Name: Suivi de signalisation hypoxique dans les agrégats de cellules encapsulées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Découvrez le suivi de la signalisation hypoxique dans les agrégats de cellules encapsulées dans un hydrogel PEG. Cette méthode permet de visualiser l'activité du facteur inducible par l'hypoxie et d'étudier son impact sur la survie cellulaire.

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Merci à le laboratoire Kristi Anseth de l&#39;Université du Colorado, Boulder a généreusement fournissant min6 cellules. Le financement de ce projet a été fourni par la NSF.

1. La synthèse et de PEGDM PEGDM photoactifs solution de macromère préparation <ol><li> Peser 2 g de PEG (linéaire, 10.000 Da) dans un flacon en verre de 40 mL avec un bouchon en plastique dur. </li><li> Ajouter environ 308μL d'anhydride méthacrylique et lâchement bouchon du flacon. </li><li> Micro-ondes le flacon à température élevée pendant 2 minutes au micro-ondes domestique standard. Des gants résistant à la chaleur port, soigneusement vortex le flacon, puis micro-ondes à puissance maximale pendant 5 minutes supplémentaires. </li><li> Brièvement attendre que le flacon assez cool pour être manipulés avec des gants. Déboucher et c'est ajouter lentement le chlorure de méthylène tout tourbillonnant dans le flacon. Ajouter suffisamment pour que la solution semble claire et homogène, vortex de l'échantillon nécessaire. Le volume total de chlorure de méthylène utilisé doit être de 1,5 - 2 ml. </li><li> PEGDM précipité dans 200 ml de froid, on a agité l'éther diéthylique en ajoutant goutte à goutte une solution. </li><li> Recueillir les PEGDM par filtration sous vide et de lui permettre de sécher. </li><li> Dissoudre le PEGDM en quantité suffisanted'eau déminéralisée (typiquement 100 -150 ml). </li><li> Dialyser la solution contre l'eau désionisée pendant 5 jours dans un tube à dialyse avec un poids moléculaire de coupure de 1000 Da. Remplacer l'eau une fois par jour. </li><li> Aliquoter la solution dans des conteneurs appropriés et congeler à -80 ° C pendant la nuit. Lyophiliser la solution pendant 4 jours pour donner une poudre blanche purifiée PEGDM. Conserver la poudre à 4 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé. </li><li> Pour préparer une solution PEGDM photoactifs, d'abord préparer un stock de 0,5 pour cent en poids photoinitiateur solution en dissolvant Irgacure 2959 dans l'eau déminéralisée. Vortex de la solution et la stocker dans l'obscurité. </li><li> Préparer un PEGDM 10% en poids et 0,025% en poids Irgacure 2959 solution dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Vortex à fond pour assurer la dissolution de l'PEGDM. Nous préparent habituellement 1 mL de cette solution à la fois. </li><li> Stériliser la solution par filtration à travers un filtre de 0,2 um seringue dans un tube de 1,8 ml microtubes. Envelopper le tube dans du papier d'aluminiumet conserver à 4 ° C </li></ol> 2. Culture, l'infection, et l'agrégation des cellules min6 <ol><li> Min6 cellules sont cultivées en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS, le glucose 7mm, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et 0,5 pg / mL amphotercin B dans un environnement humide à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Pour libérer les cellules de la surface de flacon de culture traitée, aspirer le support, rincer les cellules avec 37 ° C de calcium / magnésium sans HBSS, aspirer le HBSS, puis ajoutez 2 ml de 37 ° C la trypsine-EDTA solution et permettre aux cellules de incuber pendant 3 minutes. </li><li> Fermement jar le côté du flacon pour frapper les cellules libres, puis ajoutez 8 ml de 37 ° C moyenne et vigoureusement la pipette de la suspension cellulaire de haut en bas en prenant soin de ne pas introduire de bulles. </li><li> Pipeter les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et effectuer un comptage des cellules en utilisant un hématimètre ou autre cellule procédure de comptage. </li><li> En se préparant à infecter les cellules avec le fabricantvirus, d'abord déterminer le nombre total de cellules d'être infectées et de calculer le volume de suspension de virus nécessaire pour atteindre la multiplicité désirée d'infection (MOI) (50 à 100 particules infectieuses par cellule). </li><li> Diluer le virus dans HBSS en prenant soin de pipetage la quantité appropriée de suspension du virus dans un volume pré-aliquotés de HBSS dans un tube 1,8 ml microtubes. 