Colonies sélectionner et isoler de l'homme cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes adultes Reprogrammed

Dans cet article vidéo, des fibroblastes humains adultes sont reprogrammés pour générer des cellules souches pluripotentes à l'aide de vecteurs rétroviraux. Premièrement, les fibroblastes humains sont transduits avec des vecteurs rétroviraux codant pour les facteurs de transcription T three four, SOX two, KLF four et cmic.

Les fibroblastes infectés sont cultivés sur des cellules sécrétrices embryonnaires de souris pendant 14 à 28 jours. Les cultures obtenues sont marquées par l'anticorps TRA 180 1 afin d'identifier les colonies de cellules reprogrammées. Les colonies positives sont ensuite transférées dans des plaques contenant des MEF pour expansion.

La coloration immuno cytochimique confirme l'expression des marqueurs de pluripotence et l'établissement de lignées de cellules souches pluripotentes. D'autres études doivent ensuite être réalisées afin de caractériser davantage ces lignées. En général, les personnes novices en reprogrammation de cellules somatiques et en culture de cellules souches pluripotentes induites humaines éprouvent des difficultés, car il est ardu d'identifier les colonies d'iPS correctes.

Le Dr. Sula Pollak, boursier postdoctoral de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez cette procédure en ensemencant des cellules Phoenix AM FO à une densité d'environ sept à huit millions de cellules par plaque de 10 centimètres dans 10 millilitres de DMEM à haute teneur en glucose, puis placez-les dans l'incubateur et cultivez-les pendant la nuit. Le jour suivant, préparez des mélanges de transfection composés de 12 microgrammes d'un vecteur codant soit pour T three four SOX, deux klf, quatre cmic ou le gène GFP, et de 35 microlitres de few gene six, dans un volume total de 500 microlitres de DMEM à haute teneur en glucose sans sérum et contenant du L-glutamine.

Incuber les mélanges pendant 20 minutes. Ensuite, pour transfecter les cellules phoenix, pipeter délicatement les complexes d'ADN dans les plaques contenant les cellules phoenix, qui doivent être confluentes à 70 à 80 %. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures.

Aspirez le milieu et remplacez-le par huit millilitres de DMEM à haute teneur en glucose contenant des antibiotiques. Replacez ensuite les plaques dans l'incubateur pendant 12 heures après l'incubation. Utilisez une pipette pour aspirer et recueillir le milieu contenant le virus.

Ensuite, remplacez le milieu et répétez ce processus toutes les 12 heures jusqu'à ce que le milieu ait été collecté quatre fois. Conservez le milieu à quatre degrés Celsius. Une fois que l'ensemble du milieu a été récupéré, mélangez toutes les fractions, puis versez-les à travers un filtre à embout de tube de 0,45 micromètre dans un tube conique de 50 millilitres afin d'éliminer les cellules détachées et les débris.

Le milieu filtré, qui contient des particules virales, peut être conservé au réfrigérateur pendant deux semaines sans perte d'activité infectieuse. Le congélation n'est pas recommandée. La veille de la procédure de transduction, décongeler le stock congelé de fibroblastes humains adultes et ajouter une fois 10 à la puissance cinq cellules par puits de plaques de six puits revêtues de gélatine.

Le lendemain, dans un tube conique de 50 millilitres, mélanger 3,5 millilitres chacun de milieu viral T four SOX two, klf four et cmic, puis ajouter du poly brain à une concentration finale de six microgrammes par litre comme témoin. Préparer un millilitre de milieu viral GFP, trois millilitres de milieu de culture et du poly brain à une concentration finale de six microgrammes par millilitre. Aspirer le milieu du plateau contenant les fibroblastes humains.

Ensuite, ajoutez quatre millilitres de milieu viral mixte ou de milieu contrôle, puis centrifugez les plaques à 1600 ×g pendant une heure à 20 °C. Après la centrifugation, incubez les plaques pendant environ 12 heures. Remplacez ensuite le milieu viral par du milieu de culture de fibroblastes et incubez pendant encore 12 heures.

Répéter ce processus depuis l'infection jusqu'à la culture dans le milieu de fibroblastes, deux fois supplémentaires après la dernière infection. Cultiver les fibroblastes dans le DMEM pendant 48 heures. Ensuite, vérifier l'efficacité de l'infection des transductions parallèles avec le milieu rétroviral GFP.

Ensuite, initier la reprogrammation de cellules somatiques en cellules pluripotentes. Les fibroblastes infectés sont cultivés dans un milieu pour cellules souches embryonnaires humaines ou milieu HES, ensemencés avec des fibroblastes embryonnaires de souris ou MEFs à une densité d'environ deux fois 10 à la puissance cinq cellules par puits d'une plaque de six puits traitée à la gélatine, dans le milieu de croissance des fibroblastes le jour suivant.

Divisez les fibroblastes humains infectés à l’aide de trypsine-EDTA à 0,05 % et ensemencez-les à une densité d’environ 1,2 × 10⁴ par puits dans le milieu de croissance des fibroblastes. Le jour suivant, remplacez le milieu par un milieu HES contenant 0,5 millimolaire de butyrate de sodium pendant les sept premiers jours de la reprogrammation.

