Name: Sétendant de courtes séquences dADN avec Constant Brucelles force axiale optiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez la manipulation de courtes molécules d'ADN par pinces optiques à force axiale constante pour étudier leurs propriétés mécaniques. Cette méthode permet d'analyser des fragments d'ADN d'environ 100 nm avec précision.

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Nous remercions le Dr Chen Yih-Fan de l&#39;aide avec les pinces optiques axiales et de contribuer certaines de ses données d&#39;étirement pour ce manuscrit. Ce travail a été financé par la NSF subvention PHY-0957293 et ​​FOCUS subvention PHY-0114336.

1. Pince à épiler Setup <ol><li> Le faisceau d'un laser à 1064 nm est séparé en deux faisceaux polarisés orthogonalement. On est habitué à manipuler la biomolécule tandis que l'autre est utilisée à des fins d'étalonnage (voir Fig. 2). </li><li> L'intensité du faisceau est commandée par la manipulation d'un déflecteur acousto-optique (OD), tandis que la position et l'orientation de chaque faisceau est commandé indépendamment par des miroirs d'orientation du faisceau et de télescopes optiques, respectivement. </li><li> Les faisceaux sont ensuite recombinés avec un autre séparateur de faisceau polarisant et en outre conditionnée par un ensemble final de l'optique télescopiques à peu trop remplir l'ouverture arrière de l'objectif de microscope. Un trop-plein 50% pour le faisceau d'étalonnage mène à une trappe étanche optique, tandis qu'un facteur légèrement inférieur à la largeur de manipulation, d'environ 20%, donne une orientation superficielle qui se traduit par une plus grande région réalisable du potentiel linéaire. Les poutres sont étroitement focalisé par une Planapo 60x/1.4 obj microscope à immersion d'huilecace sur la cellule échantillon. </li><li> Cette configuration pincettes est combiné avec un microscope à champ clair foyer construit qui fournit l'éclairage d'une lampe halogène focalisé sur la chambre de mesure par un condenseur. L'image à fond clair est séparée de la lumière laser par un miroir dichroïque, puis reproduite sur deux caméras CCD. On agit comme nos CCD principal moyen d'acquisition de données et le logiciel est déclenché pour donner des taux d'échantillonnage précis, tandis que l'autre CCD est utilisée pour l'image d'une microsphère de référence unique coincé dont la position sert de système de rétro-contrôle pour compenser la dérive dans le microscope. </li><li> L'échantillon est grossièrement positionné par rapport à l'objectif d'une table XY, et peut ensuite être positionné avec précision par un noyé trois dimensions piézo-étape. </li><li> La lumière laser diffusée vers l'avant et transmise est recueillie par le condenseur fond clair et concentré sur un photodétecteur. Le signal résultant est filtré à travers un filtre anti-repliement à 100 kHz, amplifié et uncquired à 200 kHz avec une carte DAQ. </li></ol> 2. Calibrage taille apparente de la perle de la position axiale <ol><li> Chargez une chambre 9 échantillon avec une solution en dispersion de 800 nm de diamètre microsphères de polystyrène dilué dans du tampon phosphate salin. Laisser reposer pendant 10-15 minutes, puis rincer légèrement avec un tampon pour enlever l'excédent de microsphères. </li><li> Localiser une microsphère de manière aléatoire collé à la lamelle et régler la hauteur de la chambre de mesure jusqu'à ce que la microsphère est d'environ 1 um en dessous de la mise au point afin de générer une image défocalisée. </li><li> Pour mesurer la taille apparente de l'image, tout d'abord trouver le centre de la microsphère en utilisant le modèle géométrique fonction de correspondance dans LabView. </li><li> Ensuite, générer un profil d'intensité radiale de la microsphère en faisant la moyenne sur 360 ° autour du centre de chaque section transversale. Le profil radial, ce qui correspond à un anneau blanc dans chacune des images en fond clair, peut être équipé d'une fonction quadratique de trouverun pic de luminosité. La distance entre ce sommet et le centre peut être utilisé comme une mesure de la taille apparente du bourrelet. </li><li> En utilisant la piezostage calibré, augmenter progressivement la position axiale de la microsphère et acquérir une image à chaque position axiale par la caméra CCD. </li><li> Répéter l'analyse d'image pour chaque image successive de corréler la taille apparente de la microsphère avec son emplacement axial (voir Fig. 3). La résolution axiale obtenue par la méthode est d'environ 1,4 nm 7. </li></ol> 3. Cartographie du potentiel optique du faisceau de manipulation <ol><li> Commencez par aligner le faisceau colinéaire manipulation et le faisceau d'étalonnage. Le faisceau d'étalonnage devrait être autour de 50 mW à l'ouverture arrière de l'objectif pendant que le faisceau