Skeletal Muscle dimorphisme des sexes de la protéomique

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la spécificité selon le sexe des différences dans les profils protéomiques du muscle squelettique. Cela est réalisé en premier lieu en hachant et en homogénéisant soigneusement des tissus de biceps brachial provenant de souris mâles et femelles afin d'extraire la majorité des protéines. Ensuite, l'échantillon est appliqué sur une bande de gel IEF, et les protéines sont séparées selon leur point isoélectrique, puis soumises à une électrophorèse SDS-PAGE, qui assure une séparation en deuxième dimension selon la taille. Après coloration et imagerie des gels, les profils protéomiques des échantillons musculaires mâles et femelles sont comparés, et les taches présentant des différences significatives d'abondance entre les deux sexes sont découpées.

Enfin, les protéines présentes dans les pastilles de gel sont digérées à l'aide de trypsine. Les peptides obtenus sont extraits du gel puis soumis à une chromatographie liquide nano, suivie d'une analyse en spectrométrie de masse pour identification. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant une expression différentielle de protéines dans deux conditions expérimentales ou plus, grâce à la protéomique basée sur l'électrophorèse bidimensionnelle et la spectrométrie de masse.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la spécificité musculaire liée au sexe, elle peut également être appliquée à d'autres cellules, tissus, organes ou fluides dans différents états physiologiques. La procédure sera démontrée par le Dr Kalina Diva, directrice technique du Centre de protéomique du Smith College. Après avoir isolé, nettoyé et haché le muscle squelettique de souris à raison de 45 microlitres de tampon d'extraction par gramme de tissu, consultez le protocole écrit pour celui-ci et toutes les autres recettes de tampons ; à l'aide d'un pilon motorisé, homogénéisez le tissu sept fois pendant 15 secondes chacune à quatre degrés Celsius, en refroidissant deux minutes sur de la glace entre chaque homogénéisation.

Centrifuger les échantillons à 15 800 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Conserver le surnageant et mesurer son volume. Jeter le culot pour précipiter les protéines à trois volumes de glace.

Acétone froide de qualité réactif par volume de surnageant. Vortexer les tubes pendant 15 secondes, puis centrifuger à 15 800 Gs pendant 10 secondes pour former des culots. Jeter le surnageant et resuspendre les culots dans le tampon d'extraction à l'aide d'un pilon motorisé et de baguettes en polypropylène, puis précipiter les protéines une deuxième fois en ajoutant trois volumes supplémentaires d'acétone.

Après avoir resuspendu le culot dans le tampon d'extraction, déterminez la concentration en protéines et/ou conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Pour réaliser la focalisation isoélectrique des protéines, retirez une bande IPG prête à l'emploi du congélateur à moins 20 degrés Celsius et laissez-la équilibrer à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Vortexez l'échantillon et pipetez 600 à 800 microgrammes de protéines en ligne droite le long du bord arrière d'un canal du plateau de rehydratation, en laissant environ un centimètre libre à chaque extrémité.

À l’aide de pinces, retirez le couvercle en plastique du ruban IPG, en veillant à ne manipuler que les extrémités du ruban et à éviter tout contact avec le gel. Repérez l’extrémité marquée positive du ruban et placez-la du côté gauche du plateau. Positionnez le ruban IPG, côté gel vers le bas, au-dessus de l’échantillon.

Évitez de piéger des bulles d'air en dessous. Laissez-la réhydrater pendant une heure. Recouvrez la bande de 2,5 millilitres d'huile minérale.

Couvrez le plateau avec un couvercle et laissez-le réhydrater toute la nuit. Le jour suivant, à température ambiante, placez une mèche en papier à chaque extrémité du canal de focalisation et humidifiez chacune avec 10 microlitres d'eau Millipore. Retirez le ruban IPG et tenez-le verticalement pendant environ 10 secondes.

Pour évacuer l'huile, tamponnez le support plastique avec un essuie-tout Kim. Placez la bande IPG, côté gel vers le bas, l'extrémité basique à gauche. Dans le bac de focalisation, recouvrez la bande de 2,5 millilitres d'huile minérale.

Placer la cassette dans la cellule IEF protean et programmer un protocole en trois étapes à une température par défaut de la cellule de 20 degrés Celsius, un courant maximal de 50 microampères par bande et sans temps de réhydratation. Une fois le programme terminé, transférer la bande, face du gel vers le haut, dans une cassette d'équilibration de 11 centimètres. Ajouter quatre millilitres de tampon réducteur dans le canal et équilibrer la bande pendant 10 minutes avec un léger agitation.

Éliminer le tampon de réduction et ajouter quatre millilitres de tampon d'alkylation dans le canal. Équilibrer la bande avec agitation pendant 10 minutes supplémentaires. Rincer la bande IPG en la trempant brièvement dans un tampon de migration XSDS 1X. Ensuite, placer la bande, côté gel vers le haut, sur la plaque arrière d'un critère de 11 centimètres.

