Suivi de signalisation hypoxique dans les agrégats de cellules encapsulées

L’objectif global de cette procédure est de surveiller la réponse cellulaire à l’hypoxie dans les agrégats cellulaires encapsulés PEG. Dans un premier temps, les cellules dispersées sont infectées par le virus marqueur, puis cultivées sur un agitateur pour permettre la formation d’agrégats. Ensuite, la cheville linéaire est fonctionnalisée et le rimère PEG DM est purifié.

Ensuite, les agrégats cellulaires sont encapsulés dans un hydrogel PEG DM. Enfin, les hydrogels sont cultivés dans diverses conditions d’oxygène tout en étant surveillés par fluorescence pour le signal du marqueur d’hypoxie. En fin de compte, l’emplacement et l’étendue de l’activité des facteurs inductibles par l’hypoxie au sein d’agrégats encapsulés viables de cellules peuvent être visualisés par simple microscopie fluorescente.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’encapsulation cellulaire et de l’administration thérapeutique à base de cellules, telles que : Où l’hypoxie se produit-elle dans les cultures 3D et quel est son impact sur la survie et la fonction cellulaires ? Les implications de cette technique s’étendent aux approches de médecine régénérative et au traitement des carences hormonales telles que le diabète rémunéré en raison de l’impact majeur de l’hypoxie dans les tissus agrégés et encapsulés. Il a été démontré que l’activité du facteur un inductible par l’hypoxie est corrélée à une forte réduction de la sécrétion d’insuline par les cellules bêta, motivant les tentatives de dissociation des œillets primaires et de les reformer en pseudo-œillet.

Agrégats de diamètre réduit. Notre marqueur peut indiquer l’activité du facteur induit par l’hypoxie avec des agrégats au niveau cellulaire dans n’importe quel matériau d’encapsulation desserré. Le PEG a été choisi comme matériau de capsule en raison de ses propriétés de transfert favorables, de sa compatibilité cyto et de la facilité avec laquelle il peut être modifié fonctionnellement.

Après avoir pesé deux grammes de PEG dans un flacon en verre de 40 millilitres à environ 308 microlitres de méthamphétamine, d’acrylique, d’anhydride et fermer sans serrer le flacon avec un capuchon en plastique dur. Passez le flacon au micro-ondes à puissance élevée pendant deux minutes dans un micro-ondes domestique standard. Ensuite, en portant des gants résistants à la chaleur, agitez soigneusement le flacon et passez la solution au micro-ondes à puissance élevée pendant cinq minutes supplémentaires.

Laissez brièvement le flacon refroidir suffisamment pour être manipulé, puis débouchez-le tout en remuant le flacon. Incorporer lentement le chlorure de méthylène, en faisant tourbillonner l’échantillon au besoin jusqu’à ce que la solution apparaisse claire et homogène. Ensuite, ajoutez la solution goutte à goutte à 200 millilitres d’éther dathylique froid agité pour précipiter le PEG dm.

Récupérez ensuite le PEG DM par filtration sous vide et laissez-le sécher. Une fois que le PEG DM a séché, dissolvez-le dans environ 100 à 150 millilitres d’eau déminéralisée. Ensuite, dialysez la solution contre de l’eau déminéralisée pendant cinq jours dans un tube de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 1000 Daltons après dialyse.

Placez la solution dans des récipients appropriés et congelez-les à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, lyophilisez la solution pendant quatre jours pour générer une poudre de PEG DM blanc purifié afin de libérer les cellules de la surface du flacon de culture traité. Tout d’abord, aspirez le milieu, rincez les cellules avec 37 degrés CELs de calcium, HBSS sans magnésium, et aspirez le HBSS.

Ajoutez maintenant deux millilitres de déclenchements à 37 degrés Celsius et une solution EDTA, et laissez les cellules incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, secouez fermement le côté du ballon pour libérer les cellules à huit millilitres de 37 degrés Celsius, à mi-chemin du ballon et pipetez vigoureusement la suspension cellulaire de haut en bas. En prenant soin de ne pas introduire de bulles.

Après avoir transféré la solution cellulaire dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules à infecter. Ajoutez le volume nécessaire de suspension cellulaire pour obtenir 400 000 cellules par puits dans les puits d’une plaque de culture en suspension à six puits aliquote 50 microlitres de HBSS par puits de cellules à infecter dans un microtube à centrifuger de 1,8 millilitre. Ensuite, pipetez soigneusement la quantité appropriée de suspension de virus dans le HBSS préparé.

