Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d'écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

L’objectif général de cet article vidéo est de décrire une technique permettant de soumettre des cellules adhérentes à des conditions d’écoulement laminaire et d’évaluer la réponse à des contraintes de cisaillement de fluide bien quantifiables. Ceci est accompli en assemblant d’abord le circuit d’écoulement sans la chambre d’écoulement. Le circuit comprend l’impulsion du réservoir, l’amortisseur, le tube dur, le tube souple, les robinets d’arrêt à quatre voies et les adaptateurs de leurre connectés, ainsi qu’un filtre à air.

L’étape suivante consiste à remplir le circuit avec les huit profusus souhaités, tels que le milieu cellulaire dans des conditions stériles, puis à démarrer la pompe pour remplir l’amortisseur d’impulsions et purger le tube d’air. Ceci est suivi par l’insertion de la glissière assise dans la plaque inférieure de la chambre d’écoulement. La dernière étape de la procédure est l’assemblage complet du circuit d’écoulement avec la chambre d’écoulement en ligne.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l’alignement des cellules progénitrices endothéliales marquées par fluorescence sous l’exposition au stress de cisaillement des fluides à travers la chambre transparente à l’aide d’un microscope fluorescent pour étudier le comportement fonctionnel des cellules. Il est souvent nécessaire d’imiter la physiologie in vivo en soumettant les cellules à un stress de cisaillement fluide. Nous avons conçu une chambre d’écoulement à plaques parallèle et un circuit d’écoulement continu, qui nous permettent d’étudier les cellules dans des conditions d’écoulement et de les observer à travers la chambre transparente.

Cette technique peut servir d’outil de recherche précieux pour les domaines de la médecine et de l’ingénierie. Notre chambre d’écoulement permet une visualisation intermittente ou en temps réel des cellules sous écoulement à l’aide d’un microscope vertical ou inversé. De plus, la conception du Dr Ach Nick permet aux chercheurs d’imager des cellules sur des surfaces transparentes ou radio-opaques à l’aide de lentilles de microscope standard.

De plus, il peut s’agir d’un outil important dans la recherche en pharmacologie pour étudier l’effet des médicaments sur les cellules dans des conditions d’écoulement. La visualisation de la configuration est critique car plusieurs des étapes sont difficiles à maîtriser en lisant uniquement un protocole. Je donnerai des instructions étape par étape sur la façon de configurer la chambre d’écoulement et le circuit d’écoulement couramment utilisés dans le laboratoire du Dr Ock Next pour assembler le circuit d’écoulement.

Commencez par fixer un segment de tube dur de 36 pouces à une extrémité d’un amortisseur d’impulsions à l’autre extrémité. Fixez un segment de tube souple de 18 pouces. Placez un adaptateur de leurre mâle d’un huitième de pouce à l’extrémité de la section du tube souple de 18 pouces.

Connectez le leurre mâle à un adaptateur de leurre femelle d’un huitième de pouce. Fixez le leurre femelle à un nouveau segment de 18 pouces de tube souple. Percez trois trous dans un gobelet en verre de 250 millilitres.

Afin d’installer le tube, insérez un segment de 1,5 pouce de tube souple dans un trou. Comme une bouche d’aération. Insérez les extrémités libres du tube dur et souple à travers les deux autres trous du bouchon dans la bouteille en verre de 250 millilitres, qui agira comme un réservoir.

Assurez-vous que le tube dur atteint le fond du réservoir. Le maintien de la stérilité tout au long de la configuration du circuit est crucial pour le succès de cette procédure. Par conséquent, toutes les pièces doivent être stérilisées et vous devez porter des gants stériles tout au long du processus.

En plus des pièces assemblées, ces pièces doivent être stérilisées. Une chambre d’écoulement complète, trois segments de tube souple de deux pouces, un mâle et un femelle, un adaptateur de leurre de huitième pouce, quatre vis à tête plate d’un demi-pouce, 6 5 16 pouces, huit 30 secondes. Des chenilles de pouce par pouce, des vis à tête plate, une pince à épiler, une lame de verre et deux serviettes stérilisées à la vapeur.

Autoclave à 121 degrés Celsius pendant 60 minutes. Placez la chambre d’écoulement du circuit d’écoulement quatre par quatre voies les robinets d’arrêt un par un, le robinet d’arrêt et toutes les pièces stérilisées sur ce champ stérile. Tout en portant des gants stériles, connectez les deux robinets d’arrêt à quatre voies.

