Name: Déterminer lactivité phagocytaire des échantillons danticorps cliniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Apprenez à mesurer l'activité phagocytaire des anticorps spécifiques d'antigènes dans des échantillons cliniques par cytométrie en flux à haut débit. Cette méthode utilise des billes fluorescentes et une lignée monocytaire THP-1.

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Les auteurs tiennent à remercier le financement du NIH 3R01AI080289-02S1, et une université de Harvard Center for AIDS Research Fellowship Scholar sous NIH / NIAID 2P30AI060354-07.

1. Cellules phagocytaires Culture <ol><li> Culture cellules THP-1 10 dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal comme une suspension stationnaire dans des flacons T. Densité cellulaire doit être maintenue au-dessous 0.5x10 6 / ml afin de maintenir un niveau constant de l&#39;expression FcyR et performance du test. </li></ol> 2. Préparer l&#39;antigène biotinylé <ol><li> Calculer la quantité de sulfo-NHS kit LC réactifs nécessaires à la biotine biotinyler l&#39;antigène cible d&#39;intérêt selon les instructions du fabricant. </li><li> Dissoudre le réactif de biotinylation dans l&#39;eau et ajouter immédiatement le montant calculé à l&#39;antigène dans un tampon qui ne contient pas les amines primaires. Laisser la réaction se dérouler pendant 1 heure à température ambiante, en mélangeant de temps en temps. </li><li> Enlever l&#39;excès, de la biotine non conjuguée par un échange de tampon dans une unité de concentration Amicon centrifuge d&#39;un poids moléculaire limite opportun de conserver la targeantigène T. Ajouter l&#39;échantillon à la chambre supérieure de l&#39;unité de concentration et d&#39;ajouter du PBS pour porter le volume total pouvant aller jusqu&#39;à 15 ml ligne de remplissage. Centrifuger à 4000 xg pour apporter du volume jusqu&#39;à environ 1,5 ml. Répétition ce processus deux fois va supprimer 99% de la biotine libre pour assurer revêtement maximale de l&#39;antigène à des billes. </li></ol> 3. Préparer Perles Antigène saturés <ol><li> Lavez 100 pl de billes 1 mm neutravidine fluorescentes à deux reprises dans 1 ml de PBS à 0,1%-BSA après le filage dans une microcentrifugeuse à vitesse élevée. Resuspendre lavés perles dans 100 ul de PBS-BSA, et aliquot en 10 tubes. </li><li> Afin de déterminer les conditions de revêtement d&#39;antigène qui saturent les perles, mélanger 10 ul de la suspension lavée perles avec des concentrations variables d&#39;antigènes biotinylés en deux volets étapes. Incuber une nuit à 4 ° C dans un tube à centrifuger sur un rotateur. </li></ol> REMARQUE: La saturation des perles doit être déterminée expérimentalement. Ceci peut être accomplien identifiant les perles de revêtement des conditions que le rendement maximal lorsque la phagocytose perles sont ensuite opsonisées avec un anticorps monoclonal témoin. <ol start="3"><li> Retirer antigènes non liés par un lavage avec 1 ml de PBS-BSA et centrifuger à vitesse élevée jusqu&#39;à perles sont culottées. Retirer du PBS-BSA et répéter. </li><li> Resuspendre recouvertes d&#39;antigène perles dans un volume final de 1 ml dans PBS-BSA. Perles peuvent être stockées pendant une semaine à 4 ° C avant utilisation. </li></ol> 4. Préparer les échantillons d&#39;anticorps <ol><li> Échantillons cliniques d&#39;anticorps peuvent être purifiés à partir de plasma en utilisant un gel de purification Melon IgG kit selon les instructions du fabricant. IgG purifiées peuvent être conservés à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> REMARQUE: précautions adéquates concernant la manipulation des échantillons humains doivent toujours été prises. <ol start="2"><li> Déterminer la concentration de anticorps purifiés par absorbance à A280, et de diluer les échantillons à 1 mg / ml dans du PBS. </li><li> Préparer poserive et négatifs anticorps monoclonal témoin par dilution à 1 mg / ml dans du PBS. </li></ol> 5. Placage de l&#39;Expérience <ol><li> Reprendre le laver, de l&#39;antigène solution saturée perles préparé ci-dessus par vortex, et le transfert 10 ul dans chaque puits d&#39;un fond rond plaque de 96 puits. Des précautions doivent être prises pour constamment agiter la suspension de