Suivi de signalisation hypoxique dans les agrégats de cellules encapsulées

L'objectif général de cette procédure est de surveiller la réponse cellulaire à l'hypoxie dans des agrégats cellulaires encapsulés dans du PEG. Dans la première étape, des cellules dispersées sont infectées par le virus marqueur, puis cultivées sur un agitateur pour permettre la formation d'agrégats. Ensuite, le PEG linéaire est fonctionnalisé et le dimère de PEG DM est purifié.

Ensuite, les agrégats cellulaires sont encapsulés dans un hydrogel de PEG DM. Enfin, les hydrogels sont cultivés dans diverses conditions d'oxygène tout en étant surveillés par fluorescence pour détecter le signal du marqueur d'hypoxie. En définitive, la localisation et l'ampleur de l'activité du facteur inductible par l'hypoxie au sein des agrégats cellulaires viables encapsulés peuvent être visualisées par une simple microscopie en fluorescence.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'encapsulation cellulaire et de la délivrance thérapeutique basée sur les cellules, telles que : Où l'hypoxie se produit-elle au sein des cultures tridimensionnelles, et comment affecte-t-elle la survie et la fonction cellulaire ? Les implications de cette technique s'étendent aux approches de médecine régénérative et au traitement des déficiences hormonales, comme le diabète de type 1, en raison de l'impact majeur de l'hypoxie sur les tissus agrégés et encapsulés. L'activité du facteur inducible par l'hypoxie un a été associée à une sécrétion d'insuline fortement réduite par les cellules bêta, ce qui motive les tentatives de dissocier les îlots primaires et de les reconstituer sous forme d'îlots pseudo-isolés.

Des agrégats de diamètre réduit. Notre marqueur peut indiquer l'activité du facteur inducible par l'hypoxie grâce à des agrégats au niveau cellulaire au sein de tout matériau encapsulant relâché. Le PEG a été choisi comme matériau de capsule en raison de ses propriétés de transfert favorables, de sa biocompatibilité et de la facilité avec laquelle il peut être modifié fonctionnellement.

Après avoir pesé deux grammes de PEG dans un flacon en verre de 40 millilitres, ajouter environ 308 microlitres de méthacrylique anhydride et fermer légèrement le flacon avec un bouchon en plastique rigide. Placer le flacon au four à micro-ondes à puissance maximale pendant deux minutes dans un micro-ondes domestique standard. Ensuite, porter des gants résistant à la chaleur, vortexer soigneusement le flacon, puis soumettre la solution à un nouveau traitement au micro-ondes à puissance maximale pendant cinq minutes supplémentaires.

Laissez brièvement refroidir le flacon suffisamment pour pouvoir le manipuler, puis dévissez le bouchon tout en faisant tourner le flacon. Incorporez lentement du chlorure de méthylène, en vortexant l'échantillon au besoin jusqu'à ce que la solution apparaisse claire et homogène. Ensuite, ajoutez la solution goutte à goutte à 200 millilitres d'éther éthylique froid sous agitation pour précipiter le PEG dm.

Ensuite, recueillir le DM de PEG par filtration sous vide et laisser sécher. Une fois le DM de PEG sec, le dissoudre dans environ 100 à 150 millilitres d'eau déionisée. Puis dialyser la solution contre de l'eau déionisée pendant cinq jours dans un tube de dialyse ayant une limite de poids moléculaire de 1000 Daltons après dialyse.

Transférez la solution dans des récipients appropriés et congélez-les à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, lyophilisez la solution pendant quatre jours afin d'obtenir une poudre blanche purifiée de PEG DM pour détacher les cellules de la surface du flacon de culture traité. Commencez par aspirer le milieu, rincez les cellules avec du HBSS sans calcium ni magnésium à 37 degrés Celsius, puis aspirez le HBSS.

Ajoutez maintenant deux millilitres de solution de trips et d'EDTA à 37 degrés Celsius, puis laissez les cellules s'incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Secouez ensuite fermement le côté du flacon pour détacher les cellules, ajoutez huit millilitres de milieu à 37 degrés Celsius au flacon et pipetez vigoureusement la suspension cellulaire de haut en bas, en prenant soin de ne pas introduire de bulles.

Après avoir transféré la solution cellulaire dans un tube stérile de centrifugeuse de 15 millilitres, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre afin de déterminer le nombre total de cellules à infecter. Ajoutez le volume nécessaire de suspension cellulaire pour obtenir 400 000 cellules par puits dans les puits d’une plaque de culture en suspension à six puits ; aliquotez 50 microlitres de HBSS par puits de cellules à infecter dans un tube de microcentrifugeuse de 1,8 millilitre. Ensuite, pipetez soigneusement la quantité appropriée de suspension virale dans le HBSS préparé.