Placez des capuchons sur les orifices d’échantillonnage ouverts. Détachez les adaptateurs de leurre mâle et femelle fixant les deux segments de tube souple du circuit d’écoulement et insérez les robinets d’arrêt connectés. Fixez le tube souple inséré dans le réservoir dans une seringue de 30 millilitres et retirez le piston de la seringue.

Remplissez la bouteille avec 125 millilitres de milieu EPC. Reconnectez le tube souple au robinet d’arrêt. Placez un filtre de seringue stérile dans la bouche d’aération.

Transférez maintenant le circuit d’écoulement dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Fixez le tube dur dans la tête de pompe à rouleau flexible principale indiquée pour une utilisation avec ce type de tube Palmer à charbon. Assurez-vous que le tube ne chevauche pas les rails de montage de la pompe à rouleaux.

Marquez le tube à l’endroit où il sort de la tête de pompe de chaque côté avec un marqueur. Après s’être assuré que tous les robinets d’arrêt sont fermés vers les orifices d’échantillonnage et ouverts le long du circuit d’écoulement, démarrez la pompe. Vérifiez le sens de l’écoulement.

Le PERFUSE huit doit se déplacer du réservoir en verre à travers le tube dur dans l’amortisseur d’impulsions. Pour l’assemblage de la chambre d’écoulement, utilisez des gants stériles pour connecter un segment de tube souple de deux pouces à un adaptateur de leurre femelle d’un huitième de pouce. Connectez un autre segment de tube souple de deux pouces à un adaptateur de leurre mâle d’un huitième de pouce.

Fixez le tube souple de deux pouces avec adaptateur de leurre femelle à l’orifice d’entrée et le tube souple de deux pouces avec adaptateur de leurre mâle à l’orifice de sortie. Fixez des robinets d’arrêt à quatre voies à ces deux adaptateurs de leurre. Connectez le morceau de tube souple de deux pouces restant au connecteur de l’orifice latéral sortant du piège à bulles et fixez un robinet d’arrêt unidirectionnel à l’aide d’une pince à épiler stérile.

Retirez la lame ensemencée de cellules du récipient de culture cellulaire et placez-la dans l’évidement de la plaque inférieure de la chambre d’écoulement. Assurez-vous que la lame est placée avec le côté assis de la cellule vers le haut à l’aide d’une seringuse ou d’une pipette, placez 10 millilitres de milieu EPC chaud sur la lame assise de la cellule. Laissez le fluide couvrir la glissière dans la chambre d’écoulement, mais ne renversez pas le fluide sur le joint torique de la plaque inférieure.

Placez la plaque supérieure de la chambre d’écoulement sur la plaque inférieure, en alignant les trous de vis. Gardez les deux plaques parallèles afin de ne pas introduire de bulles d’air dans les plaques à vis de la chambre. Ensemble. À l’aide d’un tournevis automatique à piles, aérez le piège à bulles d’entrée en ouvrant le robinet d’arrêt unidirectionnel fixé à l’orifice du piège à bulles latéral d’entrée.

À l’aide d’une seringue de 10 millilitres, rincez doucement le tube d’entrée avec du fluide EPC, puis fermez ce robinet d’arrêt et bouchez-le. Maintenant, aérez le canal de la chambre en ouvrant le robinet d’arrêt à quatre voies de l’orifice de sortie et en rinçant doucement le fluide EPC à travers la chambre d’écoulement. Encore une fois, à l’aide d’une seringue de 10 millilitres, bouchez toutes les connexions du robinet d’arrêt à quatre voies et fermez-les.

Transférez la chambre d’écoulement dans l’incubateur humidifié avec le circuit d’écoulement assemblé. Mettez en pause la pompe du circuit d’écoulement et fermez le circuit d’écoulement. Robinets d’arrêt dans le sens de l’écoulement pour éviter les fuites.

Connectez la chambre d’écoulement au circuit d’écoulement Une fois la chambre d’écoulement connectée au circuit d’écoulement, ouvrez les robinets d’arrêt dans le sens de l’écoulement. Redémarrez la pompe d’écoulement et assurez-vous que la PERFUSE huit s’écoule dans la bonne direction. Ajustez le débit à la contrainte souhaitée.