de manipulation devrait être beaucoup plus faible, soit 10 mW. </li><li> Avec le faisceau de manipulation éteint, confiner une microsphère libre dans le piège beaucoup plus rigide du faisceau d'étalonnage. </li><li> Maintenant, tournez sur la manifaisceau pulation. Depuis le faisceau de manipulation est beaucoup plus faible que le faisceau d'étalonnage, la position axiale de la microsphère sera légèrement perturbé. Le changement résultant dans une position axiale peut être mesurée à partir des images en fond clair defocused déjà décrites. </li><li> Désactiver le faisceau de manipulation et de la microsphère encore piégés dans le faisceau d'étalonnage, recentrer le faisceau axial de l'étalonnage en réglant la lentille télescopique. Activer le faisceau de manipulation, la mesure de déplacement ultérieur de la microsphère et la répétition. </li><li> L'AX déplacements peut être relevée en position axiale de la focalisation du faisceau d'étalonnage. La position axiale correspondant à la plus grande cylindrée de la microsphère détermine le centre de la zone linéaire du piège optique (voir Fig. 4). </li><li> La dernière étape de l'obtention de la force optique du faisceau de manipulation en fonction de la position axiale nécessite une attention de mesure de la rigidité de l'faisceau d'étalonnage. Pour obtenir cela, déplacer la microsphère, piégés par le faisceau d'étalonnage, à environ un micromètre au-dessus de la surface de réglage de la lentille télescopique tandis que le faisceau de manipulation est mis hors tension. </li><li> Enregistrer le mouvement thermique axiale de la microsphère en mesurant l'intensité de la lumière transmise à un photodétecteur. </li><li> L'auto-corrélation du signal peut être équipé d'une fonction de décroissance exponentielle simple de donner la constante de temps des fluctuations,. Τ z </li><li> Le coefficient de frottement hydrodynamique ζ, de la microsphère peut être corrigée pour la proximité microsphères à un 5,10 en surface. La rigidité de la trappe d'étalonnage est alors donnée par κ z = ζ / z (τ matériaux supplémentaires voir A et B). </li><li> Connaissant la raideur de la trappe d'étalonnage permet de convertir les déplacements axiaux précédemment mesurées dans une population ƒ z = κ z AX intégration de this courbe donne une cartographie spatiale du potentiel axiale optique du faisceau de manipulation (voir Fig. 4). </li></ol> 4. L'étirement d'un échantillon d'ADN <ol><li> Monter la chambre 9 contenant des molécules d'ADN de surface asservies (&lt;1 kpb) et, tout en observant l'image à fond clair, de placer le foyer du faisceau légèrement supérieure à la manipulation non étiré microsphères en ajustant le télescope. Puis ajuster la position de la platine jusqu'à ce que l'un des microsphères est piégé. </li><li> Positionner grossièrement la microsphère au centre du plan XY du piège optique. Générer une série d'ondes carrées dans LabView et les envoyer à l'AOD de façon répétitive tourner le faisceau laser sur et en dehors. Soigneusement contrôler l'intensité du laser et la durée de l'état d'empêcher le chauffage de la chambre de mesure. En règle générale, l'utilisation d'environ 2 mW de puissance laser (mesurée à l'ouverture arrière de l'objectif) et envoyer des impulsions de 200 ms (marche) et 500 ms (éteinte). L'amplitude de la place wave envoyé à l'AOD devrait être d'environ 0,5 V. </li><li> Regarder la microsphère que le piège est sans cesse sous tension et hors tension et noter si le laser induit une direction préférentielle au mouvement de la microsphère. Tout en réglant la position de manière itérative à la fois dans la microsphère directions X et Y, en contrôlant le piezostage, le mouvement aléatoire de la microsphère doit devenir isotrope dans le plan XY, mais sensiblement limité lorsque le laser est en marche. </li><li> Ensuite, aligner le bourrelet dans la direction Z. Nouveau pulser le faisceau laser sur et hors tout, cette fois, à mesurer simultanément le déplacement axial des microsphères en temps réel. Centre de la scène à l'intérieur de la région linéaire, qui est le point où le déplacement Z est le plus grand. </li><li> Après un alignement soigneux dans la direction Z, il est impératif de vérifier que le piège est toujours centrée dans le plan XY. Si l'alignement XY a changé, à la fois l'alignement XY et Z doit être répété jusqu'à ce que la microsphère est bien centré sur les troisaxes. </li><li> Pour l'étirage de l'ADN, la rampe de l'intensité du laser par l'envoi d'un signal de tension à l'OD, de 0 V à 0,5 V par pas de 0,025 V. Dans chaque étape, record 400 trames à 100 images par seconde et les moyens pour obtenir le déplacement axial. </li><li> Les courbes de force d'extension peuvent maintenant être tracée et s'adapter à un modèle modifié de WLC 11 (voir Matériel supplémentaire B). