-Uni Centre de médecine ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ) et Breakthrough Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Préparation des tissus <ol class="lalpha"><li> Microtomie <ol class="lroman"><li> Section de paraffine fixes au formol intégrés blocs tumeur à 4 micron d'épaisseur à l'aide d'un microtome rotatif. </li><li> Placer les sections sur des lames microscopiques chargées positivement. </li><li> Incuber les lames dans un four à 37 ° C la nuit. </li></ol></li><li> Stockage <ol><li> Sections Conserver dans un -18 ° C à -25 ° C congélateur, afin d'éviter la perte d'antigénicité. </li></ol></li></ol> 2. Immunofluorescence des coupes de tissus <ol class="lalpha"><li> Déparaffinage et réhydratation <ol class="lroman"><li> Déparaffinage diapositives dans le xylène à deux reprises pendant 5 min. </li><li> Réhydrater lames dans 99%, 99%, 80%, 50% d'éthanol et d'eau du robinet pendant 2 min de chaque dans l'ordre. </li></ol></li><li> Récupération d'antigène <ol class="lroman"><li> Effectuez la récupération d'antigène de la chaleur induite, en utilisant 0,15 mM citrate de sodium, pH 6,0 tampon dans un autocuiseur pendant 5 min dans le microwave. </li><li> Refroidir diapositives pendant 20 min. </li><li> Rincer les lames dans PBST 0,05% pendant 5 min sur la bascule. </li></ol></li><li> Blocage procédure <ol class="lroman"><li> Traiter sections en peroxyde d'hydrogène à 3% pendant 10 min. </li><li> Rincer les lames dans PBST 0,05% pendant 5 min sur la bascule. </li><li> Ajouter les sections à crémaillère Immunocoloration Sequenza. </li><li> Traiter des sections dans le bloc des protéines sériques gratuite pour 10 min. </li></ol></li><li> D'incubation des anticorps primaires <ol class="lroman"><li> Incuber anticorps primaire dilué à une dilution optimale dans le diluant d'anticorps Dako pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer à 0,05% PBST trois fois pendant 5 min chacune. </li></ol></li><li> Épithéliales masque (cytokératine) d'incubation <ol class="lroman"><li> Incuber de souris anti-cytokératine poêle, dilué à 1:50 dans le diluant d'anticorps Dako nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> Visualisation de masque épithéliales <ol class="lroman"><li> Préparer une dilution 1:25 de la chèvre anti-souris Alexa555 sd'anticorps dans le econdaires pré-dilué Envision de chèvre-lapin solution d'anticorps HRP. Incuber les lames dans l'obscurité pendant 1,5 heures à température ambiante. </li><li> Rincer à 0,05% PBST trois fois pour chaque 5min. </li></ol></li><li> Visualisation de la cible <ol class="lroman"><li> Transférer les diapositives de la Sequenza de la chambre de l'humidité. </li><li> Combinez le diluant d'amplification du signal cible (E baignoire HistoRx) et le tyramide Cy5 (tube F HistoRx) à 1:50 de concentration. Vortex pour bien mélanger. Incuber les lames dans l'obscurité pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Rincer à 0,05% PBST trois fois pendant 5 min chacune. </li><li> Déshydrater lames dans l'éthanol à 80% pendant 1 min. </li><li> Diapositives de l'air sec dans l'obscurité. </li></ol></li><li> Contre-coloration et de lamelles <ol class="lroman"><li> Appliquer moyennes DAPI montage sur les lamelles et les placer le couvre-fil des coupes de tissus. </li><li> Diapositives sécher toute la nuit dans l'obscurité. </li><li> Après les diapositives ont séché, sécurisé avec du vernis à ongles à la norme ENassurer la préservation à long terme et conserver au réfrigérateur à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Capture d'images à balayage section entière <ol class="lalpha"><li> Chargez jusqu'à cinq diapositives dans la cassette glisser du scanner Aperio ScanScope glisser FL. </li><li> Pour chaque diapositive, sélectionnez la région en général à l'image en utilisant l'interface de la console ScanScope. Sélectionnez la région pour englober tous les tissus sur la diapositive, indépendamment du motif de coloration ou d'autres aspects observables de l'échantillon. </li><li> Utilisation de la console ScanScope, pour chaque canal (DAPI, Cy3 et Cy5) déterminent une exposition optimale comme suit: <ol class="lroman"><li> Sélectionnez une région de tissu pour interroger - ce domaine devrait, idéalement, être dans la région de la tumeur des tissus pour fournir la meilleure représentation. </li><li> Utilisation de la fonction ScanScope exposition automatique de la