50 ul de HBSS par puits de cellules agrégation est approprié. </li><li> Disperser les cellules en les pipetage de haut en bas dans leur tube, puis pipeter le volume nécessaire pour atteindre 400 000 cellules par puits dans les puits d'une plaque à 6 puits culture en suspension. </li><li> Ajouter le volume approprié de virus dilué dans chaque puits pour atteindre les résultats souhaités MOI. </li><li> Ajouter à moyen et à chaque puits pour amener le volume total jusqu'à 1,7 ml. </li><li> Placer la plaque sur un agitateur orbital à l'intérieur de l'incubateur. Régler le vibreur sur un réglage bas pour que le milieu se lave en douceur autour du puits (~ 100 rpm). Laisser les cellules agrégationTE pendant 24-36 heures. Granulats avec un diamètre approximatif de 75 à 175 um devrait être formé. </li></ol> 3. L'encapsulation des cellules dans PEGDM <ol><li> Les cellules peuvent être encapsulées sous forme de dispersion (étape 2.4) ou l'agrégation suivante (étape 2.10). Comme la solution PEGDM hydrogel précurseur est un liquide, les cellules peuvent avoir tendance à régler avant de réticulation et la formation d'hydrogel. Si le règlement est prévu pour se produire rapidement, comme avec de plus grands agrégats, il peut être avantageux de produire de l'hydrogel en deux étapes afin que les cellules se déposent un plan central du gel. Une procédure en une seule étape la synthèse d'hydrogel appropriés pour les cellules dispersées est montré (figure 2) et la procédure en deux étapes est ainsi montré (figure 3) et détaillée ci-dessous (3.2 à 3.9). </li><li> Créer un récipient dans lequel l'hydrogel sera formé en coupant la pointe conique hors d'une seringue de 1 ml en plastique et en plaçant l'ouvrir jusqu'à la fin dans un rack. </li><li> Pipeter 20 ul de PEGDM photoactifs afinlution dans l'extrémité ouverte de la seringue sur le piston en s'assurant que le volume couvre la surface entière plongeur. Régler le piston en petits incréments pour obtenir une surface plane du liquide. </li><li> Placez la pipette dans le rack et la position de la grille en dessous d'une lampe UV (365nm, ~ 7 mW / cm 2) pendant environ 8 minutes pour permettre à la réticulation hydrogel. Pendant ce temps, la préparation des cellules peut être commencé </li><li> Pipet un volume contenant le nombre désiré de cellules / agrégats dans un tube de 1,8 ml microtubes, capuchon et centrifuger le tube à 130 g pendant 5 minutes. </li><li> Utiliser une micropipette, retirer soigneusement les médias sans déranger le culot cellulaire à l'extrémité du tube. A la tête des médias des approches du culot, il peut être utile d'utiliser une plus fine, 10 uL pipette. </li><li> Doucement resuspendre le culot cellulaire dans 20 uL de solution PEGDM photoactifs (utiliser une pipette à large ouverture si l'on travaille avec des granulats) et ajouter la suspension cellulaire à la seringue sur le dessus de ee préalablement réticulé portion d'hydrogel. </li><li> Exposer la seringue pour un 8 minutes supplémentaires de la lumière UV pour terminer la construction de l'hydrogel. Lorsque vous avez terminé, les cellules doivent être entièrement encapsulés au sein de l'hydrogel cylindriques (figure 3). </li><li> Ejecter l'hydrogel de la seringue et dans 1 ml de HBSS dans le puits d'une plaque de 24 puits brièvement laver le gel. Transférer le gel à 1 mL de médias dans le puits d'une plaque de 24 puits et la culture dans les conditions souhaitées. </li></ol> 4. Suivi hypoxie <ol><li> A tout moment pendant la culture, l'image des cellules par microscopie fluorescente pour suivre l'initiation de la signalisation hypoxique. Selon ce qui est imagé, vous pouvez créer une image de la plaque multi-puits ou de transférer le gel sur une lame de microscope avant de le placer sur la platine du microscope. Pic de l'excitation Ds Rouge est atteint à 556nm et de pic d'émission se produit à 586nm. L'émission est assez intense et donc photoblanchiment n'a pas été obed pour être problématique. Délai entre l'initiation de la production de protéines et de détection premier signal est d'environ 12 heures. Le signal est suffisamment précis pour identifier individuellement les cellules de signalisation, mais la résolution risque d'être insuffisante pour déterminer la localisation du signal intracellulaire. Dans les cellules de signalisation, le signal est généralement observée uniformément dans le cytoplasme. L'intensité du signal peut également augmenter l'exposition prolongée à l'hypoxie, mais nous n'avons pas encore totalement déterminé si cela est dû à l'expression accrue des protéines, l'accumulation de protéines dans l'ensemble, ou la maturation des protéines retardée. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple représentatif de min6 agrégats encapsulé dans un hydrogel PEG est montré dans la figure 4. Le gel réticulé sera solide tout au long, prenant la forme du récipient dans lequel la réaction a été effectuée. Un gel aux surfaces lisses et externe est préférable pour l'implantation d'une aide dans la prévention d'un nouveau corps étrangersponse. L'intérieur du gel, des agrégats de cellules doivent être entièrement fermés dans la matrice et distribuée de façon homogène pour permettre le transport des nutriments mieux. Des images représentatives de la signalisation hypoxique dans les min6 agrégats sont représentés dans la figure 5. Identique min6 agrégats infectées par le virus de marqueur ont été cultivées en soit 20% d'O 2 (5a) ou 1% d'O 2 (5b) pour 44 heures avant la capture d'image. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg"> Figure 1. Schéma de l'activité de notre système de marqueur de l'hypoxie. L'insertion du gène adénoviraux Ds Rouge RD et en amont permet de HRE promoteur induite par l'hypoxie production de la protéine fluorescente sous contrôle de HIF-1. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg"> Figure 2. Diagramme de procédure pour l'encapsulation en une seule étape de la dispersion min6 cellules dans un crosslinked hydrogel PEGDM. Pour chaque gel, les cellules dispersées sont en suspension dans 40μL de la solution de macromère photoactifs PEGDM. Il est placé dans une seringue de 1 ml décapitée et l'hydrogel est formé sous la lumière UV 365nm après 10-12 minutes. Une fois terminée, le disque d'hydrogel est retiré de la seringue, lavés et placés dans une assiette bien remplie moyen pour l'incubation. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg"> Figure 3. Diagramme de procédure pour l'encapsulation double étape de agrégées min6 cellules dans un hydrogel réticulé PEGDM. Pour chaque gel, une demi-gel est d'abord formée par réticulation UV de 20 pi de la solution de macromère photoactifs PEGDM pendant 8 minutes. Min6 agrégats sont soigneusement en suspension dans une solution de 20 pi supplémentaires de macromère photoactifs qui est ajouté au sommet de la pré-formé demi-gel. Le gel complet est formé par un 8 minutes supplémentaires d'exposition aux rayons UV avec des granulats entièrement encapsulé dans la médialeplan du gel. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg"> Figure 4. Image d'un hydrogel 40μL sous un grossissement de 20x. Min6 agrégats (~ 400 000 cellules au total) sont clairement visibles dans le gel. Diamètre est d'environ 6mm d'hydrogel (barre = 1 mm). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg"> Hypoxie Figure 5. Fluorescents de signalisation dans les cellules agrégées min6 dans un hydrogel PEGDM. Les cellules qui ont été encapsulées et ensuite mis en incubation à 20% d'O 2 pendant 44 heures ne s'affichent pas de signalisation hypoxie (a) tandis que les cellules qui ont été encapsulées puis incubés dans 2% O 2 pour 44 heures d'affichage signal clair et omniprésent. (Barre = 100 microns) (b).

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode présentée ici propose une technique simple et rapide pour l&#39;encapsulation de cellules dans un hydrogel PEG avec une utilisation minimale des conditions non physiologiques. PEG constitue un matériau d&#39;encapsulation très utile pour sa biocompatibilité et la facilité de modification. Simple variation du pourcentage de PEG dans la solution photoactifs, par exemple, peut être utilisé pour ajuster les propriétés mécaniques, telles que le module de compression et les propriétés de transport grâce à la taille des pores. En outre, le PEG est facilement modifiée par l&#39;ajout de chaînes latérales. Hydrogels PEG, par conséquent, représentent à la fois un dispositif clinique prometteur et une plateforme flexible pour la recherche in vitro Une méthode pour le suivi de l&#39;hypoxie dans le PEG-encapsulé cellules a également été présenté. Cette méthode est utile pour la simplicité de la détection d&#39;hypoxie et d&#39;éviter la nécessité de sacrifier les cellules d&#39;intérêt. La technique peut être appliquée à une variété de types de cellules dans une variété de conditions rendant son-nousefulness large. Par exemple, l&#39;hypoxie comme un indice de différenciation de cellules souches peuvent être suivis dans les cultures de cellules souches micromasse. Cependant, cette méthode ne peut être appliquée aux systèmes dispersés de cellules ou d&#39;un système dans lequel les cellules sont dispersées tard agrégées. En outre, la détection du signal fluorescent peut être difficile dans les tissus plus ou dense.