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Nous présentons des courbes de vulgarisation de force pour deux séquences d'ADN: un pb 1298 et une séquence de 247 pb, cette dernière étant la plus courte séquence, nous avons été en mesure d'étirer de manière reproductible. Pour de courts tronçons de l'ADN, le classique Worm-Like Chain (WLC) modèle n'explique pas entièrement la relation d'extension vigueur parce que, à ces échelles de longueur, il faut tenir compte des effets de taille finie et de vulgarisation force nulle résultant de contraintes de limitation. Les mesures d'extension de force, doivent donc être ajusté en utilisant un modèle modifié WLC qui a une effive longueur de persistance et d'une extension vigueur zéro comme paramètres d'ajustement, décrits plus loin dans les documents supplémentaires. Pour des longueurs de contour de grandes ADNdb, la longueur de persistance efficace est tout simplement la longueur de persistance nominale (~ 50 nm) et l'extension vigueur zéro peut être négligée. Cependant, comme la longueur du contour devient plus courte est la longueur de persistance effective diminue bien en dessous de 50 nm et l'ADN, même sous la force de zéro, montre une extension significative. Les données et les ajustements correspondants des courbes d'extension de force sont présentés sur la Fig. 5 pour les deux séquences. De la WLC modification s'inscrit, nous avons déterminé les longueurs de persistance efficaces à 35 nm pour l'ADN 1298 bp et 25 nm à 247 pb d'ADN. À titre d'illustration, nous présentons des mesures individuelles des courbes de force d'extension pour chaque séquence. Dans la pratique, on pourrait répéter les mesures plusieurs fois et d'obtenir les résultats moyens ainsi que les erreurs-types. Il faut aussi noter that après l'obtention de chaque courbe, il est impératif de s'assurer que la microsphère reste piégé et correctement positionné dans la région linéaire, sinon la microsphère doit être réaligné comme décrit précédemment dans le protocole. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Principe de axiales pinces optiques. (Gauche) conventionnel piège pinces optiques au voisinage du foyer. La perle est ensuite déplacé latéralement à la lamelle d'exercer une tension. (À droite) en axiales pinces optiques, une microsphère est piégé loin de la mise au point, dans la région linéaire du potentiel optique. Dans cette configuration, le polymère est maintenu sous tension constante pour une gamme d'extensions. En outre, l'augmentation de l'intensité du laser se déplace la microsphère dans la direction axiale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Représentation schématique de la figure 2Axiales pinces optiques de lumière laser (1064 nm Nd: YVO 4). Est divisé en deux faisceaux en passant à travers un séparateur de faisceau polarisant (PBS). La manipulation de faisceau, passe à travers un déflecteur acousto-optique (OD) et le faisceau d'étalonnage peut être réglé indépendamment en utilisant des lentilles télescopiques. Les deux faisceaux sont ensuite recombinés en utilisant un autre PBS et focalisé sur l'échantillon par un objectif de haute NA. Simultanément, en fond clair d'éclairage utilisé pour suivre la microsphère, traverse l'échantillon, est infrarouge (IR) et est ensuite filtré imagée par deux caméras CCD, dont l'une prend les mesures tandis que l'autre dans le cadre d'un système de commande à rétroaction. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> La figure 3 étalonnage position axiale. Pour étalonner la position axiale, on acquiert des images défocalisées d'un cordon collé à la chambre de lamelle à différentes positions axiales de la scène. La taille de la microsphère est donnée par la distance entre son centre et la position de l'intensité du pic de l'anneau lumineux formé autour de l'image de la microsphère. L'insert présente la répartition d'intensité radiale qui donne la taille de la perle. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> La figure 4 principe de cartographie du potentiel optique. Pour tracer la force optique du faisceau de manipulation, le déplacement axial qu'il induit sur ​​une microsphère piégé dans un faisceau d'étalonnage est beaucoup plus forte mesurée. Le centre de la région linéaire, où ce déplacement est maximum est situé. Le Groupe optique vs courbe de position axiale peut être intégrée à trouver le potentiel optique. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 Courbe Extension de la Force. Données sont communiquées pour 1298 un hasard pb et 247 pb (en médaillon) Segment d'ADN double brin tendu par axiales pinces optiques. Les points de données ont été ajustées au modèle WLC modification de l'équation. 3 (trait plein) et a donné la persistance des longueurs effectives de 34 nm et 25 nm respectivement pour le 1298bp et 247bp.

