Name: Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Découvrez l'imagerie de protéines fluorescentes dans des cellules vivantes migrant dans une matrice de collagène 3D. Cette méthode permet de visualiser la localisation et la dynamique des protéines en temps réel pour étudier la migration cellulaire.

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Nous remercions le Dr Grant Sumida pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de jeune chercheur Beckman (SY), une famille Hellman Faculté nouveau prix (SY), un EUREKA NIH, l&#39;Université de Californie recherche sur le cancer comité de coordination.

1. Génération d&#39;une lignée cellulaire stable (par exemple des cellules MDCK) <ol><li> Cellules de la plaque à 80-90% de confluence dans un plat à p35. Ne laissez pas les cellules sous forme de 100% monocouche confluente, ce qui réduira l&#39;efficacité de la transfection. </li><li> Transfecter les cellules avec le plasmide d&#39;intérêt en utilisant Lipofectamine 2000. Optimiser les conditions de transfection utilisant le protocole du fabricant. </li><li> Le lendemain, le passage des cellules dans deux boîtes de Pétri p150. Le grand plat est recommandé pour permettre à l&#39;espacement suffisant entre les colonies stables. </li><li> Le lendemain, changer les médias et ajouter 500 pg / ml de G418 à chaque plat. La concentration du G418 devrait être optimisé pour les lignées de cellules individuelles. </li><li> Changer les médias chaque jour pendant environ 2 semaines. Après 2 semaines, G418 colonies résistantes devraient commencer à se former, et sera visible à l&#39;œil nu. </li><li> En utilisant un microscope inversé fluorescentes, identifier les colonies GFP-positives. Marquer ces colonies sur la plaque à l&#39;aide d&#39;un stylo Sharpie. </li><li> Pour sélectivement trypsiniser les colonies de la plaque de culture de tissus, aspirer à la presse, et laver les cellules deux fois avec du PBS ou solution de trypsine. Sur le second lavage, ne pas aspirer à toute la solution. Laisser une mince couche de liquide sur le fond de l&#39;assiette pour empêcher les cellules de séchage. </li><li> Pour chaque colonie a marqué: utilisez un coton-tige stérile pour essuyer le plus proche possible sur le pourtour de la colonie. Cela va créer une île de la zone humide contenant de la colonie de cellules. Pipeter 10 pl de la trypsine sur la colonie. Répétez l&#39;opération pour chaque colonie, et de procéder rapidement pour éviter le séchage. Un chercheur expérimenté peut généralement prendre ~ 12 colonies par p150 assiette. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5-10 minutes jusqu&#39;à ce cellules se détachent de la plaque et paraître rond. </li><li> Pour chaque colonie: pipette 10 ul de la trypsine sur la colonie, et la pipette monter et descendre une ou deux fois pour détacher les cellules de la plaque. Puis la pipette toutes les cellules de la colonie en un seul puits dans un plat à 24 puits. </li> &lt;li&gt; Après colonies stables ont augmenté, l&#39;expression des protéines de chaque colonie est analysée en utilisant la norme western blot et immunofluorescence. Développer ces lignées de cellules pour une analyse ultérieure. </li></ol> 2. Modification de la surface du plat à fond de verre pour la liaison de collagène optimale (facultatif) <ol><li> Pour silaniser le verre, pipette 300 pi de 2% 3-aminopropyltriméthoxysilane solution sur la partie vitrée de chaque plat p35 avec une ouverture de 10 mm. Voir Figure 1 pour la silanisation et réticulation schématique. 3-aminopropyltriméthoxysilane est dilué dans de l&#39;eau filtrée. </li><li> Incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution 3-aminopropyltriméthoxysilane et laver avec de l&#39;eau filtrée trois fois pour 10 minutes chacune. </li><li> Aspirer les plats d&#39;eau et placer sur une plaque chaude réglé à 50 ° C pendant 1,5 heures. Lieu de sommets plats légèrement du plat afin que l&#39;humidité dans le plat ne peut échapper. </li><li> Retirez les plats du feu et laisser à gazouillerl. </li><li> Pipeter 300 pi de solution de glutaraldéhyde à 2% sur la partie en verre de chaque plat. Le glutaraldéhyde est dilué dans du PBS. </li><li> Incuber pendant 1 heure. </li><li> Aspirer la solution de glutaraldéhyde et laver la vaisselle avec du PBS à trois reprises pendant 10 minutes chacun. </li><li> Stériliser les plats par une exposition aux rayons UV pendant 1 heure. Les plats silanisé peut être conservée à température ambiante. </li></ol> 3. Préparation du gel de collagène 3D avec des particules traceurs <ol><li> Laver les particules traceur fluorescent en faisant tourner en baisse de 100 ul de particules traceurs de stock (10 10 particules / ml) dans une centrifugeuse à 15 000 rpm pendant 5 minutes, aspirer le liquide, et ajouter 500 ul de médias. Répéter 5 fois. Après dernier lavage, les particules de remettre en suspension dans 30 pl de médias. </li><li> Trypsiniser cellules GFP exprimer comme d&#39;habitude. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire d&#39;environ 2 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Pipeter 240 ul de milieu de croissance dans un tube Eppendorf. </li><li> Ajouter 12,6 ul d&#39;HEPES 1M, 20 pl d&#39;eau filtrée, 50 pl de solution de la cellule, puis 10 ul de particules fluorescentes. </li><li> Enfin, ajouter 167 l de collagène du derme bovin J&#39;ai solution (pour obtenir une concentration de travail de 1 mg / ml). </li><li> Mélanger une solution à fond, puis la pipette 80 ul de la solution sur la partie en verre du plat à fond de verre silanisé. </li><li> Vaisselle Placer dans l&#39;incubateur et permettre au gel de polymériser à 37 ° C pendant 30 minutes. Voir Figure 1A pour le gel de collagène dans un plat typique de p35 à fond de verre. