Colonies sélectionner et isoler de l'homme cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes adultes Reprogrammed

Dans cet article vidéo, des fibroblastes humains adultes sont reprogrammés pour générer des cellules souches pluripotentes à l’aide de vecteurs rétroviraux. Tout d’abord, les fibroblastes humains sont transduits à l’aide de vecteurs rétroviraux codant pour les facteurs de transcription. T trois quatre, SOX deux, KLF quatre et cmic.

Les fibroblastes infectés sont cultivés sur des cellules nourricières embryonnaires de souris pendant 14 à 28 jours. Les cultures résultantes sont colorées avec l’anticorps TRA 180 1 pour identifier les colonies de cellules reprogrammées. Les colonies positives sont ensuite transférées sur des plaques contenant des MEF pour l’expansion.

La coloration immunochimique confirme l’expression de marqueurs de pluripotence et l’établissement de lignées de cellules souches pluripotentes. Des études complémentaires devraient ensuite être effectuées pour caractériser davantage les lignes. En général, les individus novices dans la programmation des cellules somatiques et les cultures de cellules souches pluripotentes induites par l’homme auront du mal car il est difficile d’identifier les colonies IPSC correctes.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Sula Pollak, post-docteur O Fellow de mon laboratoire. Commencez cette procédure en plaquant des cellules Phoenix AM FO à une densité d’environ sept à 8 millions de cellules par plaque de 10 centimètres dans 10 millilitres de DMEM à haute teneur en glucose, placez-les dans l’incubateur et cultivez-les pendant la nuit. Le lendemain, préparez des mélanges de transfection composés de 12 microgrammes d’un vecteur codant soit T trois, quatre gènes SOX, deux klf, quatre gènes cmic ou GFP et 35 microlitres peu de gène six dans un volume total de 500 microlitres de DMEM à haute teneur en glucose sans sérum avec L glutamine.

Incuber les mélanges pendant 20 minutes. Ensuite, pour transfecter les cellules de phénix, pipetez doucement les complexes d’ADN dans les plaques contenant les cellules de phénix, qui doivent être confluentes à 70 à 80 %. Incuber les cellules à 37 degrés centigrades après six à huit heures.

Aspirez le milieu et remplacez-le par huit millilitres de DMEM à haute teneur en glucose avec des antibiotiques. Remettez ensuite les plaques dans l’incubateur pendant 12 heures après l’incubation. À l’aide d’une pipette, aspirez et recueillez le milieu contenant le virus.

Remplacez ensuite le milieu et répétez ce processus toutes les 12 heures jusqu’à ce que le milieu ait été collecté quatre fois. Stockez le milieu à quatre degrés centigrades. Une fois que tout le milieu a été collecté, combinez toutes les portions, puis versez-le à travers un filtre supérieur à tube de 0,45 micromètre dans un tube conique de 50 millilitres pour éliminer les cellules détachées et les débris.

Le milieu filtré, qui contient des particules virales, peut être conservé au réfrigérateur pendant deux semaines sans perdre d’activité infectieuse. La congélation n’est pas recommandée. La veille de la procédure de transduction, décongelez le stock congelé de fibroblastes humains adultes et ajoutez une fois 10 à la cinquième cellule par chaque puits de six plaques recouvertes de gélatine.

Le lendemain, dans un tube conique de 50 millilitres, combinez 3,5 millilitres chacun de T quatre SOX deux, klf quatre et milieu viral cmic, et ajoutez du poly cerveau à une concentration finale de six microgrammes par litre comme contrôle. Préparez un millilitre de milieu viral GFP, trois millilitres de milieu de culture, moyen et poly cerveau à une concentration finale de six microgrammes par millilitre. Aspirez le milieu de la plaque contenant les fibroblastes humains.

Ajoutez ensuite quatre millilitres de milieu viral mixte ou de milieu témoin, centrifugez les plaques à 1600 G pendant une heure à 20 degrés centigrades après la centrifugation. Incuber les plaques pendant environ 12 heures. Remplacez ensuite le milieu viral par un milieu de culture de fibroblastes et incubez pendant 12 heures supplémentaires.

Répétez ce processus de l’infection à la culture dans un milieu de fibroblastes, deux fois de plus après la dernière infection. Cultivez les fibroblastes dans du DMEM pendant 48 heures. Vérifiez ensuite l’efficacité de l’infection des transductions parallèles avec le milieu rétroviral GFP.

Ensuite, pour initier la reprogrammation des cellules somatiques aux cellules pluripotentes. Les fibroblastes infectés sont cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires humaines ou dans un milieu HES, des embryons de souris, des fibroblastes ou des MEF à une densité d’environ deux fois 10 à la cinquième cellule par puits de gélatine traitée. Plaque à six puits dans le milieu de croissance des fibroblastes le lendemain.

Divisez les fibroblastes humains infectés à l’aide de 0,05 % de tripsine EDTA et ensemencez-les à la densité d’environ 1,2 fois 10 puissance quatre par puits dans le milieu de croissance des fibroblastes. Le lendemain. Remplacer le milieu par un milieu HES contenant 0,5 millimolaire de butyrate de sodium pendant les sept premiers jours de la reprogrammation.

