Name: Populations cellulaires Caractérisation électrophysiologique des exprimant la GFP dans la rétine intacte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Découvrez l'enregistrement patch-clamp ciblé de neurones fluorescents dans la rétine intacte de souris. Cette méthode combine excitation infrarouge à deux photons et microscopie confocale pour étudier les réponses visuelles et la morphologie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 à KD et RW). Nous sommes reconnaissants à Thomas d&#39;Euler (Töbingen, Allemagne) pour le QDS la lumière du logiciel de stimulation.

La description suivante suppose que l'expérimentateur a une compréhension de base de la structure de la rétine, patch-clamp, et microscopie à deux photons. Pour plus d'informations utiles sur l'établissement et l'exécution d'un setup de patch-clamp et le système d'imagerie à deux photons voir les références [7-12]. 1. Des animaux et de préparation des tissus <ol><li> Gardez la souris adaptés à l'obscurité pendant au moins 3 h. En attendant, préparez 1-2 L de solution extracellulaire constituée d'(en mm) 125 NaCl, KCl 2,5, CaCl 2 1, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucose et s'équilibrer à pH 7,4 par gazage au carbogène (5% de CO 2 en O 2) à température ambiante. </li> d'un <li> Euthanasier la souris dans une chambre étanche à l'air par le CO 2 surdose suivie par dislocation cervicale. Cette procédure et les étapes suivantes doivent être effectuées dans l'obscurité. Utilisez dim longueur d'onde d'illumination (nous bloquons courtes longueurs d'onde d'une source de lumière froide par un 690 nm-longpass filtre) pour appuyer la vision personnelle tout en gardant les yeux de l'animal adaptés à l'obscurité (les souris ont une mauvaise vue que dans la partie rouge du spectre lumineux). Pour travailler dans l'obscurité d'illumination utilisation complète infrarouge (&gt; 800 nm) et l'usure lunettes de vision nocturne. </li><li> Énucléer les yeux avec une paire de ciseaux à iris courbes et les transférer à un plat de solution extracellulaire placé sous un microscope à dissection. </li><li> Retirez la cornée et le corps ciliaire par l'ouverture de l'ampoule oeil le long de la ora serrata (la frontière entre la rétine et du corps ciliaire) avec une paire de ciseaux à ressort (nous utilisons d'abord une lancette pour percer un point de départ pour la coupe). Sortez de la lentille et de séparer soigneusement la rétine de l'épithélium pigmentaire. Si l'orientation de la rétine est crucial pour votre étude, indiquent comme ça, en référence [12]. Couper le nerf optique entre la rétine et l'épithélium pigmentaire de la rétine et de supprimer de l'œilleton. Notez la direction de la surface rétinienne: l'intérieur de la rétine lovée est le Ganglcôté pile ion; l'extérieur est le côté photorécepteur. </li><li> Enlever le vitré de la surface intérieure de la rétine par le tirant doucement hors à l'aide d'un cure-dent en bois. Pour ce faire, utilisez un petit volume de solution extracellulaire qui couvre juste la rétine. Les bâtons vitreux à le cure-dents et peut être traîné par centrifugation sur la rétine. Puis, appliquez courtes incisions le long du périmètre pour faciliter la rétine aplatissement du tissu. </li><li> Transfert de la rétine dans la chambre d'enregistrement des photorécepteurs vers le bas, l'étaler sur le fond de verre (nous utilisons un pinceau fin) et l'immobiliser avec un châssis de nylon tendus en acier inoxydable. Préparer la rétine seconde de la même manière et le garder adaptés à l'obscurité dans la solution extracellulaire carboxygenated pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 2. Enregistrements <ol><li> Installez la chambre d'enregistrement dans les ténèbres sous un microscope laser verticale de numérisation et de la préparation superfuse rétine en permanence (pas moins de 5 ml / min) avec la solution extracellulaire carboxygenated chauffée à 35 ° C. Le microscope (également équipé d'une caméra infrarouge sensible CCD) est situé sur un amortisseur de table de l'air intérieur d'une cage de Faraday pour la protection électronique. Couvrir la cage avec un rideau opaque pour maintenir la préparation