Skeletal Muscle dimorphisme des sexes de la protéomique

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la spécificité du sexe des différences dans les profils protéomiques du muscle squelettique. Ceci est accompli en hachant d’abord et en homogénéisant soigneusement les tissus oculaires du biceps brachy de souris mâles et femelles afin d’extraire la plupart des protéines. Ensuite, l’échantillon est appliqué sur une bande de gel IEF, et les protéines sont séparées en fonction de leur point isoélectrique, suivie d’une page SDS, séparation dans la deuxième dimension en fonction de la taille, suite à la coloration et à l’imagerie des gels, les profils protéomiques des échantillons de muscles masculins et féminins sont comparés et les points présentant des différences significatives d’abondance entre les deux sexes sont excisés.

Enfin, les protéines contenues dans les bouchons de gel sont digérées avec de la trypsine. Les peptides résultants sont extraits du gel et soumis à une nanochromatographie liquide, une analyse par spectrométrie de masse pour l’identification. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l’expression différentielle des protéines dans deux ou plusieurs conditions expérimentales grâce à l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle et à la protéomique basée sur la spectrométrie de masse.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la spécificité du sexe musculaire, elle peut également être appliquée à d’autres cellules, tissus, organes ou fluides dans divers états physiologiques. La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Kalina Diva, directrice technique du Smith College Center for proteomics. Après avoir isolé le nettoyage et haché le muscle squelettique de la souris à 45 microlitres d’extraction, tampon par gramme de tissu, reportez-vous au protocole écrit pour cette recette et toutes les autres recettes de tampon à l’aide d’un pilon motorisé, homogénéisez le tissu sept fois pendant 15 secondes chacune à quatre degrés Celsius avec deux minutes de refroidissement sur glace entre chaque homogénéisation.

Centrifuger les échantillons à 15 800 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Enregistrez le supernat et mesurez son volume. Jetez la pastille pour précipiter les protéines à trois volumes de glace.

Acétone de qualité réactif à froid par volume de surnageant. Faites vortex les tubes pendant 15 secondes, puis centrifugez à 15, 800 G pendant 10 secondes pour former des granulés. Jetez le supernat et remettez en suspension les granulés et le tampon d’extraction avec le pilon motorisé et les tiges d’agitation en polypropylène précipitent les protéines une deuxième fois en ajoutant trois volumes supplémentaires d’acétone.

Après avoir remis en suspension la pastille et le tampon d’extraction, déterminez la concentration en protéines et/ou stockez les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Pour effectuer une focalisation isoélectrique des protéines, retirez une bande IPG prête à l’emploi du congélateur à moins 20 degrés Celsius et laissez-la s’équilibrer à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Vortex l’échantillon et pipette 600 à 800 microgrammes de protéines en ligne droite sur le bord arrière d’un canal dans le plateau de réhydratation de l’échantillon, en laissant environ un centimètre à chaque extrémité.

À l’aide d’une pince, décollez le couvercle en plastique de la bande IPG en veillant à ne manipuler que les extrémités de la bande et en évitant tout contact avec le gel. Notez l’extrémité positive de la bande et positionnez-la sur le côté gauche du plateau. Placez la bande IPG côté gel vers le bas sur l’échantillon.

Évitez de coincer des bulles en dessous. Laissez-le se réhydrater pendant une heure. Recouvrir la bande de 2,5 millilitres d’huile minérale.

Couvrez le plateau avec un couvercle et laissez-le se réhydrater pendant la nuit. Le lendemain, à température ambiante, placez une mèche en papier aux deux extrémités du canal de focalisation et mouillez chacune d’elles avec 10 microlitres d’eau millipore. Retirez la bande IPG et maintenez-la verticalement pendant environ 10 secondes.

Pour vider l’huile, épongez le support en plastique avec une lingette Kim. Placez la bande IPG côté gel vers le bas avec l’extrémité de base vers la gauche. Dans le plateau de mise au point, couvrez la bande avec 2,5 millilitres d’huile minérale.

Positionnez le plateau dans la cellule IEF protéiforme et programmez un protocole en trois étapes à une température de cellule par défaut de 20 degrés Celsius, un courant maximum de 50 microampères par bande et aucun temps de réhydratation. Une fois le programme terminé, transférez le site de la bande de gel jusqu’à un plateau d’équilibrage de 11 centimètres. Ajoutez quatre millilitres de tampon réducteur dans le canal et équilibrez la bande pendant 10 minutes en secouant doucement.

Retirez le tampon de réduction et ajoutez quatre millilitres de tampon d’alkylation dans le canal et équilibrez la bande en secouant pendant 10 minutes supplémentaires. Rincez la bande IPG en la trempant brièvement dans un tampon XSDS. Ensuite, posez la bande de gel côté vers le haut sur la plaque arrière d’un critère de 11 centimètres.