billes pour assurer un nombre égal de billes fluorescentes sont ajoutés à chaque puits. </li><li> Ajouter des concentrations variables d&#39;anticorps d&#39;intérêt pour chaque puits, la création d&#39;une courbe dose-réponse pour chaque anticorps. Concentrations optimales diffèrent entre les échantillons en fonction du titre d&#39;anticorps présents, mais une gamme de 0,01 à 100 pg / ml concentration finale offrira une bonne couverture et de permettre l&#39;identification de la gamme de concentration de l&#39;intérêt. Assurez-anticorps sont ajoutés dans des volumes ne dépassant pas 20 pl. </li><li> Incuber perles et des échantillons d&#39;anticorps pendant 2 heures à 37 ° C pour permettre à l&#39;anticorps à opsoniser les perles. &lt;/ Li&gt; <li> Préparer une suspension de cellules THP-1 à 2,5 x 10 5 cellules / ml, et ajouter 200 ul de cette suspension à chaque puits, pour un total de 5 x 10 4 cellules THP-1 dans chaque puits. </li><li> Incuber une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2, dans un arrêt incubateur, cellules, permettant aux pellets et des perles par gravité. </li></ol> NOTE: Signal to Noise peut être améliorée par la détermination de la perle optimale: anticorps: THP-1 ratios de cellules pour une source donnée d&#39;antigène et anticorps. 6. Cytométrie en flux <ol><li> Retirer 100 pi de surnageant de chaque puits en faisant attention de ne pas perturber le culot cellulaire. Le surnageant peut être sauvé si les déterminations sécrétion de cytokines ou d&#39;autres analyses sont souhaitées. </li><li> Pour la fixation, ajouter 100 l de paraformaldéhyde à 4% dans chaque puits et une pipette pour resuspendre et mélanger des cellules. </li><li> Haute analyse des flux de débit cytométrie peut être effectuée en utilisant une BD LSR II équipé d&#39;un lecteur de plaque HTS.</li><li> Programme logiciel pour mélanger chaque puits à trois reprises (un volume de 100 ul mélange) et d&#39;analyser les 30 ul, ou au moins 2000 événements cellulaires, de chaque échantillon. </li><li> Les données recueillies peuvent être analysées en FlowJo ou un logiciel équivalent. Métriques utiles comprennent les billes pour cent de + ou cellules fluorescentes, ce qui donne une mesure du nombre de cellules phagocytaires présentes, ainsi que l&#39;intensité de fluorescence des cellules phagocytaires, qui fournit une mesure du nombre de perles phagocytés. En multipliant ces valeurs génère une intensité moyenne intégrée de fluorescence, ou iMFI. </li><li> Le nombre moyen de billes de phagocytées par chaque cellule phagocytaire peut être calculé en divisant le iMFI par la fluorescence moyenne de 1 perle. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Il devrait y avoir une différenciation claire des échantillons d&#39;anticorps chez les sujets atteints et non atteints. La figure 1A présente les histogrammes FACS d&#39;un échantillon d&#39;anticorps à partir d&#39;une néga VIHtive (trace noire) et un sujet VIH positif (traces grises), et démontre la phagocytose accrue tirée par la présence d&#39;anticorps spécifiques d&#39;antigène. Une sensibilité optimale du dosage est dépendant de la saturation des perles avec l&#39;antigène biotinylé. Figure 1B présente la phagocytose observée lorsque billes revêtues avec différentes quantités d&#39;antigène ont été opsonisées avec 3 anticorps monoclonal témoin (y compris un anticorps non contraignant, triangles), et établit 2μg antigène / ul perles comme une concentration saturante pour cet antigène. Une courbe dose-réponse est présentée dans la figure 2, et démontre la capacité différentielle des échantillons d&#39;anticorps soumis à induire la phagocytose sur une plage de concentration d&#39;anticorps de 0,05 à 5 pg / ml. Cette phagocytose différentielles peuvent être conduits soit par des différences dans les propriétés titre ou domaine Fc comme la sous-classe d&#39;IgG et de l&#39;état de glycosylation. Lorsque cellules THP-1 sont iMaged par microscopie fluorescente, il ya des preuves claires de la phagocytose de billes. La figure 3 présente deux 63x images fixes des cellules THP-1 après incubation avec l&#39;anticorps opsonisées (vert) et non opsonisées (rouge) perles, démontrant l&#39;absence d&#39;absorption phagocytaire en l&#39;absence d&#39;anticorps. Lorsque la microscopie laps de temps est effectuée, l&#39;absorption des anticorps spécifiques phagocytaire des perles fluorescentes est encore plus frappante (Film 1, un grossissement de 20x). Des travaux antérieurs ont confirmé l&#39;internalisation des perles associées aux cellules, et les expériences avec les monocytes primaires ont convenu ainsi avec des scores de phagocytose (valeurs iMFI) dans ce dosage à haut débit (données non présentées). <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Contrôle de qualité du dosage. 