<ol><li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li>
<li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loops+in+DNA%3A+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Phys.+J.+E.+Soft.+Matter%22%5BJournal%5D)">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li>
<li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li>
<li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA%3A+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li>
<li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li>
<li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E%22%5BJournal%5D)">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li>
<li>Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Meiners+Lab%22">Meiners Lab</a>. , University of Michigan. (2011).</li>
<li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Sci%22%5BJournal%5D)">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule%2C+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li>
<li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li>
<li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li>
<li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Pinces optiques classiques invoquer supporte rétroaction analogique ou commandé par ordinateur pour appliquer une force constante sur un objet réfringent. Ces systèmes de rétroaction actifs ont du mal à effectuer dans des conditions où des changements brusques de l&#39;extension de l&#39;échantillon se produire, par exemple, à partir de la liaison d&#39;une protéine à l&#39;ADN ou l&#39;intensification rapide d&#39;un moteur moléculaire le long d&#39;un filament. Diverses méthodes passives d&#39;application de forces co...

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactif / équipement </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Laser Nd: YVO4 </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acousto-optique déflecteur </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Objectif Microscope </td><td> Olympe </td><td> Planapo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Stade Piezo </td><td> Mad Labs Ville </td><td> Nano-LP100 </td><td> Platine XYZ </td></tr><tr><td> Caméra CCD </td><td> PixeLINK </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Photodétecteur </td><td> Électro-Optique Technologie </td><td> HE-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Perles de polystyrène </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800 nm, la streptavidine recouvert </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine </td><td> Roche </td> 11333089001 <td> Du mouton </td></tr><tr><td> Amorces </td><td> MWG opéron </td><td> Oligos personnalisés </td><td> Une amorce: la biotine Autres: digoxigénine </td></tr><tr><td> Réactifs de PCR </td><td> Nouvelle-Angleterre Biolabs </td><td> Taq polymérase, dNTP </td><td></td></tr><tr><td> Lamelle </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> D'autres produits chimiques pour tampon </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Documents complémentaires Coefficient de frottement hydrodynamique A. Pour la détermination du coefficient de frottement hydrodynamique de la microsphère près de la surface, on peut utiliser les 5,10 extension suivants: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="L'équation 1"> où le raccourci suivant hcomme cela a été mis en place: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Équation 2"> Le coefficient de frottement est définie en termes de la viscosité du fluide η et le rayon de la microsphère, la microsphère avec le centre, situé η une distance au-dessus de la surface. La somme converge assez bien quand il est étendu à une dizaine de termes. B. Influence de la position axiale sur l'étalonnage Raideur L'étalonnage de la rigidité piège implique un compromis entre la précision de l'étalonnage, ce qui augmente avec la distance à partir de la surface, et la position axiale réelle lorsque le piège est utilisé expérimentalement. En général, le piège est calibré à environ 800-1000 nm de la surface, qui est supérieure à l'état réel expérimentale. C. Mise à jour Worm-Like Chain (WLC) Modèle Les courbes de vulgarisation de force peut être adapté à une modification WLC modèle qui tient compte des effets d'exclusion de volume à la force optique zéro comme suit: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="L'équation 3"> où F est la force opt optique, x o est un paramètre propre à l'extension de la force de zéro, x opt est l'extension sous effort, l est la longueur du contour de l'ADN, et l * p est un paramètre de forme pour une seconde efficace " longueur de persistance ". wlc F est donnée par le modèle habituel WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="L'équation 4"> où ε est l'extension de l'ADN par rapport.

s&#39;étendant de courtes séquences d&#39;adn avec constant brucelles force axiale optiques