console, d'évaluer le temps d'exposition suggéré pour chaque canal, avec netteté de l'image. </li><li> Répétez jusqu'à 3-5 sur les régions de chaque échantillon de confirm stabilité de la valeur. </li></ol></li><li> Sélectionnez une région supplémentaire (comme indiqué par un losange bleu sur l'image console ScanScope) loin du tissu, mais encore dans la région lamelle de la diapositive, de définir une zone de fond, où plane images de correction sur le terrain seront acquis pour chaque filtre. </li><li> Revoir ces images avant l'acquisition de l'image. Si les images semblent avoir de fond élevé ou d'autres artifices, la région de l'image doit être déplacé et les nouvelles images acquises. </li><li> Les images acquises diaporama numérique sont téléchargées automatiquement dans la base de données du spectre Aperio. </li></ol> 4. L'analyse d'image automatisée AQUA <ol class="lalpha"><li> Voir les images numériques diapositive entière dans la base de spectre et d'annoter les zones tumorales d'intérêt dans le contexte de l'ensemble du tissu et le modèle de coloration (s). </li><li> Sélectionnez la diapositive à analyser à l'aide de la liste AQUAnalysis diaporama numérique dans la base de données du spectre en double cliquant sur le poucel'image des ongles (alternativement, sélectionnez la case à cocher à côté de l'image, puis sélectionnez «Afficher les images" dans le menu en haut de la liste). Cela ouvre automatiquement le logiciel et la ImageScope image couleur fusionnées de l'échantillon de tissu. </li><li> Utilisez ce logiciel pour naviguer dans l'image en utilisant les outils fournis. </li><li> Utilisation de l'accompagnement H &amp; E (soit la diapositive physique ou une image annotée), annoter la région d'intérêt sur l'image fluorescente. Plusieurs régions d'intérêt, individuel zones encerclées, peuvent être sélectionnés sur un seul échantillon. Il ya aussi un "négatif" outil qui est utilisé pour exclure des zones au sein d'une région sélectionnée (c'est à dire des tissus endommagés, les zones de mauvaise histologie, non tumoral domaines, débris, etc.) </li><li> Enregistrer la couche d'annotation (s) sur l'image. </li><li> Retour au menu principal de Spectrum et sélectionnez la case à côté de l'image qui vient d'être commentée. Sélectionnez "Analyser" de la bande de menu en haut de la liste. </li><li> Dans la fenêtre d'analyse qui va arriver, select "HistoRx AQUA Analyse" dans le menu déroulant. </li><li> S'il ya de multiples couches d'annotations, utilisez les cases à cocher pour sélectionner la couche appropriée (s) pour analyse. </li><li> Appuyez sur le "Analyser" bouton lorsque vous êtes prêt à commencer. </li><li> À ce stade, une fenêtre de console minimisé apparaîtra dans la barre des tâches Windows. Cela permet d'afficher la progression du transfert d'images de la base de données du spectre à l'ordinateur local (le «pull» de fonctionnement). </li><li> Une fois les données transférées, AQUAnalysis va se lancer. L'utilisateur peut alors utiliser toutes les fonctions internes du logiciel pour visualiser, parcourir et analyser les images. </li><li> La région annotée de l'image de la base du spectre est divisé en carreaux de 512x512 pixels d'image - dont chacun sera marqué individuellement. </li><li> Pour cette étude, un algorithme non supervisé de cotation AQUA, basée sur le regroupement des données, a été utilisé 8. Dans cet algorithme, les scores sont générés AQUA comme suit: <ol class="lroman"><li> L'image pan-cytokératine SIgnal est seuillé dessus du fond et de ces pixels sont utilisés pour définir une tumeur «masque» qui est ensuite utilisé pour les calculs ultérieurs. L'expression de haute pan-cytokératine pixels définissent également les régions cytoplasmiques / non-nucléaires des cellules tumorales. </li><li> Pixels avec un signal élevé dans le canal DAPI qui sont dans le masque de la tumeur sont identifiés comme étant de nature nucléaire. </li><li> L'algorithme de clustering examine également les pixels qui ont de faible intensité soit pour coloration DAPI ou expression cytokératine et tente de les attribuer en partie à l'autre les compartiments nucléaires ou cytoplasmiques, ou de fond. </li><li> Une fois que tous les pixels sont attribués à l'un des compartiments tumoraux ou de fond, l'intensité du signal de la protéine cible (ER ou HER2) est alors calculé au sein de chacun des compartiments et normalisé à la taille des compartiments, produisant