dans l'obscurité. Nous avons également l'écran de la lumière à partir des écrans d'ordinateur par un film transparent rouge. </li><li> Réglez le laser infrarouge pour 850-870 nm ou plus des longueurs d'onde, de passer en mode verrouillage de l'état et l'utilisation excitation à deux photons pour visualiser exprimant la GFP cellules. Atténuer la sortie du laser à l'aide de filtres de densité neutre contrôlé par le logiciel de numérisation laser, jusqu'à un degré qui est juste suffisante pour une reconnaissance claire de la cellule fluorescente </li><li> Pour les enregistrements de patch-clamp dans le mode actuel micropipettes-clamp en verre (nous utilisons des tubes en verre borosilicate de 1,5 mm de diamètre extérieur et 0,225 mm d'épaisseur) rempli avec une solution composée de intracellulaires (en mm) 125 K-gluconate, 10 KCl, 0,5 EGTA 10, HEPES, titrée à pH 7,4 avec KOH (donnant une résistance pipette d'environ 5 MW). Notez que d'autres conditions expérimentales comme la tension-clamp nécessite une solution différente. Si les injections de colorant sont désiré, ajouter une sonde fluorescente (nous utilisons 10 mM Alexa Fluor 594) ou une molécule traceur (3% Neurobiotin). Insérez la micropipette dans le support et s'assurer que l'électrode de référence (fil d'argent chlorés) est en contact avec la solution extracellulaire dans la chambre d'enregistrement. </li><li> Appliquer une pression à la micropipette et de cibler une cellule exprimant la GFP (nous utilisons un objectif de 40 fois l'eau d'immersion; NA 1,25). Corps cellulaires amacrines sont situés dans la couche des cellules ganglionnaires (directement sous la surface dans l'orientation actuelle de la rétine) ainsi que dans la partie proximale de la couche nucléaire interne (environ 55 à 75 um profondément dans la préparation). Avant le contact avec la cellule micropipette ciblées, la membrane limitante interne (une gaine faite de cellules gliales endfeet) à la rétinesurface doit être pénétré. Pénétration réussie est reconnue par la solution intracellulaire qui est chassé de la pointe de micropipette et se détache de la membrane limitante interne de la rétine tissus sous-jacents que l'on peut observer sur une image infrarouge en transmission capturée par la caméra IR-CCD. </li><li> Approche de la cellule souhaitée en comparant la position soma de l'image à deux photons avec l'image de la caméra IR-CCD montrant la position de la micropipette enregistrement. Notez que cette étape n'est pas facile à réaliser et nécessite une certaine pratique, car la cellule exprimant la GFP doit être reconnu à l'image de transmission infrarouge afin de diriger la micropipette vers elle. Ciblage correct est atteint lorsque la pointe micropipette causes de capitons de la surface cellulaire qui peut être vu dans l'image à deux photons. Alternative à cette procédure, utilisez un colorant fluorescent (par exemple, Alexa Fluor 594, 100 pM) dans la solution intracellulaire de révéler la position micropipette dans l'image à deux photons. Excitation à deux photons infrarouges permet de fluorescence suffisante de ce colorant pour rendre la micropipette perceptible. Pour ce faire, réglez la plage de détection du logiciel de numérisation laser pour couvrir également la fluorescence rouge. </li><li> Communiqué de la pression de la micropipette et obtenir une cellule entière de patch-clamp de configuration dans le courant-clamp mode. Un enregistrement exploitable devrait donner un potentiel de membrane de -50 à -55 mV et durer au moins 20 min. </li><li> Présent stimuli visuels créés par un logiciel de stimulation (nous utilisons QDS par Thomas d'Euler, Université de Tübingen, Allemagne) 11 sur un écran d'ordinateur. Ajustez la position spatiale de la stimulation à être centré sur la cellule enregistrés: Marquer la position de la cellule sur le moniteur montrant l'image de transmission de la caméra IR-CCD et un centre de stimulation place, comme sur celle-ci. Tune l'intensité du stimulus en insérant filtres de densité neutre dans le trajet du faisceau. Pour l'étalonnage du spectre de surveiller et de l'intensité voir réf [14]. Choisir un Prolonged interstimulus intervalle (par exemple 15 s) afin