Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Processus cellulaires tels que la migration des cellules ont traditionnellement été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Ce rapport décrit une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et l'analyse de la dynamique des protéines dans les cellules de migrer dans un plus physiologiquement pertinents, en trois dimensions de la matrice.

Cette démonstration vise à imager des protéines marquées par fluorescence dans des cellules vivantes dans une matrice 3D. Tout d’abord, générer des lignées cellulaires stables exprimant des protéines marquées par fluorescence. Ensemencez ces cellules dans une matrice de collagène 3D, puis acquérez des images en accéléré des cellules en migration à l’aide d’un microscope confocal.

En fin de compte, les résultats mettent en lumière la localisation et la dynamique des protéines au sein des cellules migrantes grâce à l’imagerie en accéléré et à l’analyse FP, en observant la dynamique et la localisation des protéines en 3D et en temps réel. Offre une voie pour aborder des questions fondamentales dans la migration cellulaire. Par exemple, comment les contacts adhésifs sont-ils régulés par les protéines cytoplasmiques ?

Et aussi comment ces contacts sont-ils perturbés par des inhibiteurs spécifiques. Dans une boîte P 35, les cellules à 80 à 90 % de fluidité transfectent les cellules avec le plasmide d’intérêt à l’aide de lipo 2000 selon les instructions du fabricant. Placez ensuite les cellules dans un incubateur.

Le lendemain, divisez les cellules en deux boîtes de Pétri P one 50 et incubez pendant la nuit. Réapprovisionnez le milieu pour ajouter 50 microgrammes par millilitre de G four 18. Poursuivre la culture sous sélection d’antibiotiques pendant deux semaines.

Examinez la culture à la recherche de G quatre 18 colonies résistantes. Puis à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée. Identifiez et marquez les colonies positives à la GFP.

Lavez les cellules deux fois avec du PBS. Après le deuxième lavage, laissez une fine couche de liquide pour éviter que les cellules ne se dessèchent pour chaque colonie marquée. Essuyez le plus près possible du bord avec un coton-tige stérilisé et pipetez 10 microlitres de trypsine sur la colonie.

Répétez l’opération rapidement pour chaque colonie. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés centigrades pour le détachement des cellules. Vérifiez l’aspect rond au microscope.

Ajoutez 10 microlitres de trypsine sur chaque colonie, pipetez pour détacher complètement les cellules de la plaque. Transférez ensuite chaque colonie de cellules dans un seul puits d’une culture en boîte de 24 puits pour amplifier les colonies stables. Ensuite, évaluez l’expression protéique des colonies à l’aide du transfert Western standard et de l’immunofluorescence.

Développez les lignées cellulaires sélectionnées Modification de la surface du verre. Le plat inférieur offre une liaison optimale du collagène. Pipeter 300 microlitres de solution de siloisation sur la portion en verre de chaque plat P 35 avec une ouverture de 10 millimètres.

Incuber pendant une heure à température ambiante. Aspirez la solution et lavez-la à l’eau filtrée trois fois pendant 10 minutes chacune. Retirez l’eau et placez la vaisselle sur une plaque chauffante à 50 degrés centigrades pendant 1,5 heure.

Placez le dessus de la vaisselle légèrement à l’écart de la vaisselle pour permettre le séchage. Une fois les plats secs refroidis, pipetez 300 microlitres de solution de glutaraldéhyde à 2 % sur la partie en verre de chaque plat. Incuber pendant une heure, puis laver avec PB S3 fois pendant 10 minutes chacun.

Procédez à la stérilisation de la vaisselle en l’exposant à la lumière UV pendant une heure. Première pastille de 100 microlitres de particules tracantes fluorescentes par centrifugation. Jetez le liquide et remettez les particules en suspension dans 500 microlitres de support.

Effectuez cinq lavages, puis remettez les particules en suspension dans 30 microlitres de support. Ensuite, récoltez les cellules exprimant la GFP à l’aide de trypsine et préparez une suspension de 2 millions de cellules par millilitre dans un tube einor Pipette de 240 microlitres de milieu de croissance. Ajoutez 12,6 microlitres d’un tas molaire, 20 microlitres d’eau filtrée, 50 microlitres de solution cellulaire et 10 microlitres de particules fluorescentes.

Enfin, ajoutez 167 microlitres de collagène de derme bovin, une solution de mélange de solution. Transférez maintenant 80 microlitres sur la portion en verre du plat siloisé préparé. Incuber à 37 degrés centigrades pendant 50 minutes pour que le gel polymérise.