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Une seule molécule d&#39;ADN techniques d&#39;étirement des longueurs de contour moins d&#39;un kilobases sont marquées par des difficultés expérimentales. Cependant, de nombreux événements intéressants biologiques tels que fixation sur les histones et les protéines médiée par boucle d&#39;ADN 1,2, se produisent sur ​​cette échelle de longueur. Ces dernières années, les propriétés mécaniques de l&#39;ADN ont été montré à jouer un rôle important dans les processus cellulaires fondamentaux comme l&#39;empaquetage de l&#39;ADN dans les nucléosomes compacts et des fibres de chromatine 3,4. De toute évidence, il est alors important de comprendre les propriétés mécaniques de courts tronçons de l&#39;ADN. Dans cet article, nous proposons un guide pratique pour une technique simple molécule optique tweezing que nous avons développé pour étudier le comportement mécanique de l&#39;ADN avec des longueurs de contour aussi courts que quelques centaines de paires de bases. Le principal obstacle à étirer courts segments d&#39;ADN, c&#39;est que les pinces optiques classiques sont généralement conçus pour appliquer une force dans une direction latéral à l&#39;étape 5,6, (voir Fig. 1). Dans cette géométrie, l&#39;angle entre le bourrelet et la lamelle couvre-objet, dans laquelle l&#39;ADN est attaché, est très raide pour l&#39;ADN de longueur inférieure au micron. La position axiale doivent maintenant être pris en compte, ce qui peut être un défi, et, depuis l&#39;extension entraîne la microsphère près de la lamelle, effets stériques sont améliorées. En outre, en raison de l&#39;asymétrie des microsphères, des extensions latérales génère différents niveaux de couple due à la rotation de la microsphère dans le piège optique depuis la direction de la force de réaction pendant les changements de l&#39;extension. D&#39;autres méthodes de l&#39;ADN submicronique étirement se heurtent à leurs propres obstacles uniques. Par exemple, un piège à double faisceau optique est limitée à l&#39;étirement d&#39;ADN d&#39;environ une longueur d&#39;onde, au cours de laquelle les effets d&#39;interférence de points entre les deux pièges et de diffusion de la lumière entre les microsphères commence à poser un problème important. Remplacer l&#39;un des piègesavec une micropipette serait très probablement souffrir de problèmes similaires. Si l&#39;on peut utiliser directement le potentiel axiale d&#39;étirer l&#39;ADN, un schéma de rétroaction active serait nécessaire pour appliquer une force constante et la bande passante ce sera très limitée, en particulier à de faibles forces. Nous contourner ces problèmes fondamentaux en tirant directement l&#39;ADN loin de la lamelle à l&#39;aide d&#39;une force axiale constante de pinces optiques 7,8. Ce résultat est obtenu en piégeant le bourrelet dans une zone linéaire du potentiel optique, lorsque la force est constante optique-dont la force peut être ajustée par réglage de la puissance du laser. Piégeage à l&#39;intérieur de la région linéaire sert aussi de tout optique de force de serrage sur l&#39;ADN qui s&#39;étend depuis près de 350 nm dans la direction axiale. Nous simultanément compenser la dérive thermique et mécanique par le réglage fin de la position de la platine de telle sorte que d&#39;une microsphère de référence collée sur la lamelle couvre-objet reste à la même position et orientation, unellowing pour une période d&#39;observation pratiquement illimitées.

Nous illustrons l&#39;utilisation d&#39;une constante de force axiale pinces optiques pour étudier les propriétés mécaniques des molécules d&#39;ADN courts. En étirant l&#39;ADN axialement, nous minimisons empêchements stériques et des artefacts liés à la manipulation latérale conventionnelle, ce qui nous permet d&#39;étudier les molécules d&#39;ADN plus court ~ 100 nm.

S&#39;étendant de courtes séquences d&#39;ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

Les techniques de molécule unique permettant d'étirer l'ADN dont la longueur de contour est inférieure à une kilobase sont assorties de nombreuses difficultés expérimentales. Cependant, beaucoup...