Placer délicatement un gel préfabriqué d'acrylamide de tris H-C-L-S-D-S de 10,5 à 14 % afin qu'il adhère complètement au gel SDS. S'assurer qu'aucune bulle n'est piégée entre les deux surfaces de gel. Recouvrir la bande IPG d'un millilitre de solution d'agarose fondue et laisser durcir pendant cinq minutes.

Ensuite, chargez cinq microlitres de marqueur protéique dans le puits unique. Faites migrer le gel dans du tampon SDS à 200 volts à température ambiante ou à quatre degrés Celsius. Lorsque le front de colorant atteint le bas du gel, retirez-le du moule en plastique et faites-le colorer toute la nuit en agitant doucement dans du bleu brillant de Kumasi.

Agiter le gel dans la solution de rétention une, deux fois pendant trois heures chacune, puis dans la rétention deux, toute la nuit. Conserver le gel dans de l'acide acétique à 7 % pour analyse. Après avoir obtenu l'image du gel, effectuer une analyse comparative des profils de taches entre les gels et découper les taches d'intérêt ; ajouter 200 microlitres de solution de rétention aux plots de gel, vortexer et incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes avec agitation.

Ensuite, retirez soigneusement la solution et jetez-la, puis répétez l'opération. Ajoutez 30 microlitres de tampon réducteur fraîchement préparé dans les tubes contenant les bouchons de gel et incubez à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Laissez les échantillons refroidir.

Ensuite, retirez et jetez le tampon. Ajoutez 30 microlitres de tampon d'alkylation et incubez les échantillons à l'obscurité à température ambiante pendant une heure, puis retirez et jetez le tampon d'alkylation. Lavez les pastilles de gel en ajoutant 200 microlitres de solution de révélation à chaque tube et incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Éliminer et jeter la solution de rétention et répéter le lavage. Ensuite, ajouter 50 microlitres d'acétonitrile sur les morceaux de gel et les incuber pendant 10 minutes à température ambiante afin de permettre leur dessiccation et rétraction. Puis retirer soigneusement l'acétonitrile et répéter l'opération avec les morceaux de gel.

Doit apparaître blanc et de petite taille. Laisser sécher les morceaux de gel dans un concentrateur pendant 10 minutes. Faire gonfler les morceaux de gel en ajoutant 10 microlitres de solution de tripsine activée.

Incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter 25 microlitres de tampon de digestion dans les tubes. Incuber les échantillons à température ambiante toute la nuit sous agitation, soniquer les échantillons pendant 10 minutes, puis les centrifuger avant de transférer le surnageant dans un tube propre.

Pour extraire davantage de peptides, ajouter 10 microlitres d'acide formique à 0,1 % aux prélèvements et incuber cinq minutes à température ambiante sous agitation. Soniquer les échantillons pendant 10 minutes. Recueillir le surnageant et le combiner avec le surnageant précédemment conservé. Les protéines peuvent ensuite être désalinisées et préparées pour une spectrométrie de masse couplée à une chromatographie liquide haute performance. Des muscles squelettiques mâles et femelles non exercés, reflétant ceux-ci, ont été extraits et séparés en une carte bidimensionnelle.

Le premier niveau du protéome musculaire comparatif, une fois visualisé à l'aide d'une imagerie numérique haute résolution, révèle environ 800 taches protéiques détectées dans chaque échantillon, comme indiqué ici. En utilisant la carte du protéome mâle comme référence, il est clair qu'il existe de nombreuses taches dont l'abondance varie dans le protéome femelle : les taches dont l'abondance augmente d'au moins deux fois chez les femelles sont entourées en rouge, et celles dont l'abondance diminue d'au moins deux fois sont entourées en bleu. Les identités des taches protéiques dont l'abondance varie de plus de deux fois, qu'elle augmente ou diminue, et qui sont statistiquement significatives avec un N de cinq souris, sont déterminées par analyse de la séquence en acides aminés à l'aide de la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide.

Dans ce graphique, l'axe des x représente les souris femelles avant l'exercice, et l'axe des y représente un groupe au point temporel de zéro heure d'une séance unique. Les résultats montrent que les femelles présentent une diminution importante du métabolisme énergétique glucidique, des enzymes et des isoformes de l'enzyme créatine kinase, un système d'approvisionnement énergétique différent dans les muscles. Les humains et les animaux présentent des taux sériques de CK plus élevés chez les mâles au repos et après l'exercice, mais les taux sériques de CK ne corrélaient pas nécessairement avec la quantité de myofibrilles.

Ce dimorphisme sexuel concernant l'abondance cellulaire de la CK dans le muscle biceps brachial des miren est une découverte nouvelle et pourrait expliquer les différences physiologiques observées au niveau des concentrations sériques de CK. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que le dosage immuno-enzymatique quantitatif, peuvent être réalisées afin de confirmer ces résultats. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer et séparer des échantillons en vue d'un profilage protéomique différentiel.