Changer le milieu chaque jour. Remplacer les milieux par des milieux HES sans butyrate de sodium et poursuivre la reprogrammation pendant sept à 21 jours supplémentaires. Changer le milieu chaque jour, quotidiennement.

Vérifiez les cellules transduites pour détecter d'éventuels changements morphologiques. Des colonies cellulaires commenceront à apparaître environ 10 jours après le transfert des fibroblastes transduits sur les cellules nourricières. Les colonies contenant les cellules reprogrammées sont désormais appelées cellules souches pluripotentes induites humaines ou cellules IPS humaines.

Les colonies de cellules IPS humaines seront prêtes à être isolées entre 14 et 28 jours après leur ensemencement sur les cellules nourricières MEF. À ce stade, les colonies de cellules IPS humaines peuvent être transférées soit sur des plaques contenant des MEF, soit sur des plaques recouvertes de matrigel. Le transfert sur les plaques contenant des MEF est démontré un jour avant la sélection des colonies de cellules IPS humaines : ensemencer des plaques de 24 puits contenant des cellules nourricières MEF irradiées au gamma dans un milieu de croissance des fibroblastes.

Incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 le jour où les colonies de cellules IPS humaines seront sélectionnées. Aspirer le milieu de croissance des fibroblastes des ME Fs et les rincer au PBS pour éliminer toute trace de SBF. Ensuite, ajouter 0,5 millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines ou milieu HES contenant 10 micromolaire d'inhibiteur ROCK Y 2 7 6 3 2 dans chaque puits. Puis, à l'aide d'un microscope monté dans une hotte à flux laminaire, examiner les plaques de reprogrammation pour la formation des colonies de cellules IPS humaines.

Si nécessaire, retirez les fibroblastes entourant les colonies de cellules IPS humaines à l’aide d’une aiguille de calibre 21. Rincez les plaques avec du PBS et ajoutez du milieu HES frais contenant l’anticorps spécifique vivant TRA 180 1. Replacez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2.

Après 30 minutes, remplacez le milieu par du milieu HES frais supplémenté avec un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaire. Ensuite, observez les colonies au microscope à fluorescence. Marquez les colonies positives pour TRA un à 81.

À l’aide d’un marqueur objectif et d’une aiguille de calibre 21, découper les colonies de cellules IPS humaines TRA 180 1 positives en plusieurs petits morceaux. Ensuite, à l’aide d’une pipette automatique, transférer les fragments de colonies de cellules IPS humaines dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant des ME Fs. Éviter de transférer les cellules non IPS.

Placer les plaques dans l'incubateur et laisser les colonies de cellules IPS humaines s'attacher pendant 24 à 36 heures. Changer le milieu quotidiennement. Les colonies de cellules IPS humaines présentant une morphologie correcte de type HE seront visibles 48 heures après le transfert initial sur une plaque de 24 puits. Passager manuellement les colonies de cellules IPS humaines tous les six à huit jours en les découpant avec une aiguille de calibre 21. Étendre les cultures sur une plaque de 12 puits, puis sur une plaque de 6 puits après l'expansion clonale.

Et établir les lignées de cellules IPS humaines afin d'analyser l'expression des marqueurs de pluripotence TRA-1-60, SSEA-4, T-3-4, SOX2 et Nanog par immuno-histochimie une fois les lignées établies. Une caractérisation détaillée peut inclure des analyses de différenciation in vitro et in vivo, une analyse du caryotype, une analyse de la silenciation des transgènes, des études de méthylation et des études d'expression génique.

Une transduction efficace avec un milieu contenant un rétrovirus est essentielle pour une reprogrammation réussie afin de déterminer l'efficacité de la transduction virale. Des fibroblastes humains adultes provenant d'un patient atteint d'ataxie de Friedreich ont été visualisés après deux infections consécutives avec un milieu rétroviral GFP ; lorsque les fibroblastes étaient infectés par une simple incubation avec le milieu viral, moins de 20 % des cellules étaient transduites. Toutefois, lorsque l'ajout du milieu rétroviral GFP était immédiatement suivi d'une centrifugation, l'efficacité de la transduction augmentait de manière spectaculaire.

Ici, plus de 80 % des cellules sont transduites afin de procéder à une caractérisation initiale des colonies de cellules IPS humaines isolées. L'expression des marqueurs de pluripotence caractéristiques des cellules ES humaines a été évaluée par immunochimie, comme illustré ici. Les colonies de cellules IPS humaines isolées étaient positives pour les marqueurs de pluripotence.

T trois quatre SOX deux nano SSEA quatre et ADN TRA un soixante. La coloration par immunofluorescence avec DPI, illustrée sur les panneaux supérieurs, est détectée à la fois dans les colonies de cellules IPS humaines et dans les cellules d'alimentation. Ces résultats démontrent que les cellules IPS humaines obtenues à l'aide de ce protocole de reprogrammation expriment des marqueurs de pluripotence appropriés, caractéristiques des cellules souches pluripotentes humaines non différenciées.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment reprogrammer avec succès des fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes à l’aide d’une transduction rétrovirale, identifier correctement les colonies de cellules souches pluripotentes humaines et réaliser la caractérisation initiale des IPSH.