Name: Révéler la topographie des circuits neuronaux dans les multi-couleur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez le traçage des circuits neuronaux in vivo avec des traceurs WGA-Alexa fluorescents. Cette méthode permet de visualiser les projections topographiques dans le cervelet, le cortex et la moelle épinière chez la souris avec une imagerie rapide et intense.

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<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons décrit les détails chirurgicaux et techniques nécessaires à la réussite de traçage axonal et dendritique en utilisant un roman fluorescentes approche fondée sur des projections neurales étiquetage rapide dans le développement et la souris adulte. En utilisant WGA-Alexa, nous montrons comment les traceurs et marqueurs peuvent être utilisés pour analyser la topographie des circuits à motifs à haute résolution et en trois dimensions. Beaucoup de traceurs sont disponibles pour le traç...

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipement / Réactifs </td><td> Modèle / Catalogue nombre </td><td> Société </td></tr><tr><td> Stérilisateur à billes </td><td> Modèle Steri 250 Cat. # 18000-45 </td><td> Outils Fine Science </td></tr><tr><td> Cauterizer </td><td> Cat. # 18000-00 </td><td> Outils Fine Science </td></tr><tr><td> Verre borosilicate capillaires </td><td> Cat. # 300056 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Verre double étage Micropipette Puller </td><td> Modèle 001-PC-10 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> Seringue micrométrique </td><td> Cat. # GS-1100 </td><td> Gilmont Instruments </td></tr><tr><td> Petit instrument stéréotaxique animaux </td><td> Modèle 940-A </td><td> Instrumentation Kopf </td></tr><tr><td> Manipulateur des électrodes </td><td> Modèle 960 </td><td> Instrumentation Kopf </td></tr><tr><td> Vetcare chambre </td><td> Cat. #340508 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Coussin chauffant </td><td> Cat. # 341241 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Leica DFC360 FX caméras </td><td> DFC360 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC490 caméra </td><td> DFC490 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DM5500 microscope </td><td> DM5500 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX caméras </td><td> DFC3000 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscope </td><td> MZ16 FA </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Filtre CY3 </td><td> Modèle # 11600231 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Filtre FITC </td><td> Modèle # 11513880 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> A4 DAPI / filtre UV </td><td> Modèle # 11504162 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Germe de blé agglutinine, Alexa Fluor 488 conjugué </td><td> Cat. # W11261 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Blé germ agglutinine, Alexa Fluor 555 conjugué </td><td> Cat. # W32464 </td><td> Invitrogen </td></tr></tbody></table>

révéler la topographie des circuits neuronaux dans les multi-couleur

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Les circuits neuronaux sont organisés en fonction des cartes topographiques. Afin de visualiser l&#39;architecture circuit complexe, nous avons développé une approche de l&#39;étiquette de manière fiable la structuration globale de multiples projections topographiques. Le cervelet est un modèle idéal pour étudier l&#39;arrangement ordonné des circuits neuronaux. Par exemple, l&#39;organisation compartimentée du spinocérébelleuse fibres moussues s&#39;est avéré être un système indispensable pour l&#39;étude de la structuration des fibres moussues. Nous avons récemment montré que le germe de blé agglutinine (WGA), conjugué à Alexa 555 et 488 peut être utilisé pour tracer des projections spinocérébelleuses fibres moussues dans le développement et la souris adulte (al Reeber et al. 2011). Nous avons trouvé trois propriétés principales qui font les outils WGA-Alexa traceurs souhaitable pour l&#39;étiquetage des projections de neurones. Premièrement, les fluorophores Alexa sont intenses et leur luminosité permet d&#39;imagerie wholemount directement après traçage. Deuxièmement, WGA-Alexa traceurs étiquette toute la trajectoire du développement et les adultes projectio neuronesns. Troisièmement, WGA-Alexa traceurs sont rapidement transportés dans les deux directions rétrograde et antérograde. Ici, nous décrivons en détail la façon de préparer les traceurs et les autres outils requis, comment effectuer la chirurgie pour spinocérébelleuse traçage et la meilleure façon de projections d&#39;images tracées en trois dimensions. En résumé, nous fournissons un protocole étape par étape de traçage qui sera utile pour déchiffrer l&#39;organisation et la connectivité des cartes fonctionnelles, non seulement dans le cervelet, mais aussi dans le cortex, du tronc cérébral et la moelle épinière.