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 309028-500G </td><td></td></tr><tr><td> Anhydride méthacrylique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276 685-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Micro-ondes </td><td> Emerson </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries </td><td> SI-A236 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de méthylène </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D65100-1L </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éther diéthylique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 346136-1L </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de dialyse </td><td> Spectrum </td><td> 132640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Laboratoires </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Congélateur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Lyophilisateur </td><td> Labconco </td><td> 7670521 </td><td></td></tr><tr><td> Pompe à vide </td><td> Welch </td><td> 8917Z-01 </td><td></td></tr><tr><td> Irgacure 2959 </td><td> Ciba-Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21 à 022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Filtre seringue </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * La formulation personnalisée </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Laboratoires AAP </td><td> A15-351 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Mediatech </td><td> 30 à 002-CI </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B </td><td> Mediatech </td><td> 30 à 003-CF </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3597 </td><td> Napco Series 8000 WJ w / O2 de suppression </td></tr><tr><td> Trypsine EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25 à 052-CI </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> Lampe UV </td><td> Sanyo Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> Contient deux 40W, 365nm ampoules blacklight UV bleue </td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Eppendorf </td><td> 5811 000.010 * </td><td> * Numéro de commande. Modèle 5810 R </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Nikon </td><td> TI-ND6-PFS </td><td> Avec filterset pour l&#39;excitation 556nm / 586nm d&#39;émission </td></tr></table>

suivi de signalisation hypoxique dans les agrégats de cellules encapsulées

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

Dans le diabète de type 1, la destruction auto-immune des cellules β pancréatiques entraîne une perte de production d'insuline et une hyperglycémie potentiellement mortelle. En tant qu'option thérapeutique alternative à l'injection d'insuline exogène, la transplantation de tissu pancréatique fonctionnel a été explorée1,2. Cette approche offre la promesse d'une restauration plus naturelle et à long terme de la normoglycémie. Une protection du tissu donneur contre le système immunitaire de l'hôte est nécessaire pour éviter le rejet, et l'encapsulation est une méthode utilisée pour atteindre cet objectif.
Les matériaux d'origine biologique, tels que l'alginate3 et l'agarose4, ont traditionnellement été utilisés pour la fabrication de capsules, mais peuvent induire une inflammation ou une prolifération fibreuse5, ce qui peut entraver le transport des nutriments et de l'oxygène. En alternative, les hydrogels synthétiques à base de poly(éthylène glycol) (PEG) ne se dégradent pas, peuvent facilement être fonctionnalisés, sont disponibles en haute pureté, possèdent une taille de pores contrôlable et présentent une biocompatibilité extrême6,7,8. Un avantage supplémentaire réside dans la possibilité de former rapidement des hydrogels à base de PEG par une simple réaction de réticulation photochimique, qui ne nécessite pas l'application de températures non physiologiques6,7. Une telle procédure est décrite ici. Lors de la réticulation, la dégradation sous UV du photoinitiateur, le 1-[4-(2-hydroxyéthoxy)-phényl]-2-hydroxy-2-méthyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produit des radicaux libres qui attaquent les doubles liaisons carbone-carbone vinyliques du PEG diméthacrylé (PEGDM), induisant ainsi la réticulation aux extrémités des chaînes. La réticulation peut être réalisée en moins de 10 minutes. Des hydrogels de PEG fabriqués de cette manière ont démontré une capacité favorable à supporter les cellules7,9, et la faible concentration de photoinitiateur ainsi qu'une brève exposition aux rayons UV ne nuisent pas à la viabilité et à la fonction du tissu encapsulé10. Bien que nous méthacrylions notre PEG selon la méthode décrite ci-dessous, le PEGDM peut également être acheté directement auprès de fournisseurs tels que Sigma.