Gel polyacrylamide préfabriqué 10,5 à 14 % tris H-C-L-S-D-S et enfoncez-le doucement pour qu’il entre en contact complet avec le gel SDS. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est coincée entre les deux surfaces de gel. Recouvrir la bande IPG d’un millilitre de solution agricole fondue et la laisser se solidifier pendant cinq minutes.

Ensuite, chargez cinq microlitres de marqueur protéique dans le simple. Faites bien fonctionner le gel dans le tampon SDS à 200 volts à température ambiante ou à quatre degrés Celsius. Lorsque la face du colorant atteint le bas du gel, retirez-le du plâtre en plastique et teignez-le pendant la nuit en le secouant doucement en bleu brillant Kumasi.

Agitez le gel dans une solution deux fois pendant trois heures chacune et conservez-en deux pendant la nuit. Conservez le gel dans de l’acide acétique à 7 % pour analyse. Après avoir imagé le gel, effectué une analyse comparative des motifs de points entre les gels et découpé les points d’intérêt à 200 microlitres de solution de rétention dans le vortex de bouchons de gel et incubé les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes en agitant.

Ensuite, retirez et jetez soigneusement la solution et répétez. Ajoutez 30 microlitres de tampon réducteur fraîchement préparé dans les tubes contenant les bouchons de gel et incubez à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Laissez refroidir les échantillons.

Retirez et jetez ensuite le tampon. Ajoutez 30 microlitres de tampon d’alkylation et incubez les échantillons dans l’obscurité à température ambiante Pendant une heure, retirez et jetez le tampon d’alkylation. Lavez les bouchons de gel en ajoutant 200 microlitres de solution de rétention dans chaque tube et incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Retirez et jetez la solution de rétention et répétez le lavage. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’acéto nitrile aux bouchons de gel et incubez-les pendant 10 minutes à température ambiante pour leur permettre de rétrécir à sec. Retirez ensuite délicatement l’acéto nitrile et répétez l’opération avec les morceaux de gel.

Devrait avoir l’air blanc et petit. Laissez sécher les morceaux de gel dans un concentrateur pendant 10 minutes. Gonflez les morceaux de gel en ajoutant 10 microlitres de solution de tripsin activée.

Incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ajoutez 25 microlitres de tampon de digestion dans les tubes. Incuber les échantillons à température ambiante pendant la nuit, en les agitant, les soniser pendant 10 minutes et les faire tourner vers le bas avant de transférer le surnageant dans un tube frais.

Pour extraire davantage les peptides, ajoutez 10 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans les bouchons et incubez pendant cinq minutes à température ambiante en agitant les échantillons pendant 10 minutes. Récupérez le surnageant et combinez-le avec le surnageant précédemment enregistré. Les protéines peuvent ensuite être dessalées et préparées pour la spectrométrie de masse couplée à la HPLC, le muscle squelettique miroir masculin et féminin non exercé a été extrait et séparé en une carte bidimensionnelle.

Une fois visualisé à l’aide de l’imagerie numérique à haute résolution, environ 800 taches protéiques ont été détectées dans chacun, comme on le voit ici. En utilisant la carte du protéome masculin comme référence, il est clair qu’il existe de nombreuses taches dont l’abondance change chez les femelles Les taches qui ont augmenté de plus de deux fois chez les femelles sont entourées de rouge, et celles qui ont diminué de plus de deux fois sont entourées de bleu. L’identité des taches protéiques qui changent plus de deux fois vers le haut ou vers le bas et qui sont statistiquement significatives avec un N de cinq souris est déterminée par analyse de la séquence d’acides aminés à l’aide de la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide.

Dans ce graphique, l’axe des x représente les souris femelles avant l’exercice, et l’axe des y représente un seul groupe de points temporels d’environ zéro heure. Les résultats montrent que les femelles présentent une diminution abondante du métabolisme énergétique du sucre, des enzymes et de l’enzyme créatine kinase isoforme un système d’approvisionnement énergétique différent dans les muscles. Les humains et les animaux présentent des taux sériques de CK masculins plus élevés au repos et après l’exercice, mais les taux sériques de CK ne sont pas nécessairement corrélés avec la quantité de myofibrillaire.

Ce dimorphisme de genre dans l’abondance cellulaire de CK dans le muscle miren biceps brachial est une nouvelle découverte et pourrait répondre aux taux sériques de CK physiologiquement différents. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immuno-transfert quantitatif peuvent être effectuées afin de vérifier les résultats. Après avoir regardé cette vidéo, nous devrions avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de séparer les échantillons pour le profilage différentiel du protéome.