Détection directe de l'activité Acétate de formation de l'acétate kinase Enzyme

Cette expérience vise à mesurer directement l'activité de formation d'acétate de l'acétate kinase. Initiez la réaction en ajoutant l'enzyme à un mélange réactionnel contenant l'acétyl phosphate et les substrats DP. Ajoutez ensuite de l'hydroxylamine hydrochlorure pour convertir l'acétyl phosphate restant en acétyl hydroxylate.

Ajouter la solution de développement pour convertir l'acétyl hydroxylate en un complexe coloré de ferric hydroxylate pouvant être mesuré spectro-photométriquement. La quantité de substrat acétyl phosphate consommé lors de la réaction permet de déterminer les paramètres cinétiques de l'enzyme. L'avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la mesure directe de la consommation d'acétyl phosphate, plutôt que dans le découplage d'une production de TP liée à la réduction d'un ADP. Étant donné que ce dosage ne dépend pas de la production de TP, il peut être utilisé pour un nouveau groupe d'acétate kinases produisant du phosphate à haute énergie au lieu de TP. Pour une courbe standard de six à huit points, diluer la solution mère d'acétyl phosphate dans du triss 100 millimolaire jusqu'à un volume final de 300 microlitres. Inclure également un échantillon témoin sans acétyl phosphate. Équilibrer tous les échantillons dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant une minute.

Ajoutez maintenant 50 microlitres de chlorhydrate d'hydroxylamine à deux molaire, mélangez en agitant trois fois, puis incubez pendant cinq minutes dans un bloc chauffant à 60 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de développement, mélangez en agitant trois fois et laissez la couleur se développer pendant au moins une minute à température ambiante. Centrifugez les échantillons en utilisant des cuvettes en plastique destinées au spectrophotomètre.

Effectuez la mesure des échantillons à 540 nanomètres. Procédez ensuite à l'élaboration d'une courbe standard de l'absorbance à 540 nanomètres en fonction des micromoles d'acétyl phosphate à l'aide d'un logiciel approprié d'analyse de données et de tracé graphique. Calculez la valeur de r carré.

Répartir des aliquotes de 300 microlitres du mélange réactionnel dans des tubes de microcentrifugeuse. Pensez à inclure une réaction témoin sans enzyme ; équilibrer les tubes pendant une minute à 37 degrés Celsius. Si plusieurs réactions sont effectuées, ajouter l'enzyme aux tubes à des intervalles de temps spécifiques et replacer immédiatement chaque tube dans le bloc chauffant à 37 degrés Celsius.

Après cinq minutes, ajouter 50 microlitres de chlorhydrate d'hydroxylamine deux molaire, mélanger et incuber cinq minutes à 60 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 100 microlitres de la solution de développement, mélanger et laisser à température ambiante pour le développement de la couleur. Puis centrifuger les échantillons à 18 000 ×g pendant une minute.

Procédez au mesurage de l'absorbance à 540 nanomètres. Déterminez la quantité d'acétyl phosphate présente par comparaison avec la courbe standard d'acétyl phosphate. Les données peuvent être représentées graphiquement et ajustées à l'équation de McKayla Cementin pour la détermination des paramètres cinétiques.

Cet essai permet de déterminer la consommation du substrat acétyl phosphate afin de mesurer l'activité de l'acétate kinase dans le sens de la formation de l'acétate. L'acétyl phosphate restant après une durée donnée de la réaction enzymatique est converti en acétyl oxybate, puis en un complexe hydroxy ferrique, qui présente une couleur rougeâtre mesurable à 540 nanomètres. Cette courbe standard typique, portant en abscisse la quantité d'acétyl phosphate en micromoles et en ordonnée l'absorbance à 540 nanomètres, présente une pente de 1,2332 unité d'absorbance par micromole d'acétyl phosphate.

La valeur de r carré obtenue de 0,99 indique que les données s'ajustent bien à l'équation linéaire représentée ici. Ce dosage peut être utilisé pour déterminer le KM de l'acétyl phosphate pour diverses préparations enzymatiques. À cinq millimolaire de DP, avec des concentrations variables d'acétyl phosphate, la kinase acétate recombinante purifiée issue de *Methanolobus thermophilus* suit des cinétiques classiques de type Michaelien pour chaque substrat, conduisant à un KM apparent de 0,27 ± 0,01 millimolaire d'acétyl phosphate.

Contrairement au dosage couplé classique, ce dosage direct peut mesurer l'activité d'acétate kinases utilisant des substrats autres que l'ATP. Par exemple, lors de l'utilisation de l'acétyl-phosphate par l'acétate kinase d'Entamoeba histolytica produisant du pyrophosphate, le phosphate de sodium a été substitué à l'ADP dans le mélange réactionnel. La courbe obtenue indique une valeur apparente de KM de 0,50 ± 0,006 millimolaire pour l'acétyl-phosphate. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer directement l'activité de l'acétate kinase en déterminant la quantité d'acétyl-phosphate consommée.

Un facteur clé pour obtenir des résultats reproductibles est d'être constant à chaque étape, en particulier lors de l'ajout de l'enzyme et de l'étape de mélange.