d'éviter d'adaptation. Inclure une photodiode dans le trajet du faisceau de garder une trace du timing de relance. </li><li> Démarrez le protocole de stimulation et d'enregistrer les réponses de lumière (nous utilisons un taux d'échantillonnage de 10 kHz avec un filtrage à 5 kHz pour les non-dopage cellules; pour l'enregistrement de pic un taux plus élevé d'échantillonnage de 20 kHz, comme il est recommandé). Utilisez le logiciel stimulation lumineuse pour déclencher le logiciel d'enregistrement. </li><li> Pour le remplissage de colorant laisser le diffuse agent fluorescent dans la cellule enregistrée pendant 30-45 min avant attentivement rétractant la micropipette de la cellule. Prenez soin de ne pas sortir le corps de la cellule. Si le non-fluorescent traceur Neurobiotin a été utilisé, il doit la visualisation en se liant à la streptavidine conjuguée à un fluorophore (nous utilisons la streptavidine-Cy3, 1:400 pendant la nuit à 4 ° C après 20 min de fixation paraformaldéhyde de la rétine; pour le colorant de couplage Des études streptavidine incubation peut être prolongée à 3 d). Alternativement, les injections peuvent aussi être réalisées avecélectrodes forte (&gt; 100 MQ) lorsque le colorant est entraîné par iontophorèse dans la cellule empalé (impulsions rectangulaires: de 0,25 à 1 nA, 100 ms, l'intervalle de 100 ms, temps total 3-6 min). </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Les résultats suivants proviennent d'une étude sur les souris exprimant une protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur de la tyrosine hydroxylase 13,14, l'enzyme catalysant l'étape limitante dans la synthèse des catécholamines (TH:: GFP souris). Basé sur la luminosité des deux signaux GFP-populations de cellules distinctes se distinguent (figure 2A). Les cellules exprimant le niveau supérieur GFP possèdent des corps cellulaires situés dans la couche nucléaire interne (INL, figure 2A) ou déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires (GCL, figure 2B) et stratifier au milieu de la couche interne plexiforme (IPL, figure 2C) . Ils ont été identifiés comme des cellules de type 2 14-16 et pourraient être systématiquement étudiés par rapport à la morphologie (figure 3) et élireriques d'activité (figure 4), même si sa densité de population ne s'élève qu'à 250 cellules / mm 2. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Représentation schématique du dispositif expérimental. Excitation à deux photons (rouge trajet de la lumière en pointillés) du fluorophore cellules exprimant dans la rétine intacte permet visuelle ciblage par une micropipette (chemin vert émission de lumière). La rétine est soumis à des stimuli optiques projetée à travers le condenseur du microscope (trajet de la lumière jaune), et les réponses cellulaires légers sont enregistrés. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. GFP cellules exprimant dans un flatmount rétinienne d'un TH:: la souris GFP. Deux populations peuvent être distinguées par l'éclat de la GFP-signal: le type 1 (cellules DA), situé à l'INL montrant une faible fluorescence (A, voir flèches) et le type intensément marquées 2 cellulesavec les corps cellulaires, soit dans l'INL (A, voir flèches) ou déplacées dans la GCL (B) et une stratification dendritiques dans la strate S3 de l'IPL (C). Barres d'échelle, 50 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Morphologie d'un type 2 de cellules injectées avec le Neurobiotin traceur. Le traceur est ensuite visualisé par streptavidine-Cy3 contraignant (magenta). La micrographie, qui est également représentant le signal GFP (green), est une projection de piles d'images couvrant la GCL et l'IPL. La barre d'échelle, 50 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Lumière des réponses d'une cellule de type 2 situé dans le GCL. Modèle de réponse à la lumière blanche plein champ d'illumination d'intensité croissante dans la gamme scotopique. L'intensité du stimulus est donné dans photoisomerizations par canne par seconde (Rh * / tige / s). Un stimulus prolongé de 3 s a été utilisé pour une meilleure distinctesions des éléments de réponse au début du stimulus (sur la réponse) et offset (OFF réponse).