Au cours de l’expérience d’écoulement, la chambre d’écoulement peut être retirée du circuit pour imager les cellules par microscopie optique ou fluorescente. Pour ce faire, déconnectez la chambre d’écoulement du circuit d’écoulement au niveau du robinet d’arrêt pour arrêter les connexions du robinet. Pour collecter, perfuser huit échantillons pour analyse.

Tout d’abord, mettez la pompe en pause, fermez le robinet d’arrêt situé le plus près de l’amortisseur d’impulsions. Retirez son capuchon de protection et placez-le à l’envers pour vous assurer qu’il n’est pas contaminé. Insérez une petite seringue dans l’orifice de l’échantillon.

Fermez le robinet d’arrêt dans le sens de la chambre d’écoulement, en maintenant l’orifice et le circuit d’échantillonnage dans la direction de l’amortisseur d’impulsions ouverts. Prélevez la quantité souhaitée d’échantillon dans le circuit, fermez le robinet d’arrêt vers l’orifice d’échantillonnage avant de retirer la seringue. Conservez l’échantillon abondant dans un flacon étiqueté et congelez-le à moins 80 degrés Celsius.

Refermez l’orifice d’échantillonnage et assurez-vous que tous les robinets d’arrêt sont ouverts avant de commencer l’écoulement. En utilisant cette méthode, les cellules progénitrices endothéliales dérivées du sang humain peuvent être ensemencées sur des lames de titane en 15 minutes et adhérer sous des forces de cisaillement physiologiques. Comme le montre cette figure, les EPC se propagent sous l’influence de l’écoulement d’environ 210 microns carrés immédiatement après l’ensemencement à environ 657 microns carrés après trois heures et à environ 1 152 microns carrés après 48 heures de contrainte de cisaillement du fluide de 15 diments par centimètre carré.

Cette image au microscope optique illustre l’orientation aléatoire des EPC humains. Après une période d’assise statique de six heures après trois heures de débit à 100 dînes par centimètre carré, les cellules se sont étalées mais restent dans une orientation aléatoire. Après 48 heures de contrainte de cisaillement du fluide à 100 diments par centimètre carré, les EPC sont alignés et orientés dans le sens de l’écoulement.

Ici, les EPC ont été marqués avec du CTO et les noyaux cellulaires colorés avec herx pour mourir après l’écoulement. À titre de comparaison, cette image montre des EPC porcins sur des lames en titane alignés avec le sens de l’écoulement. Après 48 heures d’écoulement et 15 jours par centimètre carré d’exposition au stress de cisaillement, les bords cellulaires ont été colorés avec une coloration anti pcam et les noyaux avec une coloration à l’acide nucléique de cytoxine.

Cette méthode permet également d’obtenir des échantillons du huit PERFUSE à des moments prédéterminés pour l’analyse et/ou la quantification des métabolites cellulaires sécrétés. Voici un exemple de production de nitrite au cours d’une expérience d’écoulement de 48 heures avec des EPC porcins. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de maintenir la stérilité tout au long du processus.

De plus, il est important de prendre les mesures nécessaires afin de réduire le nombre de bulles d’air dans la chambre d’écoulement avant le début de l’écoulement continu, car elles peuvent arracher les cellules. Nous recommandons également de vérifier chaque connexion dans la chambre d’écoulement et le circuit avant la profusion afin d’éviter les fuites de PERFUSE eight pendant une expérience. Cette chambre est conçue avec des joints toriques intégrés qui permettent une opposition complète des plaques supérieure et inférieure et fournissent une étanchéité sans nécessiter de pompes à vide.

Cette caractéristique garantit également une hauteur de chambre constante entre les expériences et élimine le besoin de joints en caoutchouc ou de réglages. Notre chambre d’écoulement utilise des lames de microscope standardisées. Par conséquent, un grand nombre de cellules sont disponibles pour d’autres expériences.

Par exemple, l’ARN et l’ADN des cellules après le flux peuvent être évalués pour la synthèse des protéines ou l’expression des gènes. La conception de notre circuit permet de collecter huit échantillons perfusés pour l’analyse et la quantification des métabolites cellulaires tels que le nitrite, un métabolite oxydatif primaire de l’oxyde nitrique, qui est sécrété par les cellules soumises à un stress de cisaillement fluide. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler notre chambre d’écoulement et notre circuit d’écoulement stérile pour soumettre les cellules d’adhérence à une contrainte de cisaillement des fluides.