Name: Réponses dimagerie neuronale dans les préparations dorgane voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Découvrez la préparation de coupes tissulaires vivantes d'organe voméronasal chez des souris transgéniques G-CaMP2 pour l'imagerie des réponses neuronales aux phéromones. Cette technique permet d'analyser les mécanismes de signalisation chimique.

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Nous remercions Andrea Moran ainsi que les membres du Laboratoire d'animalerie et des services techniques (LASF) de l'Institut Stowers pour leur excellent soutien en matière de soins aux animaux et de services techniques. Ce travail est financé par des subventions provenant de l'Institut Stowers et des NIH (NIDCD 008003) attribuées à CRY. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels de l'Institut national sur la surdité et les troubles de la communication ou des Instituts nationaux de la santé. Demande de brevet américain en cours pour les souris tetO-G-CaMP2 au nom de l'Institut Stowers, CRY et LM.

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<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li>
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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La majorité des récepteurs voméronasal (VRS) restent comme des récepteurs orphelins depuis leur découverte par Dulac et Axel 5. Les ligands de ces récepteurs de phéromones chimiosensoriels et leurs rôles dans la médiation de comportements animaux ne sont pas bien comprises. Jusqu&#39;à présent, une seule paire de ligand / récepteur, le peptide ESP1 et son récepteur correspondant, Vmn2r116 (V2Rp5), a été identifié et démontré pour transmettre des informations spécifiques à 19,23 sociale. Un autre ré...

réponses d&#39;imagerie neuronale dans les préparations d&#39;organe voméronasal slice exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

L&#39;organe voméronasal (VNO) détecte les signaux chimiosensoriels qui transportent l&#39;information sur le statut social, sexuel et de reproduction des individus au sein des mêmes espèces 1,2. Ces signaux intraspécifiques, les phéromones, ainsi que les signaux de certains prédateurs 3, activer les neurones sensoriels voméronasal (VSN), avec des niveaux élevés de spécificité et de sensibilité 4. Au moins trois familles distinctes de récepteurs couplés aux protéines G, V1R, V2R et FPR 5-14, sont exprimés dans les neurones VNO à la médiation de la détection des indices chimiosensoriels. Pour comprendre comment l&#39;information phéromone est codée par le VNO, il est essentiel d&#39;analyser les profils de réponse du VSN individu à différents stimuli et identifier les récepteurs spécifiques qui interviennent dans ces réponses. Le neuroepithelia de VNO sont enfermés dans une paire d&#39;os vomer. La structure semi-aveugle tubulaire du VNO a une extrémité ouverte (le conduit voméronasal) la connexion àla cavité nasale. VSN étendre leurs dendrites à la partie lumen du VNO, où les indices phéromones sont en contact avec les récepteurs exprimés à des boutons dendritiques. Les corps cellulaires des VSN forme pseudo-stratifié avec couches V1R et V2R exprimé dans les couches apicales et basales, respectivement 6-8. Plusieurs techniques ont été utilisés pour surveiller les réactions des VSN aux stimuli sensoriels 4,12,15-19. Parmi ces techniques, préparation de tranches aiguës offre plusieurs avantages. Tout d&#39;abord, par rapport à 3,17 VSN dissocié, préparations tranche de maintenir les neurones dans leur morphologie natif et les dendrites des cellules restent relativement intactes. Deuxièmement, les corps cellulaires des VSN sont facilement accessibles en tranche coronaire du VNO pour permettre des études d&#39;électrophysiologie et des expériences d&#39;imagerie par rapport à l&#39;épithélium entier et l&#39;ensemble de montage des préparations 12,20. Troisièmement, cette méthode peut être combinée avec les techniques de clonage moléculaire pour permettre l&#39;identification du récepteur. La stimulation sensorielle provoque une forte affluence de Ca 2 + dans VSN qui est indicatif de 4,21 activation du récepteur. Nous avons donc développer des souris transgéniques qui expriment G-camp2 dans les neurones olfactifs sensoriels, y compris le VSN 15,22. La sensibilité et la nature génétique de la sonde facilitent grandement Ca 2 + des expériences d&#39;imagerie. Cette méthode a permis d&#39;éliminer le processus de chargement colorant utilisé dans les études précédentes 4,21. Nous employons également un système de livraison ligand qui permet l&#39;application de divers stimuli pour les tranches de VNO. La combinaison des deux techniques nous permet de suivre simultanément plusieurs neurones en réponse à un grand nombre de stimuli. Enfin, nous avons établi un pipeline d&#39;analyse semi-automatique pour faciliter le traitement de l&#39;image.