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<li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li>
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<li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li>
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</ol>

Les souris ont été traitées et euthanasiés conformément aux directives institutionnelles pour la protection des animaux et les lois sur l&#39;expérimentation animale délivré par le gouvernement allemand.

Cette méthode offre la possibilité d&#39;étudier les propriétés électriques des neurones spécifiques de la rétine intacte sous guidage visuel sans influencer la condition d&#39;adaptation de la rétine. Il est particulièrement adapté pour la caractérisation des cellules qui sont à présent assez mal étudiés en raison de la faible densité démographique, comme la plupart des populations de cellules amacrines. Excitation à deux photons permet l&#39;imagerie à haute résolution et haut contraste même de parties plus profondes du tissu 17, une condition préalable pour un ciblage précis et réussi le patch-clamp de cellules en particulier dans l&#39;INL avec sa forte densité de corps cellulaires. La rétine de souris isolé est viable pour les 3-4 h dans les conditions expérimentales. Si la rétine seconde est stocké dans l&#39;obscurité totale dans le gazage carbogène continue, il conserve la couleur pourpre du photopigment écrus et peut être utilisé après avoir terminé les expériences avec la rétine en premier. Au début, en ciblant lescellule sélectionnée à la micropipette dans la rétine wholemount est un peu difficile et requiert une certaine pratique, surtout quand on travaille dans l&#39;obscurité. Incluant un colorant fluorescent dans la micropipette peut simplifier la procédure, car la cellule et micropipette sont visibles sous excitation à deux photons dans le même temps. Toutefois, l&#39;ajout de composants de la solution intracellulaire peut entraver la formation ou de causer gigaseal la qualité d&#39;enregistrement à souffrir. Une fois réalisée avec succès, un bon enregistrement peut durer pendant environ 1 h. Alors que la lumière d&#39;excitation infrarouge lui-même est seulement mal absorbée par les photorécepteurs rétiniens, excité exprimant la GFP cellules émettent de la lumière dans la partie visible du spectre. Toutefois, les fluorophores sont excités seulement dans un petit volume focal qui n&#39;est pas susceptible de modifier la condition d&#39;adaptation de la rétine. D&#39;autant plus, l&#39;excitation est nécessaire seulement pour le ciblage et peut être désactivée pendant l&#39;enregistrement des réponses de lumière. Le usefulnESS de cette approche est déjà démontré par des études sur des populations spécifiques de cellules amacrines 14,18 à partir de laquelle des enregistrements électrophysiologiques, autrement, aurait été possible que par accident 12. Enfin, cette technique puissante peut encore être prolongée par une approche pharmacologique incluant 14, Ca 2 + imagerie 19 ou en utilisant des cellules injectées pour des études immunocytochimiques ou la microscopie électronique. De cette façon, la position fonctionnelle d&#39;un type cellulaire donné dans le circuit de la rétine peut être démêlé.