Une conséquence inhérente à l'encapsulation est l'isolement des cellules par rapport à un réseau vasculaire. L'apport en nutriments, notamment en oxygène, est donc réduit et limité par la diffusion. Cette disponibilité réduite en oxygène peut particulièrement affecter les cellules β, dont la fonction sécrétoire d'insuline dépend fortement de l'oxygène11-13. La composition et la géométrie de la capsule influencent également les taux et les distances de diffusion de l'oxygène. Nous décrivons donc également une technique permettant d'identifier les cellules hypoxiques au sein de nos capsules en PEG. L'infection des cellules par un adénovirus recombinant permet de produire un signal fluorescent lorsque les voies intracellulaires du facteur inductible par l'hypoxie (HIF) sont activées14. Étant donné que les HIF sont les régulateurs principaux de la réponse transcriptionnelle à l'hypoxie, ils constituent un marqueur cible idéal pour la détection des signaux hypoxiques15. Cette approche permet une détection simple et rapide des cellules hypoxiques. Brièvement, l'adénovirus contient la séquence d'une protéine fluorescente rouge (Ds Red DR de Clontech) placée sous le contrôle d'un élément de réponse à l'hypoxie (HRE) en forme de trimer. La stabilisation de HIF-1 dans des conditions de faible concentration en oxygène induit la transcription de la protéine fluorescente (figure 1). Des détails supplémentaires sur la construction de ce virus ont déjà été publiés précédemment15. Le virus est conservé dans 10 % de glycérol à -80 °C, en plusieurs aliquots de 150 μL dans des tubes de centrifugation de 1,5 mL, à une concentration de 3,4 × 1010 pfu/mL.
Des études antérieures menées dans notre laboratoire ont montré que les cellules MIN6 encapsulées sous forme d'agrégats conservent leur viabilité pendant 4 semaines de culture en présence de 20 % d'oxygène. Les agrégats de cellules MIN6 cultivés à 2 ou 1 % d'oxygène présentaient des signes de nécrose (avec une viabilité d'environ 85 à 90 %) détectés par coloration à l'éthidium bromure, ainsi que des modifications morphologiques par rapport aux cellules cultivées à 20 % d'oxygène. La forme sphérique lisse des agrégats observée à 20 % était perdue, et les agrégats apparaissaient plutôt comme des groupes désorganisés de cellules. Bien que le stress induit par la faible teneur en oxygène ne provoque pas de chute marquée de la viabilité, il affecte clairement l'agrégation et la fonction des cellules MIN6, comme en témoigne la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose15. Une analyse par immunoblot des cellules encapsulées cultivées à 20 % et à 1 % d'oxygène a également révélé une augmentation significative de HIF-1α dans les conditions de faible oxygénation, ce qui corrèle avec l'expression de la protéine DsRed DR.

Une méthode pour la photo-encapsulation de cellules dans un hydrogel PEG réticulé est décrite. De signalisation hypoxique dans les insulinome murin encapsulé (min6) agrégats sont suivis en utilisant un système de marqueur fluorescent. Ce système permet l&#39;examen en série de cellules dans un hydrogel et d&#39;échafaudage de corrélation de la signalisation hypoxique avec des changements dans le phénotype cellulaire.

Suivi de signalisation hypoxique dans les agrégats de cellules encapsulées

Dans le diabète sucré de type 1, la destruction auto-immune des cellules &beta; pancréatiques entraîne une perte de la production d'insuline et peut s'avérer mortelle...

