Modélisation et Imagerie en 3 dimensions l'invasion des cellules collectives

Ce système expérimental vise à caractériser la contribution de protéines spécifiques au processus invasif. Commencez par la transduction rétrovirale des cellules avec la protéine fluorescente d'intérêt. Préparez également la matrice tridimensionnelle de protéine Matrigel dans des inserts Transwell, puis mettez au point une suspension cellulaire à la dilution appropriée.

À l'aide du système Matrigel transwell, mesurez la réponse de transmigration au chémotactique en présence de médicaments ou de traitements expérimentaux, puis procédez à la visualisation et à l'analyse de l'invasion cellulaire par microscopie confocale. En fin de compte, les résultats permettent de déterminer l'ampleur et le mode d'invasion cellulaire dans une matrice protéique tridimensionnelle. L'avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le test d'invasion Transwell classique, réside dans sa capacité à fournir à la fois des données quantitatives et qualitatives sur l'invasion cellulaire dans une matrice protéique tridimensionnelle.

Ma collaboratrice, Diane Creighton, va maintenant démontrer la méthode : cultiver les cellules d’emballage rétroviral dans du DMEM contenant 10 % de FBS pendant 48 heures. Transfecter les cellules avec l’ADN rétroviral selon les instructions du fabricant. Incuber pendant 24 heures, rincer les puits deux fois avec du milieu, puis ajouter 1,5 millilitre de DMEM avec 10 % de FCS par puits, et incuber pendant 48 heures afin de recueillir le rétrovirus conditionné.

Transférez le milieu de culture tissulaire dans des tubes microcentrifugeurs de deux millilitres, centrifugez pour former un culot contenant les cellules éventuelles et récupérez le surnageant dans un tube propre. Conservez ce stock de rétrovirus à moins 80 degrés Celsius. Pour les cellules rétrotransduites, retirez le milieu d'une culture réalisée pendant la nuit et ajoutez un millilitre de stock de rétrovirus enrichi en polybrene.

Après une incubation de six heures, ajoutez deux millilitres de DMEM contenant 10 % de SBF par puits et placez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Pendant la nuit, renouvelez le milieu, puis après 24 heures, ajoutez le milieu sélectif approprié, récoltez les cellules au moment de la confluence et effectuez un tri en fonction de la fluorescence en utilisant les cellules non transduites comme référence. Récupérez les cellules présentant une fluorescence supérieure à celle des cellules non transduites et conservez des aliquotes à −80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.

Cette méthode repose sur l'expression de protéines fluorescentes pour la visualisation et permet d'obtenir des informations sur les contributions individuelles des cellules. Prenez le gel matrigel complet sur glace, puis diluez-le au volume égal en PBS glacé. Insérez ensuite les inserts non revêtus dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits.

Ensuite, pipeter soigneusement 100 microlitres de matri gel dilué dans les puits et laisser durcir à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, préparer les suspensions de cellules marquées par fluorescence dans leur milieu de croissance habituel. Lorsque le matri gel est solidifié, retourner les inserts et pipeter 100 microlitres de la suspension cellulaire sur la face inférieure du filtre, orientée vers la sortie.

Couvrez soigneusement les inserts avec le fond d'une plaque de culture tissulaire 24 puits en prenant soin de toucher chaque gouttelette de suspension cellulaire. Incubez la plaque en position inversée pendant quatre heures afin de permettre l'attachement des cellules. Retournez ensuite les plaques à l'endroit et lavez chaque insert en les trempant deux fois dans un millilitre de milieu sans sérum.

Ensuite, placer l'insert dans un troisième puits contenant des médicaments ou des réactifs de traitement. À l’aide d’une pipette, ajouter délicatement 100 microlitres de milieu contenant l’agent chimiotactique dans l’insert, par-dessus le mélange solidifié de Matrigel et de PBS. Incuber de trois à cinq jours à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone afin d’imager les cellules non fluorescentes en train d’envahir le Matrigel.

Placer les inserts dans des plaques de 24 puits fraîches et pipeter. Un millilitre de solution de calcium AM à quatre micromolaire sur chaque bouchon de MatriGel, en laissant la solution déborder sur les côtés afin de permettre une coloration par le haut et par le bas. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, observer par microscopie confocale.

Cette première méthode de coloration vitale permet de visualiser les modes d'envahissement. Transférer chaque insert dans une plaque de 24 puits fraîche contenant un millilitre de paraformaldéhyde 4 % et de Triton X-100 0,2 %, puis incuber à température ambiante pendant une demi-heure. Après trois lavages avec un millilitre de PBS, ajouter de l'ARNase A pendant 30 minutes, puis effectuer deux lavages au PBS pour la visualisation à une concentration de 0,01 milligramme par millilitre.

Diluer l'iodure de propidium dans du PBS et laisser à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. Rincer trois fois avec du PBS. À ce stade, les inserts colorés à l'iodure de propidium peuvent être conservés à température ambiante à l'abri de la lumière pendant au moins un mois.

La deuxième méthode de coloration des cellules nécessite une fixation, mais permet une quantification plus rapide de l'envahissement. À l’aide d’un microscope confocal inversé, placer le transwell avec une petite quantité de PBS résiduel sur une grande lame couvre-objet, en utilisant un objectif 20 fois sans immersion, et capturer des sections optiques tous les 10 à 15 micromètres à partir du fond du bouchon de Matrigel. Quantifier l’importance de l’envahissement à l’aide de tranches optiques individuelles. Construire également des objets tridimensionnels à l’aide d’un logiciel approprié tel que Velocity à partir de cette série de coupes optiques, les cellules ayant été colorées avec du calcium AM.

Comme prévu, le nombre de cellules qui envahissent depuis le filtre diminue avec la distance. Cette invasion peut être quantifiée. Des reconstructions tridimensionnelles de l'envahissement cellulaire offrent une représentation visuelle du mode d'envahissement.

Si les cellules sont marquées par l'expression de protéines fluorescentes, alors les positions des cellules de chaque couleur peuvent être visualisées dans des reconstructions tridimensionnelles, comme le montre cette vue latérale. En outre, des coupes à travers la reconstruction peuvent fournir des informations sur les mécanismes moléculaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser ce test d'envahissement cellulaire pour obtenir davantage d'informations sur le processus d'évasion que ce qui est possible avec les méthodes standard.