Ajoutez ensuite soigneusement deux millilitres de milieu de croissance. Équilibrez la chambre du microscope à une température d’état stable de 37 degrés centigrades pour réapprovisionner le milieu cellulaire. Pour maintenir un pH neutre pour l’imagerie CID, remplacez le haut de la parabole par un dessus en verre avec une fine bande de paraforme.

Couvrez le côté du plat pour éviter l’évaporation pour un objectif d’immersion dans l’huile. Placez une goutte de liquide d’immersion sur la position de l’objectif. Le gel de collagène contenant la boîte sur la platine du microscope afin que la boîte entre en contact avec le liquide d’immersion.

Concentrez l’échantillon et recherchez les cellules d’intérêt à imager pour minimiser la dérive de l’étage. Laisser reposer le plat pendant environ 45 minutes. Avant de commencer une longue capture, spécifiez les paramètres d’acquisition d’images pour les expériences d’addition d’inhibiteurs.

Préparez le milieu supplémenté avec le médicament à la concentration de travail souhaitée. Réapprovisionnez le milieu cellulaire pour maintenir un pH neutre, mais ne scellez pas avec du perfil. Transférez l’échantillon au microscope et procédez à l’imagerie au moment du traitement médicamenteux.

Mettez l’image en pause, capturez et retirez soigneusement le dessus du plat sans déranger le plat. Aspirez le milieu et pipetez le milieu contenant le médicament dans la boîte. Replacez ensuite soigneusement le plat.

La configuration du top frap varie d’un système à l’autre. Consultez donc les instructions du fabricant. Définissez d’abord les paramètres pour l’imagerie de cellules vivantes.

Pour le photoblanchiment. Testez ces paramètres sur des cellules d’entraînement pour obtenir une puissance laser suffisante pour photoblanchir le signal fluorescent sans endommager la cellule. Ensuite, lancez la capture d’image sur l’échantillon en acquérant au moins cinq images.

Ensuite, photoblanchissez la région d’intérêt. Continuez à capturer pendant le temps de récupération. Mesurez l’intensité fluorescente moyenne de la zone photo-blanchie avant et après le photoblanchiment au fil du temps, à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique.

Ajustez la courbe de récupération à l’équation exponentielle. Obtenez les paramètres de mi-temps et d’intensité finale à partir de la courbe d’ajustement exponentielle. Calculez ensuite la fraction mobile en prenant le rapport entre les intensités de fluorescence finale et initiale.

Ces images 3D de cellules vivantes montrent des cellules épithéliales saines exprimant l’actine GFP. Après quatre jours de culture, ces cellules ont formé un kyste dans une matrice de collagène 3D. Certaines cellules ont migré le long de la surface du kyste tandis que d’autres ont migré à l’intérieur du kyste.

La déformation de la matrice, résultant des forces de traction exercées par les cellules en migration, est analysée par le déplacement de particules traceurs intégrées dans la matrice environnante. L’effet de l’inhibition de la kinase RO sur la force de traction est montré ici. Les mouvements des particules de traçage sont affichés sous la forme d’une image de projection maximale de différents points temporels et chaque point temporel est pseudo coloré.

Alternativement, les images d’une particule traceur individuelle sont affichées sous forme de montage pour montrer le mouvement de la particule traceuse. Au fil du temps, cette particule traceur s’est rapprochée et éloignée du bord de fuite de la cellule en migration avant et après l’ajout de Y 2 7 6 3 2 respectivement. L’analyse frap suit les cellules exprimant l’actine GFP lors de leur migration dans une matrice tridimensionnelle indiquant une récupération de fluorescence typique Après une expérience de photoblanchiment dans des réglages laser optimisés, l’intensité de fluorescence de la région d’intérêt est visiblement diminuée par rapport au niveau de fond tout en maintenant des cellules saines et intactes.

Ce graphique montre l’ajustement de la courbe de récupération avec une fonction exponentielle. Une fois maîtrisé, l’ensemencement des cellules dans la matrice peut prendre une heure. N’oubliez pas que travailler avec trois amino propyl triméthyl peut être extrêmement dangereux.

Prenez donc des précautions comme travailler dans la hotte chimique. N’oubliez pas non plus de maintenir des conditions stériles lorsque vous travaillez avec des cellules dans une matrice 3D.