ainsi des scores AQUA. </li><li> Les images qui n'ont pas de représentation suffisante des tumeurs n'ont pas été marqués (tels que définis par ceux qui ont less de 5% de pixels représentant une tumeur). Ces régions produisent également la valeur d'une «Résultat final» appelé «Fail» et peut donc être retiré dans les prochains analyses statistiques. </li><li> De plus, si après examen, un opérateur identifié des domaines qui n'étaient pas adaptés pour la notation en raison de l'échantillon ou des artefacts d'imagerie (par exemple le tissu plié, débris), ces champs ont été expurgés de marquer et a produit un «résultat final» appelé «Fail». </li></ol></li><li> Les résultats de notation AQUA sont des tableaux de scores associés à chaque tuile pixel 512x512 dans la région d'intérêt dans un échantillon coupe de tissu ensemble. Ces fichiers, au format. CSV, peut ensuite être utilisé pour l'analyse statistique ultérieure. </li></ol> 5. Analyse statistique: Toutes les analyses statistiques sont réalisées dans SPSS (IBM) <ol><li> Lorsque c'est possible, pour les grandes opérations, de générer des fichiers SPSS code de syntaxe (. SPS) pour effectuer des manipulations de données et les étapes d'analyse. Un code de syntaxe exemple est fourni sous forme de fichiers supplémentaires. </li><li lire les fichiers de donn dans spss. retirer des variables inutilis brutes l par exemple pr scores d non utilis compartiments><li> Lorsque les régions ont un «résultat final» du «Fail» (voir ci-dessus), marquer ces valeurs comme SYSMIS, ce qui leur enlève de l'analyse numérique. </li><li> Toutes les données agrégées pour toutes les diapositives pour chaque marqueur (ER ou HER2) dans un seul ensemble de données de base en format SPSS. Utilisez ce fichier maître pour tous les calculs ultérieurs. </li><li> En utilisant un fichier de syntaxe SPSS (un pour chaque marqueur: ER ou HER2 (voir la syntaxe des fichiers complémentaires) de données a ensuite été validée et les indices de diversité de Simpson calculé comme suit: <ol class="lroman"><li> Générer un fichier maître d'analyse, afin d'empêcher la modification des données de base mis généré précédemment. </li><li> Valider les données de base opposer les données brutes et les images générées. </li><li> Produire des statistiques sommaires pour les scores AQUA pour chaque échantillon (nombre de champs, le score moyen, le score médian, minimuScore m, le score maximum, et l'écart-type des scores pour l'échantillon). </li><li> Vérifier un échantillon aléatoire de résultats contre les fichiers originaux premières données de sortie et contre les données d'image brutes marqué. </li></ol></li><li> Pour générer les images carte de la chaleur (figures 2 et 3): <ol class="lroman"><li> «Bin» les données pointage AQUA (en utilisant la fonction «Regroupement visuel" dans SPSS) en huit niveaux différents. Pour ER, les scores nucléaires ont été utilisées, pour HER2, les scores cytoplasmiques ont été utilisés. </li><li> Dériver des bacs de telle sorte que chaque bac représente un pourcentage égal de cas disponibles à partir du jeu de données complet. </li><li> Utilisez 'Split File »la fonction de SPSS afin que toutes les sorties suivantes seraient sur un niveau de« l'échantillon par diapositive /'. </li><li> Parcelle de chaque région (correspondant à une tuile 512x512) par ses coordonnées x, y et couleur avec une valeur correspondant à la poubelle dans laquelle il a été attribué (voir figures 2 et 3). </li></ol></li><li> Pour générer les scores hétérogénéité, le code a été écrit pour générer un SimpsonIndice de la diversité en utilisant des scores AQUA. <ol class="lroman"><li> Indice de Simpson de la diversité, comme utilisée ici, est définie comme: <img alt="Équation 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="L'équation 1"> Où N est le nombre total des scores / champs utilisés pour un échantillon donné et n est le nombre de scores / champs dans un groupe donné de résultats standardisés (telle que décrite ci-dessous). </li></ol></li><li> Utilisez le fichier maître d'analyse décrites ci-dessus pour la source de données. Dans les exemples illustrés, tous les calculs ER utilisé le score AQUA nucléaire et HER2 calculs utilisés le score AQUA cytoplasmique. Effectuer les calculs ci-dessous pour chaque échantillon / diapositives. </li><li> Comme les données de fluorescence est soumise à l'instabilité de variance, de sorte que