L'objectif général de cette procédure est de manipuler des molécules d'ADN courtes de 100 nanomètres de longueur à l'aide de forces optiques constantes et bien calibrées. Cela est réalisé en fixant l'ADN par une extrémité à une lame de couverture et par l'autre à une microbille en polystyrène. Ensuite, les pinces optiques sont alignées et calibrées.Ensuite, l'ADN est étiré depuis la surface grâce à une combinaison de forces de gradient et de forces de diffusion agissant sur la microbille. Enfin, l'ADN est étendu en piégeant la bille dans la région linéaire du potentiel. Ce protocole a été utilisé pour étudier les propriétés mécaniques de l'ADN et la cinétique de liaison ADN-protéine, et s'est révélé utile pour élucider l'importance des conditions aux limites sur l'élasticité de courtes constructions d'ADN.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car l'alignement et l'étalonnage des pinces optiques à force constante sont délicats et complexes. Les pinces optiques comprennent un faisceau issu d'un laser de 1064 nanomètres divisé en deux faisceaux orthogonalement polarisés. L'un est utilisé pour manipuler la biomolécule, l'autre servant à des fi

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Bioingénierie

Nous décrivons une méthode pour l'observation de la réplication en temps réel des molécules individuelles d'ADN médiée par les protéines du système de réplication des bactériophages.

Observation directe d&#39;ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay

Dans cet article, nous décrivons l'utilisation de pinces magnétiques pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse enzymatique à l'échelle de la molécule unique d'une manière hautement parallélisables.

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

Nous décrivons ici l'instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d'ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

Pinces magnétiques, une technique de manipulation de molécule unique puissante, peuvent être adaptés pour les mesures directes de la torsion (en utilisant une configuration appelée librement orbite pinces magnétiques) et le couple (en utilisant une configuration appelée pinces de couple magnétique) dans les macromolécules biologiques. Lignes directrices pour l'exécution de ces mesures sont donnés, y compris les applications à l'étude de l'ADN et des filaments nucléo-protéines associées.

Pinces magnétiques pour la mesure de la torsion et de couple

Des pinces optiques ont été utilisées pour étudier le repliement de l’ARN en étirant des molécules individuelles à partir de leurs extrémités 5' et 3'. Ici, des procédures courantes sont décrites pour synthétiser des molécules d’ARN pour l’épilation, l’étalonnage de l’instrument et les méthodes de manipulation de molécules uniques.

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

Ce protocole montre un test de débit-stretching seule molécule simple, robuste et haut débit pour l’étude unidimensionnelle diffusion (1D) de molécules le long de l’ADN.

Une seule molécule Simple, robuste et haut débit débit étirement test mise en place pour étudier le Transport de molécules le long de l’ADN

Une plate-forme de molécules simples pinces magnétiques pour manipuler les G-quadruplexes est signalée, qui permet l’étude de stabilité G4 et règlement de diverses protéines.

Manipulation de molécules simples de G-quadruplexes par pinces magnétiques

La biochimie visuelle à molécule unique étudiée à travers des chambres microfluidiques est grandement facilitée à l’aide d’un baril en verre, de seringues étanches aux gaz, de connexions stables de tubes aux cellules d’écoulement et d’élimination des bulles en plaçant des vannes de commutation entre les seringues et les tubes. Le protocole décrit deux pièges optiques qui permettent de visualiser les transactions d’ADN et les interactions intermoléculaires.

Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule

Ici, nous décrivons une pince magnétique à haute vitesse qui effectue des mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force à la vitesse maximale de 1,2 kHz. Nous introduisons son application aux épingles à cheveux à ADN et aux complexes SNARE en tant que systèmes modèles, mais elle sera également applicable à d’autres molécules impliquées dans des événements mécanobiologiques.

Pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des éléments sensibles à la force

Ce protocole démontre la réalisation d’un test sur une seule molécule pour la visualisation en direct du déroulement de l’ADN par l’hélicase CMG. Il décrit (1) la préparation d’un substrat d’ADN, (2) la purification de l’hélicase CMG de Drosophila melanogaster marquée par fluorescence, (3) la préparation d’une cellule d’écoulement microfluidique pour la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) et (4) le test de déroulement de l’ADN à molécule unique.

Visualisation en temps réel d’une molécule unique du déroulement de l’ADN par CMG Helicase

Ce protocole démontre l’utilisation d’une pince magnétique à molécule unique pour étudier les interactions entre les protéines de liaison à l’ADN télomérique (facteur de liaison à la répétition des télomères 1 [TRF1] et TRF2) et les télomères longs extraits de cellules humaines. Il décrit les étapes préparatoires pour les télomères et les facteurs de liaison de répétition télomérique, l’exécution d’expériences sur une seule molécule et les méthodes de collecte et d’analyse des données.

Analyse des interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique

Découvrez la manipulation de courtes molécules d'ADN par pinces optiques à force axiale constante pour étudier leurs propriétés mécaniques. Cette méthode permet d'analyser des fragments d'ADN d'environ 100 nm avec précision.

S'étendant de courtes séquences d'ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

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