1A, histogrammes de cytométrie en flux de la phagocytose pour un échantillon d&#39;anticorps à partir d&#39;un sujet VIH négatif (noir trace) et une réserve VIH positif (traces grises).1B: Détermination expérimentale des conditions optimales revêtement de perles pour un antigène de l&#39;échantillon. Antigène spécifique des anticorps monoclonaux (cercle, carré) démontrent phagocytose maximal de billes recouvertes de&gt; 2 ug d&#39;antigène / ul de billes, tandis que d&#39;un anticorps de contrôle (triangle) ne démontre aucune activité phagocytaire. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Phagocytose courbe dose-réponse. Échantillons cliniques provenant d&#39;anticorps VIH positif (traitées, non traitées, et présentant le contrôle de la réplication virale en l&#39;absence de thérapie anti-rétrovirale) et le VIH phagocytose négatifs d&#39;entraînement des sujets de la gp120 (enveloppe du VIH) billes revêtues différemment. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Internalisation efficace. Microscopie confirme l&#39;internalisation des anticorps opsonisées perles (vert), tandis que les non-opsonisées billes restent en solution (63x de grossissement). Vidéo 1. Time-lapse de microscopie de l&#39;anticorps axée phagocytose a été réalisée au cours de 14 heures et permet la visualisation de l&#39;activité phagocytaire des cellules THP-1 utilisés dans le dosage à haut débit. Vert billes fluorescentes sont des anticorps opsonisées, rouge billes fluorescentes offrent un contrôle négatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3588/3588movie1.mov">Cliquez ici pour regarder le film.</a>

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<li>Fust, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+and+enhancing+antibodies+measured+in+complement-restored+serum+samples+from+HIV-1-infected+individuals+correlate+with+immunosuppression+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease.</a> AIDS. 8, 603-609 (1994).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;essai décrit ici permet analyse à haut débit de l&#39;activité phagocytaire des échantillons cliniques d&#39;anticorps en utilisant une lignée cellulaire monocytaire longtemps utilisée pour étudier les processus de phagocytose et la plaque 10 par cytométrie de flux basée automatisés. Ce dosage est plus avantageux que d&#39;autres dans sa capacité à caractériser précisément des sous-ensembles spécifiques de l&#39;antigène des anticorps, permettant non seulement pour l&#39;étude des différences dans la phagocytose tirée par la maladie des anticorps spécifiques de différents sujets, mais également l&#39;étude des spécificités antigéniques multiples dans le même sujet. Parce que le recrutement d&#39;anticorps d&#39;Innate cellules effectrices, y compris les monocytes et les cellules présentant l&#39;antigène d&#39;autres impacts fortement 11-13 évolution de la maladie, et est biologiquement géométrie variable en fonction des anticorps, sous-classe d&#39;IgG, et la glycosylation au Asparagine297 du domaine Fc 14-16, cette méthode fournit des l&#39;évaluation d&#39;un mécanisme d&#39;anticorps critique de l&#39;action. Par ailleurs, en raison des anticorps Mediphagocytose ATED est exploitée par certains agents pathogènes au cours de l&#39;infection 7,17,18, ce test est très prometteuse dans l&#39;évaluation du processus de mise en valeur dépendante des anticorps, et met en évidence la double nature de la phagocytose comme potentiellement protecteurs, ainsi que potentiellement préjudiciable l&#39;activité des anticorps. L&#39;essai décrit peut être utilisé pour analyser les anticorps à partir d&#39;échantillons cliniques