l'ampleur erreur se propage avec une intensité, appliquer logarithmique (base 2) la normalisation de tous les scores AQUA. </li><li> En outre transformer les normalisé (transformation logarithmique) les données en z-(standard) scores. <ol class="lroman"><li> La transformation du Z-score est calculé unes: Z = (score AQUA - moyenne de tous les scores d'un échantillon) / écart-type des scores pour l'échantillon. Cela se traduit par la distribution des scores dans une distribution des écarts autour de la valeur centrale de l'écart zéro. </li></ol></li><li> Bin ces valeurs Z-score en six groupes (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2,&gt; 2). </li><li> Calculer le nombre de valeurs attribuées dans chaque bac et la somme pour chaque bac. Utilisez cette valeur, ainsi que le nombre total de champs, de calculer une valeur pour chacune des six bacs utilisés pour l'indice. </li><li> Somme de ces valeurs et de soustraire de l'un à produire de l'indice de la diversité. </li><li> L'indice de diversité est un indicateur de la dispersion des notes autour de la moyenne pour un échantillon donné. Ainsi, plus les indices indiquent une plus large diffusion des résultats, ou de l'hétérogénéité accrue de l'expression. Inversement, la baisse des indices, indiquent moins de variation dans la mesure expression et l'expression homogène dans l'échantillon. Ceci est illustré dans FigurES 2 et 3. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Thérapie ciblée avec des agents de toxicité relativement faible, tels que le tamoxifène et le trastuzumab, ne sont pas standard de soins pour les patients atteints de cancer de l'ovaire. Il ya de bonnes preuves que le platine-taxane chimiothérapie de première ligne est supérieure à d'autres schémas chimiothérapeutiques pour les 9-13 cancer des ovaires, et tandis que 70-80% des patients répondent initialement, la plupart vont rechuter et de mourir de leur maladie. Mesure de biomarqueurs qui pourraient prédire la réponse aux thérapies alternatives seraient utiles dans le choix thérapeutique individualisé pour chaque patient, et puisque la pression de chimiothérapie exerce sur la sélection d'une tumeur, les cellules tumorales survivantes peuvent posséder des caractéristiques différentes et représentent une sous-population de la tumeur avant traitement; quantifier cette changement pourrait donc être utile. Nous avons appliqué notre approche de la cartographie hétérogénéité d'expression ER et HER2 dans le cancer ovarien spécimens, avant et après la chimiothérapie, en Order pour mesurer les changements quantitatifs dans l'expression, et d'évaluer la relation entre l'expression des biomarqueurs avant et après la thérapie. Les deux ER et HER2 démontrent une hétérogénéité marquée au sein des tumeurs individuelles, et dans certaines tumeurs, variations de l'indice de Simpson après un traitement de l'hétérogénéité relativement élevé à l'hétérogénéité basse, représentée en diminuant scores de l'indice de Simpson (voir figures 2 et 3). Ceci appuie l'idée que la sélection clonale survient en réponse à la chimiothérapie cytotoxique; plus important encore, cela peut être exploité en utilisant une thérapie ciblée contre la population résiduelle, afin de mieux personnaliser le traitement pour les patients atteints de cancer. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Photomicrographies hématoxyline et l'éosine teinté de différents domaines de l'ovaire montrant en même morphologie variable. (A) x40 photomicrographie montre deux zones adjacentes de la tumeur avec différents morphologie. Vues haute puissance (x200) révèlent des cellules avec compensation cytoplasmique et un modèle de croissance solide dans la partie supérieure de la tumeur (B), tandis que la partie inférieure du tissu (C) a plus homogène cytoplasme éosinophile et un modèle de croissance papillaire. Cette tumeur, cependant, être classés comme séreuse sous-type histologique papillaire à des fins de gestion supplémentaires. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Heatmaps hétérogénéité d'expression de protéines dans les ER cytokératine-positives tissus cancer de l'ovaire, avant (partie supérieure) et après (en bas) une thérapie. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Heatmaps hétérogénéité de HER2 expression des protéines dans les tissus cytokératine-positives cancer de l'ovaire, avant (partie supérieure) et après (en bas) une thérapie.

