Populations cellulaires Caractérisation électrophysiologique des exprimant la GFP dans la rétine intacte

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les réponses à la lumière et la morphologie de neurones individuels dans la rétine intacte en utilisant une lignée de souris exprimant un marqueur fluorescent exclusivement dans des types cellulaires spécifiques. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant l'œil pour obtenir une rétine isolée. La deuxième étape consiste à placer la rétine sous un microscope à balayage laser et à visualiser une cellule par excitation infrarouge à deux photons.

Une micropipette est ensuite utilisée pour obtenir une configuration de patch-clamp en mode cellule entière afin d'effectuer l'enregistrement et le remplissage avec un colorant. En fin de compte, ce montage permet d'enregistrer les réponses cellulaires à une stimulation lumineuse et de révéler la morphologie de la cellule enregistrée par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'enregistrement en patch-clamp non guidé à partir de la rétine, est que l'enregistrement peut être dirigé visuellement vers une cellule marquée de manière fluorescente sans stimuler la rétine avec la lumière d'excitation.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur la rétine, comme quelle est la contribution d'une population cellulaire donnée au traitement de l'information visuelle ? Même si la population cellulaire présente une faible densité et ne possède aucune caractéristique morphologique distincte pouvant faciliter son identification. Commencez cette expérience en adaptant la souris à l'obscurité pendant au moins trois heures avant l'expérience.

Entre-temps, préparez la solution extracellulaire comme décrit dans le manuscrit accompagnant et faites-la barboter avec du carbogène à température ambiante. Ensuite, sacrifiez la souris et énucléez les yeux à l’aide d’une paire de ciseaux courbes pour iris. Transférez-les dans une boîte contenant la solution extracellulaire.

Ensuite, placez-le sous un microscope stéréoscopique équipé d'une paire de ciseaux à ressort. Retirez la cornée et le corps ciliaire en ouvrant le globe oculaire le long de la ligne serrata. Retirez le cristallin et séparez soigneusement la rétine de l'épithélium pigmentaire.

Ensuite, sectionner le nerf optique entre la rétine et l'épithélium pigmentaire. Retirer la rétine de la cupule oculaire. Remarquer que l'intérieur de la rétine enroulée correspond au côté des cellules ganglionnaires.

L'extérieur correspond au côté des photorécepteurs. Ensuite, retirez le vitré de la surface rétinienne interne en le tirant doucement à l'aide d'un cure-dent en bois. Puis effectuez de courtes incisions le long du périmètre de la rétine afin de faciliter l'aplanissement du tissu.

Ensuite, transférez la rétine dans la chambre d'enregistrement avec le côté des photorécepteurs vers le bas. Étalez-la sur le fond en verre à l'aide d'un pinceau fin et immobilisez-la avec un cadre en acier inoxydable muni de fils de nylon. Placez la chambre d'enregistrement dans l'obscurité sous un microscope à balayage laser droit.

Superfusez continuellement la préparation rétinienne à un débit d'au moins cinq millilitres par minute. À l’aide d’une solution extracellulaire oxygénée au carbone et chauffée à 35 degrés Celsius, le microscope est placé sur une table anti-vibrations à coussin d’air située à l’intérieur d’une cage de Faraday. Pour le blindage électronique, recouvrez la cage d’un rideau opaque afin de maintenir l’obscurité autour de la préparation.

Nous bloquons également la lumière provenant des écrans d'ordinateur à l’aide de films transparents rouges. Réglez le laser infrarouge sur une longueur d’onde comprise entre 850 et 870 nanomètres ou supérieure. Passez en condition de verrouillage de mode et utilisez une excitation à deux photons pour visualiser les cellules exprimant la GFP.

Pour l'enregistrement en configuration « patch clamp », remplissez des micropipettes en verre borosilicaté avec la solution intracellulaire contenant une sonde fluorescente, comme décrit dans le manuscrit associé. Insérez ensuite la micropipette dans le porte-électrode. Assurez-vous que l'électrode de référence est en contact avec la solution extracellulaire dans la chambre d'enregistrement.

Ensuite, appliquez une pression sur la micropipette visant une cellule exprimant la GFP à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau de 40 fois. Les corps cellulaires des Omicron se situent dans la couche des cellules ganglionnaires ainsi que dans la partie proximale de la couche interne, avant que la micropipette n’entre en contact avec la cellule ciblée et ne pénètre la membrane limitante interne à la surface rétinienne. La pénétration réussie est reconnue par la solution intracellulaire expulsée par l’extrémité de la micropipette et le détachement de la membrane limitante interne des tissus rétiniens sous-jacents. Le colorant fluorescent présent dans la solution intracellulaire peut révéler la position de la micropipette sur l’image à deux photons lors de l’approche de la cellule souhaitée.

Ensuite, relâchez la pression exercée par la micropipette et obtenez une configuration de patch-clamp en mode cellule entière. En mode courant constant, un enregistrement utilisable doit présenter un potentiel membranaire compris entre moins 50 et moins 55 millivolts et durer au moins 20 minutes. Après cela, présentez les stimuli visuels créés sur un écran d'ordinateur.

Réglez l'intensité du stimulus en insérant des filtres neutres dans le trajet du faisceau et ajustez la position spatiale du stimulus au centre de la cellule enregistrée. Ensuite, démarrez le protocole de stimulation et enregistrez les réponses à la lumière. Utilisez le générateur de stimulus pour déclencher le logiciel d'enregistrement.

Inclure une photodiode dans le trajet du faisceau afin de conserver un enregistrement du moment du stimulus. Faire attention à ne pas extraire le corps cellulaire lors du retrait de la micropipette. Lorsque cela est effectué pour le remplissage avec le colorant, laisser l'agent fluorescent diffuser dans la cellule enregistrée pendant 30 à 45 minutes.

Voici un exemple de cellules exprimant la GFP dans une préparation rétinienne plate sous leur promoteur pour la tyrosine hydroxylase. Deux populations peuvent être distinguées par l'intensité du signal GFP. Les cellules dopaminergiques de type un, situées dans la couche interne, expriment une faible fluorescence, comme indiqué par les pointes de flèches. Sur la figure A, les cellules de type deux sont fortement marquées et possèdent des corps cellulaires soit dans la couche, comme indiqué par les flèches sur la figure A, soit déplacés dans la couche des cellules ganglionnaires, comme montré sur la figure B. La figure C montre une stratification dendritique des cellules de type deux dans la strate trois de la couche plexiforme interne ; voici un exemple de la morphologie d'une cellule de type deux injectée avec le traceur neurobiotine.

Le traceur a ensuite été visualisé par liaison à une streptavidine marquée par un fluorochrome, indiquée ici en magenta. Voici différents profils de réponse d'une cellule de type deux située dans la couche des cellules ganglionnaires, en réponse à une lumière blanche. Un stimulus prolongé de trois secondes a été utilisé afin de mieux distinguer les composantes de la réponse au stimulus, en début et en fin d'application, suite à cette procédure.

D'autres méthodes, telles que des expériences pharmacologiques, l'imagerie calcique ou l'immunochimie, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le rôle fonctionnel d'un type cellulaire donné dans les circuits rétiniens.