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactif / Equip-ment </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Lunettes de vision nocturne </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Allemagne </td><td> Xtron F1 </td><td> comprend une source de lumière à 800 nm </td></tr><tr><td> Filtre optique </td><td> Schott, Mayence, Allemagne </td><td> RG9 </td><td> longpass filtre avec coupure à 690 nm </td></tr><tr><td> Ciseaux Iris </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14061-09 </td><td> courbé avec lame 22 mm </td></tr><tr><td> Ciseaux de printemps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-00 </td><td> droite avec 3 lames mm </td></tr><tr><td> Chambre d&#39;enregistrement </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Allemagne </td><td> 200 à 100 500 0180 type A (TC) </td><td> Teflon chambre avec fond monté sur lamelle de verre (environ 0,15 mm, n ° 200-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Chauffe-eau </td><td> Systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne </td><td> PH01, TC01 </td><td> canule de perfusion chauffable avec la température scontrôleur de température et Ensor </td></tr><tr><td> Microscope à balayage laser </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM EPA </td><td> contrôlée par Leica Confocal Software </td></tr><tr><td> Air de table </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Mode verrouillé tsunami Ti: saphir au laser </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> BCP SA, Kelheim, Allemagne </td><td> PixelFly QE </td><td> y compris les logiciels de contrôle </td></tr><tr><td> Micropipette de verre capillaires </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Allemagne </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette extracteur </td><td> Instrument Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> colorant fluorescent </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> non fluorescent traceur </td></tr><tr><td> Streptavidine-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Allemagne </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motorisée Mini25 unité de manipulateur avec affichage SM-5 </td></tr><tr><td> Amplificateur de patch-clamp </td><td> npi electronic GmbH, Tamm, Allemagne </td><td> SEC-05LX npi </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acquisition de données du logiciel WinWCP </td><td> John Dempster, Université de l&#39;Ecosse, Glasgow, Royaume-Uni </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> QDS générateur de stimulus visuel </td><td> Thomas Euler, Université de Tübingen, Allemagne </td><td></td><td> doit être exploité sur un ordinateur séparé la commande de 2 moniteurs (interface utilisateur, relance le moniteur) </td></tr><tr><td> Les filtres neutres </td><td> ITOS, Mainz, Allemagne </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

populations cellulaires caractérisation électrophysiologique des exprimant la gfp dans la rétine intacte

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Étudier les propriétés physiologiques et les connexions synaptiques des neurones spécifiques dans le tissu intact est un défi pour les cellules qui manque flagrant caractéristiques morphologiques ou afficher une faible densité de population. Ceci s&#39;applique particulièrement aux cellules amacrines rétiniennes, une classe exceptionnelle multiformes des interneurones qui composent environ 30 sous-types de mammifères 1. Bien qu&#39;étant une partie cruciale de la transformation visuelle par la rétine façonner la sortie 2, la plupart de ces sous-types n&#39;ont pas été étudiés jusqu&#39;à présent, dans un contexte fonctionnel parce rencontrer ces cellules avec une électrode d&#39;enregistrement est un événement rare. Récemment, une multitude de lignées de souris transgéniques est disponible qui expriment des marqueurs fluorescents comme la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de promoteurs pour les récepteurs membranaires ou des enzymes qui sont spécifiques à un sous-ensemble de neurones dans un tissu donné 3,4. Ces cellules pré-étiquetés sont donc accessible à microélectrode dirigé ciblant sous contrôle microscopique, permettant l&#39;étude systématique de leurs propriétés physiologiques in situ. Cependant, l&#39;excitation des marqueurs fluorescents est accompagné par le risque de phototoxicité pour les tissus vivants. Dans la rétine, cette approche est entravé par le problème que la lumière d&#39;excitation provoque une stimulation appropriée des photorécepteurs, infligeant ainsi photopigment blanchiment et le transfert des circuits rétiniens dans un état de lumière adaptés. Ces inconvénients sont surmontés en utilisant une excitation à infrarouge livré par un mode bloqué au laser dans de courtes impulsions de la gamme femtoseconde. D&#39;excitation à deux photons fournit suffisamment d&#39;énergie pour l&#39;excitation fluorophore et dans le même temps restreint l&#39;excitation pour un volume de tissu de petites minimisant les risques d&#39;agression solaire 5. Aussi, il quitte la rétine sensible aux stimuli visuels depuis une lumière infrarouge (&gt; 850 nm) est seulement mal absorbé par photopigments 6. dans les enregistrements in situ à partir de cellules exprimant la GFP qui sont visuellement ciblés par excitation à deux photons. La rétine est préparé et maintenu dans l&#39;obscurité et peut être soumis à des stimuli optiques qui sont projetées par le condenseur du microscope (figure 1). Patch-clamp enregistrement des réponses de lumière peut être combiné avec de la teinture de remplissage pour révéler la morphologie et pour vérifier l&#39;écart de jonction à médiation colorant couplage à des cellules voisines, de sorte que la cellule cible peut par étudiés sur différents niveaux d&#39;expérimentation.