<ol><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%3A+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li>
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<li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li>
</ol>

JC, MG, CJ et CS sont des employés de HistoRx, Inc

Le procédé décrit ici la quantification permet d&#39;hétérogénéité moléculaire dans la norme fixés au formol et inclus en paraffine coupes histologiques de matériel tumoral. Le procédé permet une valeur à attribuer au degré d&#39;hétérogénéité dans une coupe de tissu, de sorte que cela peut alors être pris en compte comme une variable dans le développement de biomarqueurs et d&#39;analyse. Bien qu&#39;en général il est préférable que les biomarqueurs tissulaires sont homogènes par rapport à l&#39;expression, de sorte que le dosage est moins sensible aux erreurs d&#39;échantillonnage ou de partialité, il pourrait, dans certaines circonstances être utile pour quantifier l&#39;hétérogénéité comme un paramètre. Par exemple, comme le montre l&#39;exemple d&#39;illustration pour ER et HER2, les biomarqueurs communes montrent une hétérogénéité considérable d&#39;expression et il est actuellement inconnu si cela représente un facteur pronostique indépendant ou prédictive par rapport au résultat clinique ou la réponse au traitement, respectivement. De même, comme l&#39;illustre, la thérapie elle-même pourrait modifier dynamiquement lapopulations constituantes des cellules, et donc la mesure de l&#39;enrichissement cible pourrait être utile pour guider les décisions thérapeutiques. Cependant, la technique est limitée par les mêmes facteurs qui limitent traditionnelle analyses histopathologiques ou biomarqueur (comme immunohistochimiques). Le résultat est dépendant du type, la taille et la qualité du tissu en cours d&#39;analyse, et donc une section de tissu unique peut ne pas être représentatifs de toute la tumeur. En effet, l&#39;indice de Simpson peut être indûment biaisées par la taille du tissu (nombre d&#39;images capturées et les scores mesurés AQUA). L&#39;immunogénicité des épitopes mesurée peut être soumis à incontrôlables pré-analytique des facteurs qui modifient leur artifactually expression à travers la section de tissu (comme le temps d&#39;ischémie froide, ou la longueur de la fixation, et les artéfacts de bord). Ceci est particulièrement un problème pour les phospho-épitopes, qui sont notoirement instable 14, 15. Par conséquent, la technique pourrait être mieux adaptéeaux pièces d&#39;exérèse plutôt petites biopsies, et effectué sur plusieurs sections plutôt qu&#39;un seul. Finalement, les techniques d&#39;imagerie 3D peut offrir une occasion de mieux quantifier ce paramètre. La technique présentée peut également être limitée par des facteurs biologiques, tels que la variabilité dans l&#39;expression de l&#39;épitope de masquage cytokératine. Cela pourrait être une préoccupation particulière dans ces cancers, notamment de l&#39;ovaire et le cancer du sein, qui subissent épithélio-mésenchymateuses de transition (EMT) ou sont enrichis pour les non-épithéliales des composants ou des cellules souches 16, comme cela a été démontré récemment de se produire dans la chimiothérapie cancer de l&#39;ovaire traités in vitro, 17 ans, et chez les patients du cancer du sein dans la réponse au traitement 18. Cette limitation peut être surmontée en utilisant des anticorps de masquage alternative (ou un cocktail d&#39;anticorps), tels que la cytokératine ainsi vimentine, qui est régulée positivement dans EMT 16. En outre, depuis les autres composantes du tissu (le microroenvironment), telles que les fibroblastes ou les cellules endothéliales vasculaires sont également de plus en plus ciblé par les thérapies biologiques, la technique peut aussi être élargi pour marquer ces composants, en utilisant des masques spécifiques pour les compartiments de l&#39;intérêt, comme PECAM / CD31 à la coloration pendant les cellules endothéliales vasculaires . Bien que l&#39;adaptation de l&#39;indice de Simpson a été utilisé comme une mesure de l&#39;hétérogénéité dans le protocole actuel en raison de sa simplicité, d&#39;autres mesures d&#39;hétérogénéité pourrait être utilisé, comme de simples mesures de tendance centrale (moyenne, variance, médiane, etc.) En outre, les calculs d&#39;indice de Simpson pourrait être modifié pour mieux s&#39;adapter à une population test particulier. L&#39;utilisation de Z-score permet le pointage des transformations pour être plus applicable pour les marqueurs multiples depuis l&#39;hétérogénéité est basé sur l&#39;écart autour de la moyenne pour un ensemble de données. Cependant, la gamme globale de notation peut être limitée dans ce type de transformation. Certains modèles peuvent être mieux adaptésben tout simplement les scores AQUA réelle pour tous les échantillons d&#39;un ensemble marqueur particulier. Le choix du nombre de bacs et de seuils est aussi une limitation dans