Nous fournissons un guide pratique pour la prestation des traceurs<em&gt; In vivo</em&gt; Et l&#39;utilisation de la voie spino-cérébelleuse comme un système modèle pour démontrer les étapes essentielles pour l&#39;analyse des circuits neuronaux réussie chez la souris. Nous décrivons en détail notre protocole polyvalent de traçage qui exploite le germe de blé agglutinine (WGA) conjugués à des fluorophores Alexa.

Révéler la topographie des circuits neuronaux dans les multi-couleur

Les circuits neuronaux sont organisés en cartes topographiques fonctionnelles. Afin de visualiser l'architecture complexe des circuits, nous avons développé une approche permettant de...

Cette procédure décrit un protocole de traçage in vivo polyvalent qui exploite la gluténine de germe de blé conjuguée à des fluorophores Alexa pour tracer les circuits neuronaux. Premièrement, une incision est pratiquée dans la région thoracique inférieure et la région lombaire supérieure, puis la fascia et les muscles spinaux superficiels sont sectionnés. La deuxième étape consiste à réaliser une laminectomie dorsale.Ensuite, l'électrode microscopique est installée et fixée au micromanipulateur. Suit l'injection sous pression de traceurs neuronaux dans la moelle épinière. La dernière étape de cette procédure consiste à assurer des soins postopératoires adéquats pendant la période de récupération et à laisser suffisamment de temps pour que les traceurs soient transportés dans l'ensemble des faisceaux ciblés.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l'organisation et la connectivité des cartes topographiques dans le cortex cérébelleux, le tronc cérébral et la moelle épinière grâce à la microscopie d'immunofluorescence. Le principal avantage de ce traceur par rapport aux traceurs existants comme le BDA ou le W-G-A-H-R-P est que les traceurs WGA Alexa sont suffisamment brillants pour permettre une imagerie en montage complet directement après le traçage. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurosciences des systèmes, telles que quelle est la logique sous-jacente au schéma global de multiples projections topographiques au sein et entre les systèmes corticaux, cérébelleux, du tronc cérébral et de la moelle épinière avant le début de la procédure.Veillez à ce que toutes les manipulations soient conformes aux directives du comité d'éthique (IACUC), qu'un champ stérile soit disponible pour la chirurgie, et que tous les instruments utilisés aient été stérilisés. Des techniques chirurgicales stériles doivent être appliquées tout au long de l'intervention après administration d'un anesthésique approuvé à l'animal ; assurez-vous qu'un niveau d'anesthésie adéquat a été atteint en effectuant une pression sur l'orteil. Le réflexe podal doit être absent une fois que l'animal est complètement anesthésié.Raser le pelage de la zone à opérer à l'aide d'un tondeur. Ensuite, placer l'animal en position dorsale sur un tampon de gaze stérile en utilisant un motif circulaire allant de l'intérieur vers l'extérieur. Essuyer la zone rasée avec deux jeux de lingettes alcoolisées, puis avec de la Bétadine à 70 % dans l'alcool.Ensuite, passez à nouveau avec des compresses alcoolisées, puis délimitez clairement le champ opératoire en plaçant un tampon de gaze stérile, dans lequel on aura découpé un petit trou, sur l’animal une fois celui-ci correctement préparé. Procédez ainsi à la chirurgie en respectant scrupuleusement les techniques chirurgicales stériles. Soulevez la peau à l’aide de pinces et pratiquez une incision avec des ciseaux en regard de la ligne médiane, juste au-dessus de la région thoracique inférieure et lombaire supérieure.Couper l'aponévrose et les muscles spinaux superficiels si nécessaire, arrêter tout saignement en cautérisant les vaisseaux sanguins. Ensuite, identifier le point médian entre le processus articulaire et le processus spinal dorsal, et sectionner la lame ici des deux côtés de la colonne vertébrale. Puis réaliser une laminectomie dorsale en retirant les apophyses épineuses d'un ou deux segments de la moelle épinière thoracique inférieure et lombaire supérieure.À l’aide d’une seringue micrométrique, remplissez une pipette en verre avec le traceur. Ensuite, fixez fermement la microélectrode en verre en place sur un micromanipulateur. Puis, remplissez l’aiguille avec les réactifs.Insérez la pipette groupée de 0,1 à 0,5 millimètre dans la région thoracique inférieure et lombaire supérieure de la moelle épinière. À mi-chemin entre la ligne médiane et le bord latéral de la moelle épinière, injectez sous pression environ 0,5 microlitre d'une solution à 2 % de conjugué de lectine de blé LOR, de lectine de germe de blé, de conjugué de peroxydase de raifort, ou d'une solution à 10 % d'amine de dextrane biotinylée dans du PBS supplémenté avec 0,5 % de vert rapide, sur une période de trois à cinq minutes. Si