des populations de patients, mais aussi des sujets vaccinés, et peut être adapté à base de sérum plutôt que IgG purifiées. De plus, la sécrétion de cytokines en réponse à la phagocytose peut être analysé à partir du surnageant de culture, et l&#39;influence des FcR spécifiques peuvent être déterminées en utilisant FcR anticorps bloquant, permettant non seulement des différences dans la puissance phagocytaire à déterminer, mais de signalisation en aval des événements, avec perspicacité dans le mécanisme, et peut aider à résoudre et d&#39;affiner la compréhension de ce mécanisme immunitaire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> EZ-Link Micro sulfo-NHS-LC-Kit Biotinylation </td><td> Thermo Scientfic </td><td> 21935 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Unité centrifuge Filtre avec membrane Ultracel-50 </td><td> Millipore </td><td> UFC905024 </td><td> Taille de l&#39;unité de filtre peut varier selon la taille de l&#39;antigène </td></tr><tr><td> FluoSpheres neutravidine étiquetés microsphères, 1,0 um, jaune-vert fluorescent (505/515) </td><td> Invitrogen </td><td> F-8776 </td><td> Les fabricants produisent ce produit en différentes couleurs </td></tr><tr><td> Melon Gel kit de purification d&#39;IgG </td><td> Thermo </td><td> 45212 </td><td> Des précautions doivent être prises pour vérifier la pureté des échantillons Ab par SDS-PAGE. </td></tr></tbody></table>

déterminer l&#39;activité phagocytaire des échantillons d&#39;anticorps cliniques

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Anticorps axée phagocytose est induite par l&#39;engagement des récepteurs Fc sur les phagocytes professionnels, et peuvent contribuer à la fois jeu ainsi que la pathologie de la maladie. Bien que les propriétés des domaines variables des anticorps ont été longtemps considérés comme critiques pour la fonction in vivo, la capacité des anticorps à recruter les cellules immunitaires innées via leur domaines Fc est devenu de plus en plus apprécié comme un facteur important dans leur efficacité, tant dans le cadre de la recombinaison thérapie par anticorps monoclonaux, ainsi que dans le cours de l&#39;infection naturelle ou vaccination 1-3. Surtout, en dépit de sa nomenclature comme un domaine constant, le domaine Fc d&#39;anticorps n&#39;a pas de fonction constante, et est fortement modulé par sous-classe IgG (IgG1-4) et la glycosylation au asparagine 297 4-6. Ainsi, cette méthode pour étudier les différences fonctionnelles des anticorps spécifiques d&#39;antigène dans les échantillons cliniques facilitera la corrélation de la marmite phagocytairesdifférentiel d&#39;anticorps au stade de la maladie, la susceptibilité à l&#39;infection, la progression, ou le résultat clinique. Par ailleurs, cette fonction effectrice est particulièrement important compte tenu de la capacité documentée d&#39;anticorps afin d&#39;améliorer l&#39;infection en fournissant un accès pathogènes dans les cellules hôtes par l&#39;intermédiaire des récepteurs Fc axée phagocytose 7. En outre, il existe certaines preuves que l&#39;absorption phagocytaire des complexes immuns peut influer sur la polarisation Th1/Th2 de la réponse immunitaire 8. Ici, nous décrivons un test conçu pour détecter des différences dans les anticorps induits par la phagocytose, qui peuvent être causés par le différentiel d&#39;IgG sous-classe, structure du glycane au Asn297, ainsi que la capacité à former des complexes immuns de l&#39;antigène-anticorps spécifiques à un mode haut-débit . À cette fin, une um billes fluorescentes sont recouvertes d&#39;antigène, puis incubé avec des échantillons cliniques d&#39;anticorps, générant fluorescentes spécifiques de l&#39;antigène des complexes immuns. Ces Antibody-opsonisées billes sont ensuite incubés avec une lignée cellulaire monocytaire exprimer FcγRs multiples, y compris les inhibiteurs et activateurs. Sortie de dosage peuvent inclure l&#39;activité phagocytaire, la sécrétion de cytokines, et les habitudes d&#39;utilisation FcγRs, et sont déterminés de manière standardisée, ce qui en fait un système très utile pour l&#39;analyse des différences dans cette fonction dépendante des anticorps effecteur dans l&#39;infection et le vaccin protection médiée par 9.