la fourchette de valeurs qui peuvent entraîner et peuvent être optimisées pour des modèles expérimentaux alternatifs. Nous avons utilisé ER et HER2 dans l&#39;étude actuelle comme biomarqueurs candidats, car ils sont déjà utilisés en clinique, aider à répondre à des questions pertinentes cliniques à l&#39;égard de l&#39;efficacité des thérapies ciblées, et sont connus pour présenter une hétérogénéité et le changement dans l&#39;enseignement primaire et lointain la maladie 19. Toutefois, le marqueur optimal de l&#39;hétérogénéité reste à déterminer. D&#39;autres possibilités pourraient inclure des marqueurs cytogénétiques de clonalité, tels que ceux utilisés précédemment dans des études FISH interphasique 20. L&#39;approche requiert une validation plus poussée dans les grandes, bien annotée cohortes cliniques ou essais cliniques afin de continuer à établir la pertinence de ce paramètre dans la biologie du cancer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Utilisé comme équipés d&#39;un vendeur </td></tr><tr><td> Spectrum </td><td> Aperio </td><td> Spectrum </td><td> Numéros de configuration et de catalogue varient sur la façon dont les institutions locales établi leur base de données et la structure informatique. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, en conjonction avec AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> Le forfait permet AQUAjustment AQUAnalysis d&#39;utiliser des images stockées dans Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 sur 400 de dilution </td></tr><tr><td> de souris anti-pan cytokératine </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 sur 50 de dilution </td></tr><tr><td> Diluant Anticorps </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision de chèvre-lapin HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Bloc de protéines </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Chèvre anti-souris Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI milieu de montage </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Centre Immunocoloration Sequenza </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Utilisé ici pour immunofluorescence paillasse </td></tr></tbody></table>

cartographie hétérogénéité d&#39;expression des protéines dans les tumeurs par immunofluorescence quantitative

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

L&#39;hétérogénéité morphologique au sein d&#39;une tumeur individuelle est bien reconnu par histopathologistes dans la pratique chirurgicale. Bien que cela prend souvent la forme de zones de différenciation distincts en sous-types histologiques reconnues, ou différents de grade pathologique, souvent il ya des différences plus subtiles dans le phénotype qui défient classification précise (figure 1). En fin de compte, puisque la morphologie est dicté par le phénotype moléculaire sous-jacent, les zones avec des différences visibles sont susceptibles d&#39;être accompagnés par des différences dans l&#39;expression de protéines qui orchestrent la fonction cellulaire et le comportement, et donc, de l&#39;apparence. L&#39;importance de visible et invisible (moléculaire) l&#39;hétérogénéité pour le pronostic est inconnue, mais des données récentes suggèrent que, au moins au niveau génétique, l&#39;hétérogénéité existe dans la tumeur primaire 1,2, et certains de ces clones sous-donnent lieu à des métastases ( et donc mortel) de la maladie. En outre, certaines protéines sontmesurées en tant que biomarqueurs, parce qu&#39;ils sont les cibles de la thérapie (par exemple pour ER et HER2 pour le tamoxifène et le trastuzumab (Herceptin), respectivement). Si ces protéines montrent une expression variable au sein d&#39;une tumeur, puis les réponses thérapeutiques peuvent également être variable. Les régimes largement utilisé score histopathologique pour l&#39;immunohistochimie ou ignorer, ou numériquement homogénéiser la quantification de l&#39;expression des protéines. De même, dans les techniques destructrices, où les échantillons tumoraux sont homogénéisés (telles que le profilage d&#39;expression génique), les informations quantitatives peut être élucidé, mais l&#39;information spatiale est perdue. Approches de cartographie génétique hétérogénéité dans le cancer du pancréas ont compté ni sur la génération d&#39;une suspension cellulaire unique 3 ou le 4 macrodissection. Une récente étude a utilisé des boîtes quantiques dans le but de cartographier l&#39;hétérogénéité morphologique et moléculaire dans les tissus de la prostate 5, fournissant la preuve de principe que la cartographie morphologie et moléculaire est réalisable, mais la chute de lHort de quantifier l&#39;hétérogénéité. Depuis l&#39;immunohistochimie est, au mieux, que semi-quantitative et sujettes à des biais intra-et inter-observateur, plus sensibles et les méthodologies quantitatives sont nécessaires afin de cartographier avec précision et de quantifier l&#39;hétérogénéité des tissus in situ. Nous