Cartographie hétérogénéité d'expression des protéines dans les tumeurs par immunofluorescence quantitative

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier précisément l'expression de biomarqueurs dans des sections complètes de tissu tumoral humain afin d'attribuer une valeur numérique au degré d'hétérogénéité de l'expression protéique. Cette quantification est réalisée en scannant d'abord des sections de tissu tumoral marquées par immunofluorescence à l'aide d'un scanner fluorescent de diapositives entières. Ensuite, des régions d'intérêt au sein de la tumeur sont sélectionnées pour évaluation.

Ensuite, l'expression de la protéine d'intérêt au sein des zones tumorales invasives est quantifiée à l'aide du système d'analyse d'image automatisé aqua. En définitive, cette méthode peut être utilisée pour cartographier l'expression des biomarqueurs dans les tissus tumoraux, qui est souvent très hétérogène à travers la coupe de tissu. Le principal avantage de l'utilisation de ces techniques par rapport aux méthodes traditionnelles telles que l'immunohistochimie avec des réactifs de visualisation colorimétrique et métrique est que l'immunofluorescence est plus quantitative et plus sensible.

Le couplage de ces méthodes analytiques à un balayage d'immunofluorescence sur coupe entière permet une cartographie fine des variations subtiles de l'expression des biomarqueurs dans les tissus. Pour la première fois, Mark Gustafson, directeur direct des opérations au laboratoire Histo RX, démontre ces procédures. Après la microtomie, la section d'une biopsie de tissu cancéreux et la coloration immunofluorescente de l'échantillon pour détecter l'expression des biomarqueurs d'intérêt, chargez jusqu'à cinq lames contenant les sections colorées dans la cassette porte-lames du scanner.

Ensuite, à l’aide de l’interface de la console du scanneur. Pour chaque lame, sélectionnez une région englobant tout le tissu présent sur la lame, indépendamment du motif de coloration ou d’autres aspects observables de l’échantillon. Ensuite, à l’aide de la console du scanneur, sélectionnez d’abord une région de tissu à évaluer, de préférence située dans la zone tumorale du tissu, afin d’obtenir la meilleure représentation possible.

À présent, en utilisant la fonction d'exposition automatique de la console du scan scope, déterminez le temps d'exposition pour chaque canal ainsi que la mise au point de l'image. Utilisez le losange bleu sur l'image de la console du scan scope pour sélectionner une région supplémentaire éloignée du tissu, mais toujours située dans la zone de la lame sous le couvre-objet, afin de définir la zone d'arrière-plan où seront acquises les images de correction de champ plat. Pour chaque filtre, ajoutez des points de mise au point sur la zone tissulaire représentée par les carrés jaunes afin d'optimiser la capture d'image. Si les images présentent un arrière-plan élevé ou d'autres artefacts, la zone d'image doit être déplacée et de nouvelles images doivent être acquises.

Le tissu est ensuite scanné et les images numériques de lame obtenues sont automatiquement téléchargées dans la base de données Aperio Spectrum. Double-cliquez sur l'image miniature pour que le programme Spectrum sélectionne la lame à analyser dans la liste des lames numériques de la base de données Spectrum. Ensuite, à l'aide de l'image annotée h et D fournie, annotez la région d'intérêt sur l'image fluorescente.

Plusieurs régions d'intérêt délimitées par des cercles individuels peuvent être sélectionnées sur un même échantillon. Les images annotées sont automatiquement enregistrées dans la base de données de spectres. Sélectionnez maintenant Analyser dans la barre de menu située en haut de l'écran ; lorsque la fenêtre d'analyse apparaît, choisissez l'analyse histo RX aqua dans le menu déroulant.

Lorsque vous êtes prêt à commencer, appuyez sur le bouton analyser. Une fenêtre de console réduite apparaîtra dans la barre des tâches Windows, affichant la progression du transfert des images depuis la base de données Spectrum vers l'ordinateur local. Une fois les données transférées, l'analyse aqua démarrera pour générer un score aqua à l'aide d'un algorithme de scoring aqua non supervisé, basé sur le regroupement des données d'un premier seuil d'échantillon, correspondant au signal de l'image de pan-cytokératine supérieur au signal de fond de l'image. Cela permettra d'utiliser les pixels pour définir un masque tumoral qui pourra ensuite être utilisé pour les calculs ultérieurs.

Utilisez les pixels à forte expression de la pan-cytokératine pour définir également les régions cytoplasmiques ou non nucléaires des cellules tumorales. Comme on le voit ici, les pixels présentant un signal élevé dans le canal DPI et situés à l'intérieur du masque tumoral sont identifiés comme étant de nature nucléaire. Si, lors de l'examen, des champs sont jugés inappropriés pour le comptage en raison d'artéfacts liés à l'échantillon ou à l'imagerie, ces champs sont exclus du comptage et conduisent également à un résultat final échoué.

Les résultats du score aqua sont présentés sous forme de tableau de scores associés à chaque tuile de 512 par 512 pixels dans la région d'intérêt d'un échantillon complet de section tissulaire, tableau qui peut être enregistré et utilisé pour des analyses statistiques ultérieures. Ces microphotographies colorées à l'hématoxyline et à l'éosine montrent comment différentes zones d'un même cancer de l'ovaire peuvent présenter une morphologie variable. La vue à fort grossissement en haut à droite de la Figure B met en évidence des cellules présentant un vidage cytoplasmique et une croissance en motif solide dans la partie supérieure de la tumeur.

La partie inférieure du tissu agrandie dans la section en bas à droite de la Figure C présente toutefois un cytoplasme éosinophile plus homogène et un patron de croissance papillaire. Ici, les cartes thermiques d'hétérogénéité de l'expression des récepteurs aux œstrogènes (ER) dans une section de tissu cancéreux ovarien avant et après un traitement chimiothérapeutique sont illustrées respectivement dans les panneaux supérieur et inférieur. Remarquez le passage d'une expression variable des ER à travers la section, avec des régions présentant à la fois une forte et une faible expression dans l'image supérieure, à une distribution uniforme d'une forte expression des ER illustrée en rouge dans l'image inférieure.

La représentation numérique de ce changement est indiquée à gauche par la diminution de l'indice de Simpson. Dans cette figure, les cartes thermiques d'hétérogénéité de HER2 dans une section tissulaire de cancer de l'ovaire sont à nouveau montrées avant et après le traitement, comme illustré respectivement dans les panneaux supérieurs et inférieurs. Remarquez à nouveau le passage d'une expression variable de HER2 à travers la section, avec des régions présentant à la fois une forte et une faible expression dans la figure supérieure, à une distribution uniforme d'une forte expression de HER2 dans la figure inférieure.

L'indice de Simpson est à nouveau observé en baisse. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité des données produites par l'analyse informatique dépend entièrement de la qualité de la coloration, laquelle doit répondre à un haut standard technique.