L'objectif général de cette procédure est de surveiller la réponse cellulaire à l'hypoxie dans des agrégats cellulaires encapsulés dans du PEG. Dans la première étape, des cellules dispersées sont infectées par le virus marqueur, puis cultivées sur un agitateur pour permettre la formation d'agrégats. Ensuite, le PEG linéaire est fonctionnalisé et le dimère de PEG DM est purifié.Ensuite, les agrégats cellulaires sont encapsulés dans un hydrogel de PEG DM. Enfin, les hydrogels sont cultivés dans diverses conditions d'oxygène tout en étant surveillés par fluorescence pour détecter le signal du marqueur d'hypoxie. En définitive, la localisation et l'ampleur de l'activité du facteur inductible par l'hypoxie au sein des agrégats cellulaires viables encapsulés peuvent être visualisées par une simple microscopie en fluorescence.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'encapsulation cellulaire et de la délivrance thérapeutique basée sur les cellules, telles que : Où l'hypoxie se produit-elle au sein des cultures tridimensionnelles, et comment affecte-t-elle la survie et la fonction cellulaire ? Les implications de cette technique s'étendent aux approches de médecine régénérative et au traitement des déficiences hormonales, comme le diabète de type 1, en raison de l'impact majeur de l'hypoxie sur les tissus agrégés et encapsulés. L'activité du facteur inducible par l'hypoxie un a été associée à une sécrétion d'insuline fortement réduite par les cellules bêta, ce qui motive les tentatives de dissocier les îlots primaires et de les reconstituer sous forme d'îlots pseudo-isolés.Des agrégats de diamètre réduit. Notre marqueur peut indiquer l'activité du facteur inducible par l'hypoxie grâce à des agrégats au niveau cellulaire au sein de tout matériau encapsulant relâché. Le PEG a été choisi comme matériau de capsule en raison de ses propriétés de transfert favorables, de sa biocompatibilité et de la facilité avec laquelle il peut être modifié fonctionnellement.Après avoir pesé deux grammes de PEG dans un flacon en verre de 40 millilitres, ajouter environ 308 microlitres de méthacrylique anhydride et fermer légèrement le flacon avec un bouchon en plastique rigide. Placer le flacon au four à micro-ondes à puissance maximale pendant deux minutes dans un micro-ondes domestique standard. Ensuite, porter des gants résistant à la chaleur, vortexer soigneusement le flacon, puis soumettre la solution à un nouveau traitement au micro-ondes à puissance maximale pendant cinq minutes supplémentaires.Laissez brièvement refroidir le flacon suffisamment pour pouvoir le manipuler, puis dévissez le bouchon tout en faisant tourner le flacon. Incorporez lentement du chlorure de méthylène, en vortexant l'échantillon au besoin jusqu'à ce que la solution apparaisse claire et homogène. Ensuite, ajoutez la solution goutte à goutte à 200 millilitres d'éther éthylique froid sous agitation pour précipiter le PEG dm.Ensuite, recueillir le DM de PEG par filtration sous vide et laisser sécher. Une fois le DM de PEG sec, le dissoudre dans environ 100 à 150 millilitres d'eau déionisée. Puis dialyser la solution contre de l'eau déionisée pendant cinq jours dans un tube de dialyse ayant une limite de poids moléculaire de 1000 Daltons après dialyse.Transférez la solution dans des récipients appropriés et congélez-les à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, lyophilisez la solution pendant quatre jours afin d'obtenir une poudre blanche purifiée de PEG DM pour détacher les cellules de la surface du flacon de culture traité. Commencez par aspirer le milieu, rincez les cellules avec du HBSS sans calcium ni magnésium à 37 degrés Celsius, puis aspirez le HBSS.Ajoutez maintenant deux millilitres de solution de trips et d'EDTA à 37 degrés Celsius, puis laissez les cellules s'incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Secouez ensuite fermement le côté du flacon pour détacher les cellules, ajoutez huit millilitres de milieu à 37 degrés Celsius au flacon et pipetez vigoureusement la suspension cellulaire de haut en bas, en prenant soin de ne pas introduire de bulles.Après avoir transféré la solution cellulaire dans un tube stérile de centrifugeuse de 15 millilitres, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre afin de déterminer le nombre total de cellules à infecter. Ajoutez le volume nécessaire de suspension cellulaire pour obtenir 400 000 cellules par puits dans les puits d’une plaque de culture en suspension à six puits ; aliquotez 50 microlitres de HBSS par puits de cellules à infecter dans un tube de microcentrifugeuse de 1,8 millilitre. Ensuite, pipetez soigneusement la quantité appropriée de suspension virale dans le HBSS préparé.Ajoutez maintenant le volume approprié de virus dilué dans chaque puits afin d'obtenir le MOI souhaité, puis ajoutez du milieu dans chaque puits pour porter le volume total à 1,7 millilitre. Enfin, placez la plaque sur un agitateur orbital à l'intérieur de l'incubateur, réglez