avons développé et appliqué une méthodologie expérimentale et statistiques afin de mesurer systématiquement l&#39;hétérogénéité d&#39;expression des protéines dans des coupes de tissus ensemble des tumeurs, basée sur l&#39;analyse automatisée quantitatives (AQUA) du système 6. Des sections de tissu sont marquées avec des anticorps spécifiques dirigés contre les cytokératines et des cibles d&#39;intérêt, couplée à un fluorophore anticorps secondaires marqués. Les lames sont imagées par un scanner de fluorescence entière-diapositive. Les images sont subdivisés en centaines de milliers de tuiles, et chaque carreau est ensuite attribué un score AQUA qui est une mesure de la concentration en protéines dans le épithéliales (tumeur) composante du tissu. Heatmaps sont générés afin de représenter l&#39;expression tissulaire des protéines et un score hétérogénéité affecté, en utilisant une mesure statistique de l&#39;hétérogénéité à l&#39;origine utilisée en écologie, basé sur l&#39;indice de Simpson biodiversité 7. À ce jour il n&#39;ya eu aucune tentative de cartographier systématiquement et quantifier cette variabilité en tandem avec l&#39;expression de protéines contenues dans des préparations histologiques. Ici, nous illustrons la première utilisation de la méthode appliquée à l&#39;ER et HER2 l&#39;expression de biomarqueurs dans le cancer de l&#39;ovaire. En utilisant cette méthode ouvre la voie à l&#39;analyse de l&#39;hétérogénéité comme une variable indépendante dans les études d&#39;expression de biomarqueurs dans les études translationnelles, afin d&#39;établir l&#39;importance de l&#39;hétérogénéité dans le pronostic et la prédiction des réponses au traitement.

Nous décrivons ici une méthode pour quantifier l&#39;hétérogénéité moléculaire dans des coupes histologiques de matériel tumoral par immunofluorescence quantitative, analyse d&#39;image, et une mesure statistique de l&#39;hétérogénéité. La méthode est destinée à être utilisée dans le développement de biomarqueurs cliniques et analyses.

Cartographie hétérogénéité d&#39;expression des protéines dans les tumeurs par immunofluorescence quantitative

L'hétérogénéité morphologique au sein d'une tumeur individuelle est bien reconnue par les histopathologistes dans la pratique chirurgicale. Bien que celle-ci prenne souvent la forme de...

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier précisément l'expression de biomarqueurs sur des sections complètes de tissu cancéreux humain afin d'attribuer une valeur numérique au degré d'hétérogénéité de l'expression protéique. Cette quantification est réalisée en scannant d'abord des sections de tissu tumoral marquées par immunofluorescence à l'aide d'un scanner fluorescent de diapositives entières. Ensuite, des régions d'intérêt au sein de la tumeur sont sélectionnées pour évaluation.Ensuite, l'expression de la protéine d'intérêt au sein des zones tumorales invasives est quantifiée à l'aide du système d'analyse d'images automatisé aqua. En définitive, cette méthode peut être utilisée pour cartographier l'expression des biomarqueurs dans les tissus tumoraux, qui est souvent très hétérogène à travers la coupe tissulaire. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes traditionnelles, telles que l'immunohistochimie utilisant des réactifs de visualisation colorimétriques, est que l'immunofluorescence est plus quantitative et plus sensible.En associant ces méthodes analytiques à un balayage immunofluorescent sur coupe entière, on obtient une cartographie fine des variations subtiles d'expression des biomarqueurs dans les tissus. Pour la première fois, la mise en œuvre de ces procédures est présentée par Mark Gustafson, directeur des opérations directes au laboratoire Histo RX. Après la coupe au microtome d'une biopsie de tissu cancéreux et la coloration immunofluorescente de l'échantillon pour détecter l'expression des biomarqueurs d'intérêt, chargez jusqu'à cinq lames contenant les sections colorées dans la cassette de l'appareil de numérisation.Ensuite, à l’aide de l’interface de la console du microscope d’analyse. Pour chaque lame, sélectionnez une région englobant tout le tissu présent sur la lame, indépendamment du motif de coloration ou d’autres aspects observables de l’échantillon. Ensuite, à l’aide de la console du microscope d’analyse, sélectionnez tout d’abord une région de tissu à évaluer, idéalement située dans la zone tumorale du tissu, afin d’obtenir la meilleure représentation possible.