Changez de support tous les jours. Remplacez le milieu par un milieu HES sans butyrate de sodium et poursuivez la reprogrammation pendant sept à 21 jours supplémentaires. Changez de milieu tous les jours chaque jour.

Vérifiez que les cellules transduites ne présentent pas de changements morphologiques. Les colonies de cellules commenceront à émerger environ 10 jours après le transfert des fibroblastes transduits sur les cellules nourricières. Les colonies contenant les cellules reprogrammées sont maintenant appelées cellules souches pluripotentes induites humaines ou cellules IPS humaines.

Les colonies de cellules IPS humaines seront prêtes à être isolées dans 14 à 28 jours après leur placage sur les cellules nourricières MEF. À ce stade, les colonies de cellules IPS humaines peuvent être transférées sur des plaques contenant du MEF ou recouvertes de matrigel. Le transfert sur les plaques contenant des MEF est démontré un jour avant la cueillette des colonies de cellules IPS humaines Seed 24 plaques de puits contenant des cellules nourricières MEF rayonnées gamma dans un milieu de croissance de fibroblastes.

Incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 le jour où les colonies de cellules IPS humaines seront cueillies. Aspirez le milieu de croissance des fibroblastes des ME F et rincez-les avec du PBS pour éliminer toute trace de FBS. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de cellules souches embryonnaires humaines ou de milieu HES contenant 10 inhibiteurs de roche micromolaires Y 2 7 6 3 2 dans chaque puits puis, à l’aide d’un microscope monté dans une hotte à flux laminaire, examinez les plaques de reprogrammation pour la formation de la colonie de cellules IPS humaines.

Si nécessaire, retirez les fibroblastes entourant les colonies de cellules IPS humaines avec une aiguille de calibre 21. Rincez les plaques avec du PBS et ajoutez un milieu HES frais contenant l’anticorps spécifique TRA 180 1 stain alive. Remettez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés centigrades avec 5 % de CO2.

Après 30 minutes, remplacez le milieu par un milieu HES frais complété par un inhibiteur de roche à 10 micromolaires. Ensuite, observez les colonies au microscope fluorescent. Marquer TRA une à 81 colonies positives.

À l’aide d’un marqueur d’objectif à l’aide d’une aiguille de calibre 21. Coupez les colonies de cellules IPS humaines positives TRA 180 1 en plusieurs petits morceaux. Ensuite, à l’aide d’une pipette automatique, transférez des fragments de colonies de cellules IPS humaines dans des puits individuels de la plaque à 24 puits avec des ME F.Évitez de transférer des cellules non IPS.

Placez les plaques dans l’incubateur et laissez les colonies de cellules IPS humaines se fixer pendant 24 à 36 heures, en changeant de milieu par jour. Les colonies de cellules IPS humaines avec une morphologie correcte de type HE seront visibles 48 heures après le transfert initial sur une plaque à 24 puits à passage manuel des colonies de cellules IPS humaines tous les six à huit jours en les coupant avec une plaque à aiguille de calibre 21. Expansion des cultures sur une plaque à 12 puits et par la suite sur une plaque à six puits après expansion clonale.

Et l’établissement des lignées cellulaires IPS humaines analyse l’expression des marqueurs de pluripotence TRA un, 60 SSEA quatre, T trois, quatre SOX deux et nanog en utilisant l’immunochimie une fois que les lignées ont été établies. La caractérisation détaillée peut se faire in vitro et in vivo. Analyse de différenciation, analyse de caryotype, analyse des études de méthylation du silençage des transgènes et études d’expression génique.

Une transduction efficace avec un milieu contenant des rétrovirus est essentielle pour une reprogrammation réussie afin de déterminer l’efficacité de la transduction virale. Des fibroblastes humains adultes dérivés d’un patient atteint d’ataxie de Friedrichs ont été visualisés après deux infections consécutives avec un milieu rétroviral GFP lorsque les fibroblastes ont été infectés par simple incubation avec un milieu viral, moins de 20 % des cellules sont transduites. Cependant, lorsque l’ajout du milieu rétroviral GFP a été immédiatement suivi par l’efficacité de la transduction a été considérablement augmentée.

Ici, plus de 80 % des cellules sont transduites pour effectuer une caractérisation initiale des colonies de cellules IPS humaines isolées. L’expression des marqueurs de pluripotence caractéristiques des cellules ES humaines a été évaluée par immunochimie, comme le montre ici. Des colonies isolées de cellules IPS humaines étaient positives pour les marqueurs de pluripotence.

T trois, quatre, SOX, deux nano, SSEA quatre, et TRA, un 60 ADN. La coloration par DPI indiquée sur les panneaux supérieurs est détectée à la fois dans les colonies de cellules IPS humaines et dans les cellules nourricières. Ces résultats démontrent que les cellules IPS humaines obtenues à l’aide de ce protocole de reprogrammation expriment des marqueurs de pluripotence appropriés caractéristiques des cellules souches pluripotentes humaines indifférenciées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reprogrammer avec succès un fibroblaste humain en cellules souches pluripotentes à l’aide d’une transaction rétrovirale identifiée correctement induc humaine, des colonies de cellules souches pluripotentes, et d’effectuer une caractérisation initiale des CP HI