Ajoutez maintenant le volume approprié de virus dilué dans chaque puits pour obtenir le moment d’inertie souhaité, puis ajoutez du milieu à chaque puits pour porter le volume total à 1,7 millilitre. Enfin, placez la plaque sur un agitateur orbital À l’intérieur de l’incubateur, réglez l’agitateur sur un réglage bas d’environ 100 tr/min afin que le milieu lave doucement autour du puits et permette aux cellules de s’agréger pendant 24 à 36 heures. Commencez par couper l’extrémité effilée d’une seringue en plastique d’un millilitre et placez-la ouverte dans un support pour créer un récipient dans lequel l’hydrogel se formera.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de solution photoactive de PEG DM dans l’extrémité ouverte de la seringue sur le piston, en vous assurant que le volume couvre toute la surface du piston. Ajustez le piston par petits incréments pour obtenir une surface plane et fluide. Remettez maintenant la pipette dans le support et positionnez-le sous une lampe UV pendant environ huit minutes pour permettre la réticulation de l’hydrogel.

Pendant ce temps, pipeter le volume contenant le nombre souhaité de cellules et d’agrégats dans un microtube à centrifuger de 1,8 millilitre. Boucher le tube puis centrifuger les cellules et les agrégats pendant cinq minutes à 130 g. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette, retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire à l’extrémité du tube.

Lorsque la tête du média s’approche de la pastille, utilisez une pointe de pipette plus fine de 10 microlitres pour disperser uniformément les agrégats cellulaires dans la solution de précurseur de gel tout en veillant à ce qu’ils soient entièrement encapsulés. C’est la partie la plus délicate de cette procédure. Lors de l’exécution de cette étape, prenez soin de poncer et de transférer doucement la pastille.

Maintenant, remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 20 microlitres de la solution photoactive PEG DM. À l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture et ajoutez la suspension cellulaire dans la seringue au-dessus de la portion d’hydrogel réticulé, exposez la seringue à huit minutes supplémentaires de lumière UV pour terminer la construction de l’hydrogel. Une fois terminés, les cellules doivent être entièrement encapsulées dans l’hydrogel cylindrique.

Enfin, ajoutez un millilitre de HBSS dans un puits d’une plaque de 24 puits et un millilitre de média dans un autre. Ensuite, éjectez l’hydrogel de la seringue dans le HBSS pour laver brièvement le gel. Transférez le gel dans le milieu et cultivez la plaque dans les conditions souhaitées.

À n’importe quel moment de la culture, les cellules peuvent être imagées à l’aide de la microscopie fluorescente pour suivre l’initiation du lieu de signalisation hypoxique, la plaque à 24 puits sur la platine du microscope, en centrant le puits avec l’hydrogel sous l’objectif. Le signal est suffisamment spécifique pour identifier les cellules de signalisation individuelles, mais la résolution peut être insuffisante pour déterminer la localisation du signal intracellulaire. Dans les cellules de signalisation, le signal est généralement observé uniformément dans tout le cytoplasme.

Cette figure montre un exemple représentatif d’agrégats de minx encapsulés dans un hydrogel PEG à l’intérieur de la cellule de gel. Les agrégats doivent être entièrement enfermés dans la matrice et répartis de manière homogène pour permettre un meilleur transport des nutriments, comme on le voit ici. Notez comment le gel de réticulation est solide tout au long de la forme, prenant la forme du vaisseau dans lequel la réaction a été effectuée.

Dans cette figure, la signalisation représentative de l’hypoxie fluorescente dans six cellules agrégées dans un hydrogel PEG DM montre des cellules qui ont été encapsulées puis placées en incubation à 20 % d’oxygène pendant 44 heures. Sur la photo de gauche, ils ne présentent pas de signalisation d’hypoxie alors que les cellules encapsulées puis incubées dans 2 % d’oxygène pendant 44 heures. Comme illustré sur l’écran de droite, l’hypoxie à signal omniprésent clair peut également être suivie dans d’autres types de cellules.

Cette figure montre une signalisation hypoxique représentative dans des agrégats de cellules souches mésenchymateuses encapsulées. Comme on le voit sur la figure la plus à gauche, le signal fluorescent n’est pas détectable à 12 heures dans 2 % d’oxygène, puis comme on le voit sur la figure centrale, il est plus apparent après 24 heures et 2 % d’oxygène. Et enfin, comme on le voit à droite, est fortement exprimé après 96 heures et 2 % d’oxygène Suite à cette procédure.

D’autres méthodes comme Eliza, l’analyse des protéines sécrétées et les tests de viabilité cellulaire peuvent être effectuées afin de corréler la signalisation hypoxique avec le phénotype cellulaire. Avec ce développement, cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines de l’ingénierie tissulaire et de l’administration thérapeutique à base de cellules pour explorer la fonction de survie et la différenciation des cellules au sein d’échafaudages et de matériaux d’encapsulation.