À présent, en utilisant la fonction d'exposition automatique de la console du scan scope, déterminez le temps d'exposition pour chaque canal ainsi que la mise au point de l'image. Utilisez le losange bleu sur l'image de la console du scan scope pour sélectionner une région supplémentaire éloignée du tissu, mais toujours située dans la zone de la lame sous le couvre-objet, afin de définir la zone de fond sur laquelle seront acquises les images de correction du champ plat. Pour chaque filtre, ajoutez des points de mise au point sur la zone tissulaire représentée par les carrés jaunes afin d'optimiser la capture d'image. Si les images présentent un fond élevé ou d'autres artefacts, la zone d'image doit être déplacée et de nouvelles images doivent être acquises.Le tissu est ensuite scanné et les images numériques de coupe obtenues sont automatiquement téléchargées dans la base de données Aperio Spectrum. Double-cliquez sur l'image miniature pour que le programme Spectrum sélectionne la coupe à analyser dans la liste des coupes numériques de la base de données Spectrum. Ensuite, à l'aide de l'image annotée h et D fournie, annotez la région d'intérêt sur l'image fluorescente.Plusieurs régions d'intérêt délimitées par des cercles individuels peuvent être sélectionnées sur un même échantillon. Les images annotées sont automatiquement enregistrées dans la base de données de spectres. Sélectionnez maintenant Analyser dans la barre de menu en haut de l'écran ; lorsque la fenêtre d'analyse apparaît, choisissez l'analyse histo RX aqua dans le menu déroulant.Lorsque vous êtes prêt à commencer, appuyez sur le bouton d'analyse. Une fenêtre de console réduite apparaîtra dans la barre des tâches Windows, affichant la progression du transfert des images depuis la base de données Spectrum vers l'ordinateur local. Une fois les données transférées, l'analyse aqua démarrera pour générer un score aqua à l'aide d'un algorithme de scoring aqua non supervisé, basé sur le regroupement en grappes des données d'un premier seuil d'échantillon, correspondant au signal de l'image de pan-cytokératine supérieur au signal de fond de l'image. Cela permettra d'utiliser les pixels pour définir un masque tumoral qui pourra ensuite être utilisé pour les calculs ultérieurs.Utilisez les pixels de cytokeratine pan exprimée fortement pour définir également les régions cytoplasmiques ou non nucléaires des cellules tumorales. Comme illustré ici, les pixels présentant un signal élevé dans le canal DPI et situés à l'intérieur du masque tumoral sont identifiés comme étant de nature nucléaire. Si, lors de l'examen, des champs sont jugés inappropriés pour le comptage en raison d'artéfacts d'échantillonnage ou d'imagerie, ces champs sont exclus du comptage et conduisent également à un résultat final de type échec.Les résultats du score aqua sont présentés sous forme de tableau de scores associés à chaque tuile de 512 par 512 pixels dans la région d'intérêt d'un échantillon complet de coupe de tissu, tableau qui peut être enregistré et utilisé pour des analyses statistiques ultérieures. Ces photomicrographies colorées à l'hématoxyline et à l'éosine montrent comment différentes zones d'un même cancer de l'ovaire peuvent présenter une morphologie variable. La vue à fort grossissement en haut à droite de la Figure B met en évidence des cellules présentant un dégagement cytoplasmique et un mode de croissance en nappe dans la partie supérieure de la tumeur.La partie inférieure du tissu agrandie dans la section en bas à droite de la Figure C présente toutefois un cytoplasme éosinophile plus homogène et un patron de croissance papillaire. Ici, les cartes thermiques d'hétérogénéité de l'expression des récepteurs aux œstrogènes (ER) dans une coupe de tissu cancéreux ovarien avant et après un traitement chimiothérapeutique sont illustrées respectivement dans les panneaux supérieur et inférieur. Remarquez le passage d'une expression variable des ER à travers la coupe, avec des régions présentant à la fois une forte et une faible expression dans l'image supérieure, à une distribution uniforme d'une forte expression des ER illustrée en rouge dans l'image inférieure.La représentation numérique de ce changement est indiquée à gauche par la diminution de l'indice de Simpson. Sur cette figure, les cartes thermiques d'hétérogénéité de HER2 dans une section tissulaire de cancer de l'ovaire sont montrées à nouveau avant et après le traitement, comme illustré respectivement dans les panneaux supérieurs et inférieurs. Remarquez à nouveau le passage d'une expression variable de HER2 à travers la section, avec des régions présentant à la fois une forte et une faible expression dans l'image supérieure, à une distribution uniforme d'une forte expression de HER2 dans l'image inférieure.L'indice de Simpson est à nouveau observé en baisse. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité des données produites par l'analyse informatique dépend uniquement de la qualité de la coloration, laquelle doit présenter un haut niveau de qualité technique.

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Imagerie par immunofluorescence multiplexée pour analyser les sous-populations de lymphocytes T résistants à l’immunothérapie

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Quantification de l&#39;expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

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