Cet article décrit l&#39;enregistrement des cellules individuelles de fluorescence taggés populations neuronales dans la rétine de souris intactes. En utilisant deux photons d&#39;excitation infrarouge cellules transgenetically étiquetés ont été ciblés pour patch-clamp pour étudier leurs réponses lumière, les propriétés des champs réceptifs, et la morphologie.

Populations cellulaires Caractérisation électrophysiologique des exprimant la GFP dans la rétine intacte

L'étude des propriétés physiologiques et des connexions synaptiques de neurones spécifiques dans le tissu intact représente un défi pour les cellules qui ne possèdent pas de...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les réponses à la lumière et la morphologie de neurones individuels dans la rétine intacte en utilisant une lignée de souris exprimant un marqueur fluorescent exclusivement dans des types cellulaires spécifiques. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant l'œil pour obtenir une rétine isolée. La deuxième étape consiste à placer la rétine sous un microscope à balayage laser et à visualiser une cellule par excitation infrarouge à deux photons.Une micropipette est ensuite utilisée pour obtenir une configuration de patch-clamp en mode « tout cellule » afin d'effectuer l'enregistrement et le remplissage au colorant. En fin de compte, ce montage permet d'enregistrer les réponses cellulaires à une stimulation lumineuse et de révéler la morphologie de la cellule enregistrée par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'enregistrement en patch-clamp non guidé sur la rétine, est que l'enregistrement peut être dirigé visuellement vers une cellule marquée de façon fluorescente sans stimuler la rétine avec la lumière d'excitation.Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans la recherche sur la rétine, telles que quelle est la contribution d'une population cellulaire donnée au traitement de l'information visuelle ? Même si la population cellulaire présente une faible densité et ne possède aucune caractéristique morphologique distincte pouvant faciliter son identification. Commencez cette expérience en adaptant la souris à l'obscurité pendant au moins trois heures avant l'expérience.Entre-temps, préparez la solution extracellulaire comme décrit dans le manuscrit joint et faites-la saturer de carbogène à température ambiante. Ensuite, sacrifiez la souris et énucléez les yeux à l’aide d’une paire de ciseaux courbes pour iris. Transférez-les dans une boîte de Pétri contenant la solution extracellulaire.Ensuite, placez-le sous un microscope stéréoscopique équipé d'une paire de ciseaux à ressort. Retirez la cornée et le corps ciliaire en ouvrant le globe oculaire le long de la ligne serrata. Retirez le cristallin et séparez soigneusement la rétine de l'épithélium pigmentaire.Ensuite, sectionner le nerf optique entre la rétine et l'épithélium pigmentaire. Retirer la rétine de la cupule oculaire. Remarquer que l'intérieur de la rétine enroulée correspond au côté des cellules ganglionnaires.L'extérieur correspond au côté des photorécepteurs. Ensuite, retirez le vitré de la surface rétinienne interne en le tirant doucement à l’aide d’un cure-dent en bois. Puis effectuez de courtes incisions le long du périmètre de la rétine afin de faciliter l’aplatissement du tissu.Ensuite, transférez la rétine dans la chambre d'enregistrement avec la face des photorécepteurs vers le bas. Étalez-la sur le fond en verre à l’aide d’un pinceau fin et immobilisez-la avec un cadre en acier inoxydable muni de fils de nylon. Placez la chambre d’enregistrement dans l’obscurité sous un microscope à balayage laser droit.Superfusez continuellement la préparation rétinienne à un débit d'au moins cinq millilitres par minute. Avec une solution extracellulaire oxygénée au carbone et chauffée à 35 degrés Celsius, le microscope est placé sur une table antivibrations à air comprimé à l'intérieur d'une cage de Faraday. Pour le blindage électronique, recouvrez la cage d'un rideau opaque afin de maintenir l'obscurité autour de la préparation.Nous bloquons également la lumière provenant