L'organe voméronasal (VNO) détecte des signaux chimiques intraspécifiques qui transmettent des informations sociales et reproductives. Nous avons réalisé des expériences d'imagerie Ca2+ en utilisant des souris transgéniques exprimant G-CaMP2 dans le tissu du VNO. Cette approche nous permet d'analyser les schémas complexes de réponse des neurones voméronasaux à un grand nombre de stimuli de phéromones.

Réponses d&#39;imagerie neuronale dans les préparations d&#39;organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

L'organe voméronasal (OVN) détecte des signaux chimiosensoriels qui portent des informations sur le statut social, sexuel et reproductif des individus au sein de...

L'objectif général de cette procédure est d'illustrer comment préparer des tranches de tissu vivant pour l'imagerie des réponses aux phéromones dans les neurones de l'organe nasal MRO. Cela s'accomplit tout d'abord en préparant des tranches de tissu vivant provenant de l'organe nasal MRO ou du VNO de souris exprimant un indicateur génétique du calcium, GCaMP deux. L'étape suivante consiste à installer le système de perfusion sur la platine du microscope afin de maintenir la tranche, d'appliquer le stimulus et de réaliser l'imagerie.Réponse. Une expérience d'imagerie en accéléré est ensuite réalisée avec divers stimuli de phéromones, suivie d'une analyse des données issues des résultats d'imagerie. En définitive, on obtient les profils de réponse des neurones du VNO à différents stimuli de phéromones.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le chargement au calcium D ou l'imagerie sur cellules dissociées, est que nous pouvons préserver la morphologie intacte des cellules, mieux maintenir la viabilité des tranches et obtenir un signal plus intense. Cette méthode peut nous aider à répondre à certaines questions clés dans l'étude du système nasal des vers, telles que l'identification des ligands et de leurs récepteurs, ainsi que la caractérisation des réponses individuelles des neurones nasaux des vers. Cette méthode peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les systèmes olfactif, sérique ou cérébral chez le psoriasis.En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison de la complexité liée à l'obtention d'un bon modèle de psoriasis et à la mise en place du système de perfusion. Avant de commencer cette procédure, préparez les solutions nécessaires, notamment la solution de Ringer au liquide céphalorachidien artificiel pour souris, l'agarose à bas point de fusion à 4 % et les stimuli phénomonaux, conformément au manuscrit joint. Ensuite, placez deux tubes d'agarose à bas point de fusion sur un bloc chauffant.Régler la température à plus de 60 degrés Celsius pour faire fondre les aros. Une fois que le gel est liquéfié, transférer les tubes dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius. Pour préparer les tranches de VNO.Après avoir décapité une souris euthanasiée exprimant GCaMP, couper les os mandibulaires avec une paire de ciseaux afin d'enlever la mâchoire inférieure. Ensuite, détacher le tissu ridé du palais supérieur pour exposer la cavité nasale. Puis, séparer les mâchoires en insérant une lame chirurgicale entre les deux incisives antérieures.Retirez soigneusement l'os de la mâchoire pour exposer le VNO. À ce stade, soulevez l'ensemble du VNO de la cavité nasale en tenant le coccyx. Transférez le VNO dans une solution froide d'ACSF oxygénée pour souris.Immédiatement sous le microscope de dissection, séparez les deux VNO en faisant glisser doucement les pointes de la pince le long de la paroi de l'os septal. Retirez l'os vulnér qui entoure le tissu du VNO. Ensuite, soulevez délicatement tout le tissu du VI NO de la cavité osseuse.Il convient d'exercer une extrême prudence lors de cette étape afin d'éviter d'endommager l'épithélium neuroépithélial. Ensuite, retirer complètement les petits fragments osseux restants à la surface du tissu. Avant d'incorporer les fragments restants.Le tissu peut être accroché par la lame de coupe, ce qui risque de l'extraire du bloc d'aros. Ensuite, utilisez la pince pour maintenir l'extrémité postérieure du tissu du VNO et immergez-le délicatement dans l'aros fondu. Refroidissez rapidement le tube sur de la glace.Pour solidifier les aros, le processus d'encapsulation et de refroidissement doit prendre moins de deux minutes. Ensuite, tailler le bloc d'aros contenant le VNO et le coller sur le porte-tissu. Puis, insérer le porte-tissu dans le cylindre métallique et remplir la chambre restante avec du aros supplémentaire à bas point de fusion.Une fois que l'agarose à bas point de fusion est solidifiée sur glace, procédez immédiatement à la sectionnement : fournissez un liquide céphalorachidien (LCR) de souris A oxygéné et refroidi à la chambre de sectionnement du découpeur de tissus, puis découpez les tranches à une épaisseur de 180 à 200 micromètres chacune. Ensuite, récupérez et transférez les tranches vers la chambre d'incubation. Les tranches restent viables pendant six à huit heures dans le LCR de souris A oxygéné à température ambiante.Dans cette procédure, placez d'abord une coupe du VNO au centre de la chambre de perfusion et maintenez la coupe en place à l'aide d'un ancrage. Les fils de l'ancrage doivent uniquement appuyer sur la partie de la coupe constituée d'agarose à bas point de fusion, mais pas sur le tissu du VNO. Ensuite, acheminez le LCR artificiel pour souris oxygéné vers la chambre de perfusion par l'orifice d'entrée à environ 100 microlitres par seconde.Le liquide est évacué par aspiration à l’aide d’une aiguille via le port de sortie afin d’assurer un flux continu de nouveau LCR de souris. Ensuite, remplir une seringue de 30 millilitres avec la solution de Ringer et la fixer à la pompe à