Ajoutez maintenant le volume approprié de virus dilué dans chaque puits afin d'obtenir le MOI souhaité, puis ajoutez du milieu dans chaque puits pour porter le volume total à 1,7 millilitre. Enfin, placez la plaque sur un agitateur orbital à l'intérieur de l'incubateur, réglez l'agitateur sur une vitesse faible d'environ 100 tr/min afin que le milieu circule doucement dans les puits, et laissez les cellules s'agréger pendant 24 à 36 heures. Commencez par couper l'extrémité effilée d'une seringue en plastique de un millilitre et placez-la, ouverte vers le haut, dans un support afin de créer un récipient dans lequel l'hydrogel se formera.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de solution de PEG DM photo-activable à l'extrémité ouverte de la seringue, directement sur le piston, en veillant à ce que le volume recouvre entièrement la surface du piston. Ajustez le piston par petits incréments afin d'obtenir une surface plane de liquide. Replacez ensuite la pipette dans le support et positionnez le support sous une lampe à rayons UV pendant environ huit minutes pour permettre la réticulation de l'hydrogel.

Pendant ce temps, prélevez à l’aide d’une pipette le volume contenant le nombre désiré de cellules et d’agrégats dans un tube microcentrifuge de 1,8 millilitre. Fermez le tube et centrifugez ensuite les cellules et les agrégats pendant cinq minutes à 130 ×g. Puis, à l’aide d’une micropipette, retirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot cellulaire situé à l’extrémité du tube.

Lorsque la tête du distributeur s'approche du culot, utilisez une micropipette plus fine de 10 microlitres pour répartir uniformément les agrégats cellulaires dans la solution précurseur du gel, tout en veillant à ce qu'ils soient entièrement encapsulés. C'est l'étape la plus délicate de cette procédure. Lors de l'exécution de cette étape, veillez à resuspendre et à transférer délicatement le culot.

Resuspendez maintenant délicatement le culot cellulaire dans 20 microlitres de la solution photo-activable de PEG DM. À l’aide d’une pipette à embout large, ajoutez la suspension cellulaire dans la seringue, par-dessus la partie d’hydrogel réticulé, puis exposez la seringue à huit minutes supplémentaires de lumière UV afin de terminer la construction de l’hydrogel. Une fois terminé, les cellules doivent être entièrement encapsulées au sein de l’hydrogel cylindrique.

Enfin, ajoutez un millilitre de HBSS dans un puits d'une plaque 24 puits et un millilitre de milieu dans un autre. Éjectez ensuite l'hydrogel de la seringue dans le HBSS pour rincer brièvement le gel. Transférez le gel dans le milieu et cultivez la plaque dans les conditions souhaitées.

À tout moment pendant la culture, les cellules peuvent être observées par microscopie fluorescente afin de suivre l'initiation de la signalisation hypoxique : placer la plaque à 24 puits sur la platine du microscope et centrer le puits contenant l'hydrogel sous l'objectif. Le signal est suffisamment spécifique pour identifier des cellules individuelles en cours de signalisation, mais la résolution peut être insuffisante pour déterminer la localisation intracellulaire du signal. Dans les cellules signalisantes, le signal est généralement observé de manière uniforme dans tout le cytoplasme.

Cette figure montre un exemple représentatif d'agrégats minx encapsulés dans un hydrogel PEG à l'intérieur de la cellule de gel. Les agrégats doivent être entièrement enfermés dans la matrice et répartis de manière homogène afin de permettre un meilleur transport des nutriments, comme observé ici. Remarquez comment le gel réticulé est solide en tout point et prend la forme du récipient dans lequel la réaction a été réalisée.

Dans cette figure, on observe une signalisation fluorescente représentative de l'hypoxie dans des agrégats de six cellules min encapsulées dans un hydrogel PEG DM, placées ensuite en incubation à 20 % d'oxygène pendant 44 heures. Les cellules représentées à gauche ne montrent aucune signalisation d'hypoxie, tandis que les cellules encapsulées puis incubées à 2 % d'oxygène pendant 44 heures, telles qu'illustrées à droite, présentent un signal d'hypoxie clair et ubiquitaire. Cette signalisation peut également être suivie dans d'autres types cellulaires.

Cette figure montre un signal hypoxique représentatif dans des agrégats de cellules souches mésenchymateuses encapsulés. Comme on le voit sur l'image la plus à gauche, le signal fluorescent n'est pas détectable après 12 heures à 2 % d'oxygène, puis devient plus apparent après 24 heures à 2 % d'oxygène, comme illustré sur l'image centrale. Enfin, comme indiqué sur l'image de droite, il est fortement exprimé après 96 heures à 2 % d'oxygène, suite à cette procédure.

D'autres méthodes, telles que le test Eliza, l'analyse des protéines sécrétées et les tests de viabilité cellulaire, peuvent être réalisées afin de corréler la signalisation hypoxique avec le phénotype cellulaire. Grâce à ce développement, cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines du génie tissulaire et de la thérapie cellulaire à base de vecteurs, pour explorer la fonction de survie et la différenciation des cellules au sein de supports tridimensionnels et de matériaux d'encapsulation.