Nous présentons une analyse des flux à haut débit par cytométrie de déterminer l&#39;activité phagocytaire de l&#39;antigène-anticorps spécifiques à partir d&#39;échantillons cliniques, en utilisant fluorescentes recouvertes d&#39;antigène perles et une lignée cellulaire monocytaire exprimer plusieurs récepteurs Fc-récepteur et d&#39;utilisation fournissant des déterminations de l&#39;activité phagocytaire dans un standardisés et façon reproductible pour tout antigène d&#39;intérêt.

Déterminer l&#39;activité phagocytaire des échantillons d&#39;anticorps cliniques

La phagocytose médiée par les anticorps est induite par l'engagement des récepteurs Fc sur les phagocytes professionnels, et peut contribuer à la fois à l'élimination ainsi qu'à ...

L'objectif de l'expérience suivante est de déterminer l'activité phagocytaire des anticorps spécifiques d'un antigène dans des échantillons cliniques avec un débit élevé. Cela est réalisé en recouvrant d'abord des billes fluorescentes d'un antigène choisi, permettant ainsi la capture de la fraction d'anticorps spécifique de l'antigène présente dans des échantillons complexes d'anticorps cliniques. Dans un deuxième temps, les cellules TP une sont incubées avec les billes fluorescentes ionisées, qui ensuite phagocytent les billes en fonction du nombre et des caractéristiques du domaine FC des anticorps liés.Ensuite, l'intensité de fluorescence des cellules THP-1 est déterminée par cytométrie de flux basée sur des plaques à haut débit afin de quantifier l'activité phagocytaire des anticorps présents dans l'échantillon. En fin de compte, on peut évaluer la capacité des anticorps spécifiques de l'antigène présents dans l'échantillon à induire la phagocytose, selon la prise différentielle de billes fluorescentes opsonisées due soit à une variation du taux d'anticorps, soit à une reconnaissance variable par les récepteurs d'anticorps exprimés sur les cellules phagocytaires. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que celles utilisant des cellules phagocytaires primaires, sont une augmentation du débit et une meilleure standardisation.Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales concernant l'immunologie de base de la réponse immunitaire adaptative, notamment si différents schémas de vaccination induisent des anticorps aux activités différentes. Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement des maladies infectieuses, car les anticorps contribuent fortement à l'induction d'une réponse immunitaire protectrice efficace. Bien que nous ayons utilisé cette méthode pour mieux comprendre l'activité des anticorps lors de l'infection progressive par le VIH et de la vaccination, elle peut également être appliquée à d'autres affections telles que la grippe, l'auto-immunité et la dengue, où les anticorps frago peuvent aggraver la maladie D au lieu d'assurer une protection.Commencez par diluer l'antigène dans un tampon ne contenant pas d'amines primaires. Ensuite, dissolvez le réactif sulfa NHS lc, biotine dans de l'eau. Puis, ajoutez immédiatement le réactif hydraté à l'antigène et laissez la réaction se dérouler pendant une heure à température ambiante sous agitation.Parfois, lorsque la réaction est terminée, ajouter l'échantillon dans la chambre supérieure d'une unité de concentration centrifuge pour éliminer l'excès de biotine non conjuguée par échange de tampon. Ajouter ensuite du PBS pour porter le volume total jusqu'au trait de remplissage de 15 millilitres. Enfin, centrifuger l'échantillon à 4 000 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que le volume soit réduit à environ 1,5 millilitre.Répéter cette étape trois fois afin d'obtenir une élimination quasi quantitative de la biotine libre. Après avoir centrifugé 100 microlitres de billes fluorescentes eutradin d'un micron dans une microcentrifugeuse à 13 000 ×g pendant cinq minutes, resuspendre et laver les billes dans un millilitre de P-B-S-B-S-A 0,1 % en suivant le même protocole de centrifugation. Ensuite, après avoir resuspendu les billes lavées dans 100 microlitres de P-B-S-B-S-A, répartir équitablement les billes dans 10 tubes microfuges.Ensuite, mélanger 10 microlitres de la suspension de billes lavées avec différentes concentrations d'antigène biotinylé selon les étapes de dilution. Incuber ensuite les suspensions de billes et d'antigène toute la nuit à quatre degrés Celsius dans un tube de microcentrifugeuse sur un agitateur rotatif. Le lendemain.