seringue. Régler la vitesse de la pompe entre 300 et 600 microlitres par minute.Pour assurer un flux continu de solution Ringer sur la tranche, connectez la sortie de la solution Ringer à la boucle d'injection A-H-P-L-C. Le contrôle de la boucle d'injection possède deux trajets d'écoulement. En position de chargement, chargez l'échantillon d'urine de souris dans la boucle d'échantillonnage à l'aide d'une seringue de précision Hamilton.L'échantillon en excès quitte la boucle d'échantillonnage par l'orifice de déchet. La solution de Ringer injectée par la pompe à seringue contourne la boucle d'échantillonnage et va directement vers l'orifice, qui est relié à la pointe de perfusion à la position d'injection. La solution de la pompe circule à travers la boucle d'échantillonnage et pousse les stimuli phéromonaux vers l'orifice.Avant l'expérience d'imagerie. Éliminer les bulles d'air afin d'assurer un écoulement régulier du fluide de perfusion. Ensuite, régler la pointe de perfusion sous un objectif 5 x ou 10 x de manière à ce que la pointe se trouve à environ un millimètre du tissu nerveux.Pour mesurer le temps de retard de l'échantillon et sa durée, chargez 0,1 % du colorant fluorescent rho domine six G dans la boucle d'échantillonnage. Ensuite, basculez le robinet en position d'injection. Cinq secondes après le début de l'acquisition d'images, détectez le signal fluorescent entre 10 et 30 secondes.La courbe régulière du signal fluorescent indique également qu'il y a peu de turbulence générée sous l'objectif plongeur et qu'une perfusion adéquate de liquide céphalorachidien oxygéné de souris parvient à la tranche dans notre laboratoire. Le microscope Zeiss Axio scope FS two équipé d'un objectif plongeur à eau 10 x ou 20 x est utilisé pour l'imagerie en temps réel afin de détecter les signaux GAMP two. Le filtre passe-bande standard pour GFP de 450 à 490 nanomètres est utilisé.Les images épi-fluorescentes sont acquises à l'aide d'une caméra CCD avec une rotation un par un ou deux par deux, selon les niveaux d'expression de la GCaMP deux. Réglez d'abord la vitesse d'acquisition sur une image par seconde. Ajustez l'intensité de la lumière afin de minimiser la photobléaching des signaux GCaMP deux et les dommages photo-induits aux cellules.Ensuite, basculer la valve en position d'injection à un moment précis afin d'obtenir des délais temporels constants dans tous les essais au sein d'une série d'expériences. Effectuez maintenant un essai préliminaire en utilisant la solution de Ringer comme stimulus, puis réajuster le dispositif de perfusion si un artefact de mouvement apparaît lors de l'injection de l'échantillon. Ensuite, effectuer un essai témoin positif avec l'urine de souris diluée au 1/100 dans la solution, afin d'éviter toute contamination croisée entre différents échantillons.Nettoyez la seringue Hamilton avec la solution de Ringer au moins trois fois après avoir chargé un stimulus. De même, rincez la boucle d'échantillonnage avec la solution de Ringer au moins trois fois entre différents stimuli avant l'application. Attendez ensuite quatre à dix minutes avant d'appliquer le stimulus suivant, afin que les neurones sensoriels nasaux des MRO se rétablissent et permettent l'enregistrement d'images de toutes les images acquises à partir d'une même coupe.Un script VBA personnalisé dans Avision est utilisé pour automatiser ce processus. Dans ce cas, toutes les images d'une même expérience sont recalées par rapport à une image de référence commune choisie, à l'aide d'une transformation élastique, afin de soustraire les images et identifier les cellules répondant au stimulus. Les macros personnalisées dans ImageJ version 1.42 sont utilisées pour automatiser ce processus.Une image de projection minimale est générée pour chaque pile, et les cellules répondantes apparaissent après soustraction de la projection minimale des piles brutes. Ensuite, identifier la région d'intérêt à partir des piles soustraites et obtenir les coordonnées de la ROI à l'aide du plugin « multi mesure » d'ImageJ. Puis traiter toutes les piles d'une expérience et enregistrer toutes les coordonnées de ROI dans une liste maîtresse de ROI. Après cela, utiliser la liste maîtresse de ROI pour mesurer les réponses cellulaires à partir des piles d'images brutes à l'aide d'une macro personnalisée et du plugin « multi mesure » d'ImageJ. Enfin, tracer les courbes de réponse et la carte thermique sous Matlab.Voici un exemple d'expérience d'imagerie du VNO utilisant des échantillons d'urine prélevés sur quatre souris individuelles. Environ 80 cellules présentent une réponse à au moins l'un des stimuli urinaires, et leurs valeurs de réponse delta F divisé par F sont représentées sur la carte thermique. Voici les tracés de réponse des cellules une, deux et trois, qui montrent l'activation au cours du temps induite par les stimuli urinaires : la cellule une présente une réponse aux deux échantillons d'urine de femelles, mais pas aux échantillons de mâles.Alors que la cellule deux montre des schémas d'activation opposés et répond aux deux échantillons mâles. Seule la cellule trois est activée par les échantillons individuels de mâles et de femelles. Une fois maîtrisé, le tissu peut être préparé en 30 minutes et les neurones du piano peuvent être maintenus en vie de six à huit heures s'il est correctement réalisé.Lors de l'application de cette méthode, il est important de se rappeler d'utiliser des réactifs de qualité pour culture tissulaire et d'éviter tout contact entre les échantillons tissulaires et les réactifs de fixation tissulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de tissus vivants de psoriasis en vue de l'imagerie des réponses thermiques dans les neurones de Vienne à l'aide de l'expression murine de G Camp.

