S'étendant de courtes séquences d'ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

L'objectif général de cette procédure est de manipuler des molécules d'ADN courtes de 100 nanomètres de longueur à l'aide de forces optiques constantes et bien calibrées. Cela est réalisé en fixant l'ADN par une extrémité à une lame de couverture et par l'autre à une microbille en polystyrène. Ensuite, les pinces optiques sont alignées et calibrées.

Ensuite, l'ADN est étiré depuis la surface grâce à une combinaison de forces de gradient et de forces de diffusion agissant sur la microbille. Enfin, l'ADN est étendu en piégeant la bille dans la région linéaire du potentiel. Ce protocole a été utilisé pour étudier les propriétés mécaniques de l'ADN et la cinétique de liaison ADN-protéine, et s'est révélé utile pour élucider l'importance des conditions aux limites sur l'élasticité de courtes constructions d'ADN.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car l'alignement et l'étalonnage des pinces optiques à force constante sont délicats et complexes. Les pinces optiques comprennent un faisceau issu d'un laser de 1064 nanomètres divisé en deux faisceaux orthogonalement polarisés. L'un est utilisé pour manipuler la biomolécule, l'autre servant à des fins d'étalonnage.

L'intensité du faisceau de manipulation est contrôlée par un déflecteur optique AO ou un OD. Les faisceaux sont ensuite recombinés à l’aide d’un autre séparateur de faisceau polarisant. Les faisceaux sont fortement focalisés par un objectif microscope à immersion huile plan APO 60 x 1,4 sur la cellule d’échantillon. Ce dispositif de pinces optiques est associé à un microscope en champ clair conçu sur place, qui fournit une illumination provenant d’une lampe halogène focalisée sur la chambre d’échantillon par un condenseur.

L'image en champ clair est séparée de la lumière laser par un miroir dichroïque, puis projetée sur deux caméras CCD. Une caméra CCD sert de moyen principal d'acquisition de données et est déclenchée par un logiciel afin d'obtenir des fréquences d'échantillonnage précises. L'autre caméra CCD est utilisée pour imager une microbille de référence unique fixée, dont la position constitue un système de contrôle par rétroaction permettant de compenser les dérives du microscope.

L'échantillon est positionné grossièrement par rapport à l'objectif à l'aide d'une platine XY, puis peut être positionné avec précision grâce à une platine piézoélectrique intégrée à trois dimensions. La lumière laser diffusée vers l'avant et transmise est collectée par le condenseur en champ clair et focalisée sur un photodétecteur afin de calibrer la taille de la perle, charger une chambre d'échantillonnage avec une solution dispersée de microsphères de polystyrène de 800 nanomètres de diamètre diluées dans une solution saline tamponnée au phosphate. Laisser reposer pendant 10 à 15 minutes, puis rincer légèrement avec du tampon.

Pour éliminer les microsphères en excès, localisez une microsphère collée aléatoirement au verre de couverture et ajustez la hauteur de la chambre d'échantillon jusqu'à ce que la microsphère se trouve à environ un micromètre en dessous du plan de mise au point. Pour générer une image défocalisée afin de mesurer la taille apparente de l'image à l'aide de LabVIEW, commencez par trouver le centre de la microsphère à l'aide de la fonction de correspondance de motifs géométriques. Ensuite, générez un profil radial d'intensité de la microsphère en faisant la moyenne sur 360 degrés.

Au centre de chaque coupe transversale, ajuster le profil radial, qui correspond à un anneau blanc dans chacune des images en champ clair, à l’aide d’une fonction quadratique. Pour détecter un pic de luminosité, la distance entre ce pic et le centre peut être utilisée comme mesure de la taille apparente de la microbille. À l’aide de la platine piso étalonnée, augmenter progressivement la position axiale de la microbille et acquérir une image à chaque position axiale à l’aide de la caméra CCD. Répéter l’analyse d’image pour chaque image successive afin de corréler la taille apparente de la microbille avec sa position axiale.