Éliminer tout antigène non lié en lavant les suspensions deux fois avec un millilitre de P-B-S-B-S-A et centrifuger les échantillons à grande vitesse comme auparavant jusqu'à ce que les billes soient en pellet. Enfin, reprendre les billes recouvertes d'antigène dans un volume final d'un millilitre de P-B-S-B-S-A après purification des échantillons d'anticorps cliniques à partir du plasma à l'aide d'un kit de purification IgG à gel de melon. Conformément aux instructions du fabricant, déterminer la concentration des anticorps purifiés par mesure de l'absorbance à 280 nm.Ensuite, diluez les anticorps à un milligramme par millilitre dans du PBS, en mettant de côté des échantillons pour les anticorps témoins monoclonaux positif et négatif également. Puis, resuspendez la solution de billes saturées en antigène par vortexage, puis transférez 10 microlitres de la solution dans chaque puits d'une plaque 96 puits à fond rond ; veillez à agiter continuellement la suspension de billes afin de garantir que des nombres égaux de billes fluorescentes soient ajoutés à chacun des puits. Établissez une courbe de réponse dose-dépendante pour chaque anticorps témoin en ajoutant des concentrations variables des anticorps d'intérêt, dans des volumes n'excédant pas 20 microlitres, à chacun.Incubez maintenant les échantillons de billes et d'anticorps pendant deux heures à 37 degrés Celsius afin de permettre aux anticorps de se lier aux billes juste avant que les billes ne soient prêtes. Incubez en diluant un échantillon de cellules THP-1 à 2,5 × 10⁵ cellules par millilitre dans le milieu. Ajoutez ensuite 200 microlitres des cellules à chacun.Incubez finalement les cellules avec les billes revêtues d'anticorps toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur stationnaire, en permettant aux cellules et aux billes de se déposer par gravité. Le jour suivant, retirez 100 microlitres de surnageant de chaque puits en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire. Fixez les cellules dans 100 microlitres de paraformaldéhyde 4 %, puis pipetez pour resuspendre et mélanger les cellules.Chargez maintenant la plaque sur le lecteur de plaque HTS d’un cytomètre en flux à haut débit, afin de permettre la collecte automatisée des données. L’intensité de fluorescence d’une cellule HTHP est capturée et enregistrée. Cette intensité de fluorescence est ensuite utilisée pour déterminer le nombre de billes phagocytées par chaque cellule, ce qui définit l’activité phagocytaire de l’échantillon d’anticorps testé.Il doit y avoir une distinction claire entre les échantillons d'anticorps provenant de sujets affectés et non affectés. Dans cette figure, l'histogramme de fréquence d'un échantillon d'anticorps provenant d'un sujet séronégatif pour le VIH, représenté par la courbe noire, et d'un sujet séropositif pour le VIH, représenté par la courbe grise, illustre l'augmentation de la phagocytose induite par la présence d'anticorps spécifiques de l'antigène.La sensibilité optimale de ce dosage dépend de la saturation des billes par l'antigène biotinylé, comme indiqué ici. Une concentration de deux microgrammes d'antigène par microlitre de billes a été déterminée comme étant la concentration de saturation pour cet antigène. Cette courbe de réponse au dosage illustre la capacité différentielle des échantillons d'anticorps de sujets à induire la phagocytose sur une gamme de concentration en anticorps allant de 0,05 à cinq microgrammes par millilitre.Cette phagocytose différentielle pourrait être due soit à des différences de titre, soit à des propriétés du domaine FC telles que la sous-classe d'IgG ou l'état de glycosylation. Lorsque les cellules TP one sont observées par microscopie fluorescente, il existe des preuves claires de phagocytose des billes. Cette image fixe de cellules TP one après incubation avec des billes opsonisées par des anticorps en vert et des billes non opsonisées en rouge démontre l'absence de prise en charge phagocytaire en l'absence d'anticorps, puisque seules les billes vertes ont été internalisées par les cellules TP one.Lorsqu'une microscopie en time-lapse est réalisée, la capture phagocytaire spécifique d'anticorps de billes fluorescentes est encore plus marquante. Les billes fluorescentes vertes visibles ici sont recouvertes d'anticorps. Les billes fluorescentes rouges servent de contrôle négatif. Après cette procédure, d'autres tests de la fonction des anticorps peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires sur les caractéristiques de la réponse immunitaire en anticorps contre une infection ou une vaccination.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer l'activité phagocytaire d'échantillons d'anticorps à l'aide de la cytométrie en flux à haut débit. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons cliniques de sang et de plasma peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle adéquats et le respect des procédures de manipulation sécuritaires doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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