l'agitateur sur une vitesse faible d'environ 100 tr/min afin que le milieu circule doucement dans les puits, et laissez les cellules s'agréger pendant 24 à 36 heures. Commencez par couper l'extrémité effilée d'une seringue en plastique de un millilitre et placez-la, ouverte vers le haut, dans un support afin de créer un récipient dans lequel l'hydrogel se formera.Ensuite, pipetez 20 microlitres de solution de PEG DM photo-activable à l'extrémité ouverte de la seringue, directement sur le piston, en veillant à ce que le volume recouvre entièrement la surface du piston. Ajustez le piston par petits incréments afin d'obtenir une surface plane de liquide. Replacez ensuite la pipette dans le support et positionnez le support sous une lampe à rayons UV pendant environ huit minutes pour permettre la réticulation de l'hydrogel.Pendant ce temps, prélevez à l’aide d’une pipette le volume contenant le nombre désiré de cellules et d’agrégats dans un tube microcentrifuge de 1,8 millilitre. Fermez le tube et centrifugez ensuite les cellules et les agrégats pendant cinq minutes à 130 ×g. Puis, à l’aide d’une micropipette, retirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot cellulaire situé à l’extrémité du tube.Lorsque la tête du distributeur s'approche du culot, utilisez une micropipette plus fine de 10 microlitres pour répartir uniformément les agrégats cellulaires dans la solution précurseur du gel, tout en veillant à ce qu'ils soient entièrement encapsulés. C'est l'étape la plus délicate de cette procédure. Lors de l'exécution de cette étape, veillez à resuspendre et à transférer délicatement le culot.Resuspendez maintenant délicatement le culot cellulaire dans 20 microlitres de la solution photo-activable de PEG DM. À l’aide d’une pipette à embout large, ajoutez la suspension cellulaire dans la seringue, par-dessus la partie d’hydrogel réticulé, puis exposez la seringue à huit minutes supplémentaires de lumière UV afin de terminer la construction de l’hydrogel. Une fois terminé, les cellules doivent être entièrement encapsulées au sein de l’hydrogel cylindrique.Enfin, ajoutez un millilitre de HBSS dans un puits d'une plaque 24 puits et un millilitre de milieu dans un autre. Éjectez ensuite l'hydrogel de la seringue dans le HBSS pour rincer brièvement le gel. Transférez le gel dans le milieu et cultivez la plaque dans les conditions souhaitées.À tout moment pendant la culture, les cellules peuvent être observées par microscopie fluorescente afin de suivre l'initiation de la signalisation hypoxique : placer la plaque à 24 puits sur la platine du microscope et centrer le puits contenant l'hydrogel sous l'objectif. Le signal est suffisamment spécifique pour identifier des cellules individuelles en cours de signalisation, mais la résolution peut être insuffisante pour déterminer la localisation intracellulaire du signal. Dans les cellules signalisantes, le signal est généralement observé de manière uniforme dans tout le cytoplasme.Cette figure montre un exemple représentatif d'agrégats minx encapsulés dans un hydrogel PEG à l'intérieur de la cellule de gel. Les agrégats doivent être entièrement enfermés dans la matrice et répartis de manière homogène afin de permettre un meilleur transport des nutriments, comme observé ici. Remarquez comment le gel réticulé est solide en tout point et prend la forme du récipient dans lequel la réaction a été réalisée.Dans cette figure, on observe une signalisation fluorescente représentative de l'hypoxie dans des agrégats de six cellules min encapsulées dans un hydrogel PEG DM, placées ensuite en incubation à 20 % d'oxygène pendant 44 heures. Les cellules représentées à gauche ne montrent aucune signalisation d'hypoxie, tandis que les cellules encapsulées puis incubées à 2 % d'oxygène pendant 44 heures, telles qu'illustrées à droite, présentent un signal d'hypoxie clair et ubiquitaire. Cette signalisation peut également être suivie dans d'autres types cellulaires.Cette figure montre un signal hypoxique représentatif dans des agrégats de cellules souches mésenchymateuses encapsulés. Comme on le voit sur l'image la plus à gauche, le signal fluorescent n'est pas détectable après 12 heures à 2 % d'oxygène, puis devient plus apparent après 24 heures à 2 % d'oxygène, comme illustré sur l'image centrale. Enfin, comme indiqué sur l'image de droite, il est fortement exprimé après 96 heures à 2 % d'oxygène, suite à cette procédure.D'autres méthodes, telles que le test Eliza, l'analyse des protéines sécrétées et les tests de viabilité cellulaire, peuvent être réalisées afin de corréler la signalisation hypoxique avec le phénotype cellulaire. Grâce à ce développement, cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines du génie tissulaire et de la thérapie cellulaire à base de vecteurs, pour explorer la fonction de survie et la différenciation des cellules au sein de supports tridimensionnels et de matériaux d'encapsulation.

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