La résolution axiale obtenue par cette méthode est d'environ 1,4 nanomètre pour cartographier le potentiel optique du faisceau de manipulation. Commencez par l'alignement colinéaire du faisceau de manipulation et du faisceau d'étalonnage, le faisceau de manipulation étant désactivé. Confiner une microsphère libre dans le piège beaucoup plus rigide du faisceau d'étalonnage. Activez maintenant le faisceau de manipulation.

Étant donné qu'il est beaucoup plus faible que le faisceau de calibration, la position axiale de la microsphère sera légèrement perturbée. La variation résultante de la position axiale peut être mesurée à partir des images en champ clair défocalisées, comme décrit précédemment. Déplacez le foyer axial et répétez, puis tracez le déplacement delta X en fonction de la position axiale du foyer du faisceau de calibration.

La position axiale correspondant au déplacement maximal de la microsphère détermine le centre de la région linéaire du piège optique. Pour étirer un échantillon d'ADN, montez la chambre contenant les molécules d'ADN fixées à la surface, puis, tout en observant l'image en champ clair, placez le foyer du faisceau de manipulation légèrement au-dessus des microsphères non étirées en ajustant la lunette, et ajustez ensuite la position de la platine jusqu'à ce qu'une des microsphères soit piégée. Positionnez approximativement la microsphère au centre du plan XY du piège optique, générez une série d'ondes carrées dans LabVIEW et envoyez-les au déflecteur acousto-optique (AOD) pour activer et désactiver de manière répétée le faisceau laser.

Observez la microsphère pendant que le piège est activé et désactivé de manière répétée. Notez si le laser induit une direction privilégiée du mouvement de la microsphère tout en ajustant itérativement la position de celle-ci dans les directions X et Y. En contrôlant la platine PISO, le mouvement aléatoire de la microsphère devrait devenir isotrope dans le plan X Y, bien qu’il soit nettement restreint lorsque le laser est activé.

Ensuite, alignez la perle dans la direction Z. Pulsatez à nouveau le faisceau laser en mode marche/arrêt, tout en mesurant simultanément le déplacement axial des microsphères en temps réel.

Positionnez la platine au centre de la région linéaire, c'est-à-dire le point où le déplacement en Z est maximal pour étirer la rampe d'ADN, en envoyant un signal de tension à l'ODA, allant de zéro volt à 0,5 volt par paliers de 0,025 volt à chaque étape. Enregistrez 400 images à raison de 100 images par seconde et faites leur moyenne afin d'obtenir le déplacement axial. Enfin, tracez les courbes force-extension et ajustez-les à un modèle de chaîne hélicoïdale modifié.

On voit ici des courbes force-extension pour des séquences d'ADN 2D, de 1, 298 paires de bases et 247 paires de bases de longueur, représentant de courts segments d'ADN. Le modèle classique de la chaîne en forme de ver, ou modèle WLC, n'explique pas entièrement la relation entre la force et l'extension, car à ces échelles de longueur, il faut tenir compte des effets de taille finie et de l'extension à force nulle résultant des contraintes aux limites. Les mesures de force-extension doivent donc être ajustées à l'aide d'un modèle WLC modifié, dont la longueur de persistance effective et l'extension à force nulle sont des paramètres d'ajustement décrits plus en détail dans les documents supplémentaires.

Pour de grandes longueurs de contour de l'ADN-S-D-N-A, la longueur de persistance effective est simplement la longueur de persistance nominale d'environ 50 nanomètres, et l'extension à force nulle peut être négligée dans les ajustements WLC modifiés. Les longueurs de persistance effectives sont de 35 nanomètres pour l'ADN de 1 298 paires de bases et de 25 nanomètres pour l'ADN de 247 paires de bases après son développement. Cette méthode a ouvert la voie à une gamme de mesures nanomécaniques sur l'ADN et les complexes ADN-protéines, y compris une étude des cinétiques de formation et de rupture des boucles d'ADN médiées par des protéines régulatrices.