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Dans ce protocole, nous mettons à jour les progrès récents de l'imagerie...

Les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

La vidéo du protocole décrit la mise en place d’un patch clamp de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels de l’organe voméronasal (VNO) chez la souris. Une tranche coronale de VNO avec des neurones sensoriels marqués par fluorescence est placée dans une configuration d’enregistrement. Un neurone marqué est patché à l’aide d’une pipette d’enregistrement dans une configuration de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique en réponse à des...

Mise en place d’une pince de patch de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique à partir de neurones sensoriels voméronasaux

Ici, nous décrivons une approche physiologique qui permet l’identification et l’analyse approfondie d’une population définie de neurones sensoriels dans des coupes aiguës de tissu coronal de l’organe voméronasal de souris à l’aide d’enregistrements patch-clamp de cellules entières.

En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de l&#39;Vomeronasal Organ Souris

Ce protocole décrit l’utilisation de codé génétiquement Ca2 + reporters de consigner les changements dans l’activité neuronale en comportement vers Caenorhabditis elegans .

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

Ici nous présentons un protocole avec lequel le calcium pré- et/ou postsynaptic peut être visualisé dans le contexte de l'apprentissage et de la mémoire de Drosophila. L'imagerie in vivo de calcium utilisant des capteurs de calcium synaptically localisés est combinée avec un paradigme olfactif classique de telle sorte que la plasticité synaptique sous-jacente à ce type d'apprentissage associatif peut être déterminée.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo

Nous présentons ici comment exposer le ganglion géniculé d’une souris de laboratoire vivante et anesthésiée et comment utiliser l’imagerie calcique pour mesurer les réponses d’ensembles de ces neurones aux stimuli gustatifs, permettant ainsi de multiples essais avec différents stimulants. Cela permet des comparaisons approfondies de quels neurones répondent à quels tastants.

Imagerie calcique in vivo des réponses des neurones ganglionnaires géniculés de souris aux stimuli gustatifs

Nous présentons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte du côté ventral. En utilisant une lentille à indice de réfraction gradient avec un microscope miniature, l’imagerie au calcium peut être utilisée pour examiner l’activité de la somata neuronale olive inférieure in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Ce protocole décrit l’imagerie calcique GCaMP in vivo de neurones intacts du ganglion du trijumeau (TG). Cette description comprend la chirurgie d’exposition aux TG, l’imagerie par microscopie confocale in vivo des neurones TG, l’application de stimuli somatiques pendant l’imagerie microscopique des neurones TG et l’analyse des données d’imagerie calcique GCaMP in vivo .

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions du trijumeau intacts

Découvrez la préparation de coupes tissulaires vivantes d'organe voméronasal chez des souris transgéniques G-CaMP2 pour l'imagerie des réponses neuronales aux phéromones. Cette technique permet d'analyser les mécanismes de signalisation chimique.

Réponses dimagerie neuronale dans les préparations dorgane voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement (Vidéo) | JoVE Journal

Réponses d'imagerie neuronale dans les préparations d'organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

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