Pull-down des protéines se liant à la calmoduline

L’objectif global de cette procédure est de tester les protéines qui se lient à Cal Modlin de manière dépendante du calcium. Pour ce faire, il faut d’abord collecter les protéines d’intérêt. Ensuite, les vitesses sérologiques de la calmoduline sont préparées pour la liaison aux protéines.

Ensuite, les protéines sont incubées à des vitesses sérogènes de calmoduline. Enfin, les protéines qui se lient de manière dépendante du calcium sont évoquées. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des protéines qui se lient à la calmoduline en présence ou en absence de calcium grâce à une analyse sanguine occidentale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes, telles que la chromatographie calme et l’immunoprécipitation, est qu’elle nécessite moins de protéines et moins de temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation du modlin de vache, telles que les protéines qui se lient au modlin de vache de manière dépendante du calcium, et comment les modifications post-traductionnelles peuvent affecter leur liaison à la modline de vache. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de manipulation des billes sont essentielles et la description de la résistance et de la rétention des billes est difficile à suivre sans la voir.

Pour préparer le tissu à l’homogénéité, injecter des coupes organotypiques d’hippocampe avec un virus contenant un plasmide exprimant la protéine recombinante d’intérêt. Dans cet exemple, la protéine recombinante est Neuro Grandin marquée GFP. Laissez le tissu exprimer la protéine pendant la nuit environ 12 à 18 heures après l’injection virale, ajoutez un millilitre de tampon de dissection dans une boîte de Pétri

Transférez le tissu cultivé avec l’insert dans la boîte de Pétri et ajoutez deux millilitres de tampon de dissection à l’insert pour immerger le tissu à l’aide d’un scalpel. Prélevez cinq à 10 tranches de tissu organotypique de l’hippocampe en grattant doucement le tissu de la membrane d’insertion à l’aide d’une pipette de pâturage inversée. Transférez le tissu en suspension dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Ensuite, centrifugez les échantillons à 1500 RCF pendant une minute. Pour séparer le tissu du tampon de dissection, retirez soigneusement le surnageant par aspiration. Assurez-vous de ne pas déranger le granulé.

Pour chaque tranche utilisée, ajoutez le tissu à 30 à 60 microlitres de tampon d’homogénéisation à l’aide d’une pipette d’un millilitre à pointe coupée, puis homogénéisez-le soigneusement à l’aide d’un pilon avant de remettre l’homogénat dans son tube d’origine. Afin d’éliminer les débris cellulaires, centrifugez l’homogénat restant à 1100 RCF pendant 10 minutes et collectez soigneusement le snat par aspiration tout en évitant la contamination par la pastille. Aliquote 10 % du surnageant comme échantillon de l’entrée.

Conservez le surnageant restant sur de la glace pendant la préparation des billes de cal sero à utiliser. Plus tard, pour chaque pipette rétractable, 400 microlitres de Modlin Sero en suspension s’accélèrent dans un microtube de centrifugation de deux millilitres avec un fond relativement plat pour maximiser la surface et l’interaction des solutions avec les billes pendant les incubations, tournez le tube de micro-centrifugeuse sur le côté pour mouiller les billes, puis centrifugez les billes à 21, 000. RCF pendant 30 secondes.

Et retirez soigneusement le surnageant par aspiration. Assurez-vous de ne pas déranger les billes pour laver les billes à 100 microlitres du tampon d’homogénéisation respectif contenant soit deux millimolaires de chlorure de calcium aux billes utilisées pour abattre les protéines de liaison au modlin de calcium cal. Ou deux chélateurs de calcium millimolaires E-D-T-A-A connus pour les billes utilisés pour abaisser les protéines de liaison à la modline apocalique.

Tapotez doucement le tube sur Resus. Suspendez les billes et centrifugez à 1500 RCF pendant une minute. Retirez soigneusement le surnageant par aspiration, en veillant à ne pas déranger les billes pour lier les protéines aux spheros de calmoduline pour les tirer.

Commencez par diviser le SNAT en deux volumes égaux. Selon l’état par aliquote, ajoutez la quantité appropriée de chlorure de calcium ou d’EDTA au supernat jusqu’à une concentration finale de deux millimolaires. Ajouter le surnageant aux billes lavées dans le tampon d’homogénéisation approprié.

Tapotez doucement le tube pour mélanger. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant trois heures sur un agitateur. Nous suspendons les perles toutes les 30 minutes environ pour augmenter l’efficacité de la liaison.

Ensuite, centrifugez les échantillons à 1500 RC F pendant trois minutes. Prélever 50 microlitres de surnageant comme échantillon de protéine non liée et retirer soigneusement le reste de la snat par aspiration et jeter. Lavez les billes trois fois comme précédemment avec 100 microlitres du tampon d’homogénéisation approprié.

L’étape la plus difficile de cette procédure est l’élucidation efficace des protéines cibles. La meilleure façon d’assurer le succès est d’utiliser le bon type de tube pour minimiser la perte de billes et de remettre correctement les billes en suspension dans le réchauffement du tampon d’élution. Le tampon d’élution au préalable peut également aider de manière significative à éluer la protéine à 50 microlitres de tampon elucian aux billes.

Les échantillons qui ont été homogénéisés et liés dans un tampon contenant du calcium sont mentionnés dans le tampon contenant de l’EDTA, et les échantillons qui avaient un tampon contenant de l’EDTA sont mentionnés avec du calcium. Incuber les billes à température ambiante pendant 30 minutes sur un shaker. Mélangez les perles en tapotant doucement le tube environ toutes les cinq minutes.

Centrifugez les billes à 1500 RCF pendant trois minutes et retirez soigneusement les 50 microlitres de SNAT pour l’échantillon de protéine lié par aspiration. Assurez-vous de ne pas déranger les perles. Effectuez une page SDS et un western blot pour identifier la protéine d’intérêt en tant que contrôle positif dans la condition opposée.

Prop Pro protéine connue pour se lier à Cal Modlin. Cette figure montre un exemple d’un test de traction de Cal Modlin testant la liaison de Cal MODLIN de GFP TAG Neuro Grandin par rapport à la neuro Grandin endogène. L’entrée homogène montre que la GFP neuro Grandin a été exprimée en plus de la neuro grandine endogène et de la kinase dépendante de la calmoduline calcique deux, comme prévu, sur la base de la liaison connue de la neuro Grandin endogène.

Neuro Grandin marqué à la GFP a été mentionné en l’absence de calcium et ne s’est pas lié en présence de calcium. En revanche, la kinase dépendante de la calmoduline calcique témoin n’a été évoquée qu’en présence de calcium et n’était pas liée en son absence. Cela montre que les billes de calmoduline fonctionnaient correctement et que l’EEU était efficace.

Plus important encore, cela montre que le neurosourire GFP se lie à Apoch Cal Modlin de la même manière que la forme endogène, suggérant que l’étiquette GFP n’a pas altéré la fonction d’une protéine recombinante. Une fois maîtrisé, cette technique, sans inclure la page FDS et l’analyse de sang occidentale, peut être terminée en six heures lorsqu’elle est effectuée correctement. En essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’étiqueter tous les échantillons et tubes pour l’état approprié, car tout changement dans la concentration de calcium peut compromettre l’ensemble de l’expérience. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer efficacement la capacité de protéines particulières à se lier à un module CAL de manière dépendante du calcium.

En collectant les protéines d’intérêt, en les incubant avec les vitesses SRO co-modulantes correctement préparées, en échappant aux protéines liées et en les testant à l’aide d’une analyse sanguine occidentale.