des écrans d'ordinateur à l’aide de films transparents rouges. Réglez le laser infrarouge sur une longueur d’onde comprise entre 850 et 870 nanomètres, ou plus longue encore. Passez en mode verrouillé et utilisez une excitation à deux photons pour visualiser les cellules exprimant la GFP.Pour l'enregistrement en enregistrement par électrode à sucçage, remplir des micropipettes en verre borosilicaté avec la solution intracellulaire contenant une sonde fluorescente, comme décrit dans le manuscrit accompagnant. Ensuite, insérer la micropipette dans le porte-électrode. S'assurer que l'électrode de référence est en contact avec la solution extracellulaire dans la chambre d'enregistrement.Ensuite, appliquez une pression sur la micropipette visant une cellule exprimant la GFP en utilisant un objectif à immersion dans l'eau de 40×. Les corps cellulaires d'Omicron se situent dans la couche des cellules ganglionnaires ainsi que dans la partie proximale de la couche interne, avant que la micropipette entre en contact avec la cellule ciblée et franchisse la membrane limitante interne à la surface rétinienne. La pénétration réussie est reconnue par la solution intracellulaire expulsée de l'extrémité de la micropipette et par le détachement de la membrane limitante interne des tissus rétiniens sous-jacents. Le colorant fluorescent présent dans la solution intracellulaire peut révéler la position de la micropipette sur l'image en deux photons lors de l'approche de la cellule souhaitée.Ensuite, relâchez la pression provenant de la micropipette et obtenez une configuration de patch-clamp en mode cellule entière. En mode potentiel constant, un enregistrement utilisable doit fournir un potentiel membranaire compris entre moins 50 et moins 55 millivolts et durer au moins 20 minutes. Après cela, présentez les stimuli visuels créés sur un écran d'ordinateur.Réglez l'intensité du stimulus en insérant des filtres de densité neutre dans le trajet du faisceau et ajustez la position spatiale de la stimulation au centre de la cellule enregistrée. Ensuite, démarrez le protocole de stimulation et enregistrez les réponses à la lumière. Utilisez le générateur de stimulus pour déclencher le logiciel d'enregistrement.Inclure une photodiode dans le trajet du faisceau afin de conserver un enregistrement du moment du stimulus. Faire attention à ne pas extraire le corps cellulaire lors du retrait de la micropipette. Lorsque cela est effectué pour le remplissage avec le colorant, laisser l'agent fluorescent diffuser dans la cellule enregistrée pendant 30 à 45 minutes.Voici un exemple de cellules exprimant la GFP dans une préparation plane de rétine sous leur promoteur pour la tyrosine hydroxylase, où deux populations peuvent être distinguées selon l'intensité du signal GFP. Les cellules dopaminergiques de type un, situées dans la couche interne, expriment une fluorescence faible, comme indiqué par les flèches. Dans la figure A. Les cellules de type deux sont fortement marquées et possèdent des corps cellulaires soit dans la couche, comme indiqué par les flèches dans la figure A, soit déplacés dans la couche ganglionnaire, comme montré dans la figure B. La figure C montre une stratification dendritique des cellules de type deux dans le stratum trois de la couche plexiforme interne. Voici un exemple de la morphologie d'une cellule de type deux injectée avec le traceur neurobiotine.Le traceur a ensuite été visualisé par liaison à une streptavidine marquée au fluorochrome, indiquée ici en magenta. Voici différents profils de réponse d'une cellule de type deux située dans la couche des cellules ganglionnaires à la lumière blanche. Un stimulus prolongé de trois secondes a été appliqué afin de mieux distinguer les composantes de la réponse au stimulus, au début et à la fin de celui-ci, suite à cette procédure.D'autres méthodes, telles que des expériences pharmacologiques, l'imagerie calcique ou l'immunochimie, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le rôle fonctionnel d'un type cellulaire donné dans les circuits rétiniens.

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