le traceur ne s'expulse pas facilement de la pipette, retirez lentement la pointe afin de créer une petite poche dans le tissu.Ensuite, essayez de faire une nouvelle injection après avoir terminé la microinjection. Fermez délicatement la peau à l’aide de clips chirurgicaux et de colle tissulaire. Puis placez l’animal dans une chambre de récupération sur un tapis chauffant.Surveillez la fréquence respiratoire et observez les signes indiquant que l'animal tente de bouger. Une fois que l'animal s'est réveillé de l'anesthésie, remettez-le dans sa cage d'origine et donnez-lui de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi que des analgésiques si nécessaire. Vérifiez régulièrement la présence de douleur, d'inconfort ou d'infection, ainsi que la prise alimentaire et hydrique adéquate ; les animaux injectés avec du gluten de germe de blé et des traceurs conjugués sont sacrifiés.24 heures après la microinjection. Le BDA nécessite généralement des durées de survie plus longues pour tracer complètement les projections neuronales, et donc pour cartographier entièrement les projections spino-cérébelleuses. Ces animaux sont sacrifiés après environ 11 jours.Des traceurs de gliadine de germe de blé ont été injectés dans la moelle épinière thoracique inférieure et lombaire supérieure. Ce schéma illustre l'origine et la terminaison de la gliadine de germe de blé. Neurones spino-cérébelleux marqués à l’Alexa 555.Cette figure montre le site d'injection après l'administration de l'agglutinine de germe de blé Alexa 5 55 dans la région thoracique inférieure et lombaire supérieure de la moelle épinière adulte. Cette image en montage complet montre les lobes antérieurs suite à l'injection de l'agglutinine de germe de blé.Alexa 555 dans la région thoracique inférieure et lombaire supérieure de la moelle épinière. Les lobes sont indiqués par des chiffres romains. Ici, nous observons que le traçage antérograde au gluten d'extrait de germe de blé Alexa 555 du faisceau spino-cérébelleux révèle des bandes bien définies de fibres moussues, telles qu'observées sur cette coupe tissulaire coronaire.Ce schéma du cervelet de souris résume le schéma général du cervelet spinal. Des bandes de fibres moussues wheatgermagluten marquées à l’Alexa 555 ont été injectées dans l’hémisegment droit de la moelle épinière lombaire et du wheatgermagluten marqué à l’Alexa 488 dans le même segment du côté gauche, comme on peut l’observer sur une coupe tissulaire coronale passant par les LOE postérieurs.Les deux traceurs Alexa de l'agglutinine de Weger ont été transportés vers le cervelet et ont marqué avec succès des sous-ensembles distincts de terminaisons en boutons moussus, principalement dans la couche des cellules granuleuses, désignée par GCL. Les traceurs Alexa de l'agglutinine de Weger peuvent être utilisés en combinaison avec l'immunohistochimie et l'histologie pour un triple marquage des neurones et des projections. Ici, l'agglutinine de Weger Alexa 5 55 est déposée dans les terminaisons en boutons moussus du lobe trois. Cette image à plus fort grossissement de la région encadrée illustre un marquage net des terminaisons en boutons moussus.Cette image de la double coloration de la zéine révèle un ensemble de bandes de cellules bikini dans Lole trois. Cette image à plus fort grossissement de la région encadrée illustre une marquage nette des cellules bikini dans la couche des cellules bikini et la couche moléculaire. Ici, la coloration au DPI révèle les noyaux des neurones et des cellules gliales.Cette image à plus fort grossissement de la région encadrée illustre une marquage intense des noyaux de la couche granulaire riche en cellules granulaires et de la couche des cellules bikini, ainsi qu'un marquage moins dense dans la couche moléculaire. Ici apparaît une image montrant un triple marquage par le lectine de germe de blé (Wheatgerm Agglutinin), l'Alexa 555 sérine deux et le DPI, mettant en évidence les bandes afférentes, les stries de cellules bikini et l'architecture cytoarchitecturale générale. Enfin, cette image à plus fort grossissement de la région encadrée illustre clairement la puissance de cette technique pour révéler l'architecture cytoarchitecturale des structures cérébrales.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes par animal si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'observer immédiatement le tissu après la coupe. Bien qu'une observation dans les deux jours suivant la coupe permette encore d'obtenir une visualisation réussie des fibres et des terminaisons marquées selon cette méthode.D'autres méthodes, comme le traçage génétique de lignée, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : quelles sont les modalités de projection et les schémas de terminaison des populations cellulaires définies génétiquement ?

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