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de croissance avec soin pour chaque plat. </li></ol> 4. Procédure à suivre pour l&#39;acquisition d&#39;image time-lapse <ol><li> Allumez le contrôle de la température de l&#39;enceinte de microscope et de laisser la chambre de la portée s&#39;équilibrer à une température état d&#39;équilibre à 37 ° C. Voir Figure 2 pour un exemple de système d&#39;imagerie des cellules vivantes. </li><li> Changer les médias aux nouveaux médias complété avec 25 mM de HEPES à maintenir un pH neutre. PourDIC imagerie, de l&#39;échange au sommet de la parabole avec un qui a un dessus en verre. En utilisant une mince bande de parafilm, couvrir le côté du plat pour éviter l&#39;évaporation des médias. </li><li> Pour un objectif à immersion d&#39;huile, déposer une goutte de liquide d&#39;immersion sur l&#39;objectif. </li><li> Placer le gel de collagène contenant plat sur la platine du microscope, et assurez le plat en contact avec le liquide d&#39;immersion. </li><li> Axer la recherche d&#39;échantillon et les cellules d&#39;intérêt pour l&#39;image. Pour minimiser la dérive scène, permettent de régler plat pendant environ 45 minutes avant de commencer une capture longtemps. </li><li> Spécifiez les paramètres d&#39;acquisition des images. Minimiser l&#39;exposition au laser, ce qui pourrait endommager les cellules, en modulant la puissance du laser, le temps d&#39;exposition, la fréquence et la durée du temps de capture. Les paramètres réels varient avec le système de microscope et le type de cellule. </li><li> Lors de l&#39;acquisition time-lapse, un inhibiteur peut être ajouté. Pour l&#39;expérience de plus inhibiteur, ne pas sceller le plat avec du parafilm. <ol><li> Préparationsont complétées Hepes médias avec la drogue, à une concentration de travail désirée. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à ajouter des médicaments aux médias, mettre en pause la capture d&#39;image, et enlever soigneusement le dessus plat sans déranger le plat. </li><li> Aspirer à la presse dans le plat, et une pipette contenant le médicament des médias dans le plat. Puis, soigneusement remplacer le dessus plat. </li><li> L&#39;échantillon peut être hors-de-foyer à cause de l&#39;ajout de nouveaux médias, réajuster la mise au point. </li><li> Redémarrez la capture, puis de surveiller les captures pour les 30 prochaines minutes, et réajuster la mise au point si nécessaire. Voir Figure 4 pour un exemple de l&#39;expérience de plus de drogue. </li></ol></li></ol> 5. Procédure de FRAP et de l&#39;analyse <ol><li> La configuration du PAF varie entre les systèmes, suivre les instructions du fabricant. </li><li> Mettre en place des paramètres pour imagerie des cellules vivantes. </li><li> Mettre en place des paramètres pour photoblanchiment. Utilisez la puissance du laser suffit à photobleach le signal fluorescent sans endommager les cellules. Testez ces nominaleameters sur les cellules pratique. </li><li> Démarrer la capture d&#39;image, et attendre au moins 5 images de la capture d&#39;image avant photoblanchiment la région d&#39;intérêt. </li><li> Continuer la capture, et le temps de récupération devrait être suffisant pour capturer le plein rétablissement de fluorescence. Voir Figure 5 pour un exemple de l&#39;expérience de FRAP. </li><li> Analyser la récupération de fluorescence en mesurant l&#39;intensité moyenne de fluorescence de la zone photobleached (avant et après photoblanchiment) au cours du temps. L&#39;utilisation d&#39;un logiciel d&#39;analyse statistique (Excel par exemple), l&#39;ajustement de la courbe de récupération de l&#39;équation exponentielle: I = f (1-e-kt), où I est l&#39;intensité, je f est l&#39;intensité finale, t le temps, et τ ½ est le temps qu&#39;il faut pour l&#39;intensité pour atteindre la moitié de la valeur finale: τ ½ = ln (2) / k. La mi-temps est une mesure du taux de mobilité de la protéine. </li><li> Obtenir les paramètres, à mi-temps et l&#39;intensité finale de la courbe exponentielle ajustement. Calculer ee fraction mobile en prenant le rapport de la finale à la première intensités de fluorescence. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;imagerie des cellules vivantes des cellules épithéliales saines au sein de la matrice est montré dans la figure 3. Les cellules saines présentent une surface lisse, membrane continue, et noyau distinct, tandis que les cellules malsaines ont souvent une membrane perturbé, et un nombre excessif de vacuoles. Dans une matrice 3D, seule la migration des cellules épithéliales 1, et au cours de plusieurs jours, les cellules épithéliales forme tridimensionnelle, sphérique, multi-cellulaire des kystes au sein de la matrice 2. Les cellules sont également très dynamiques, et de migrer dans le kyste (figure 3). La déformation de matrice à la suite des forces de traction exercée par les cellules migrent sont analysées par le déplacement de particules traçantes noyées dans la matrice environnante (figure 4). Les mouvements des particules traceurs sont affichés comme une image de projection maximale de varierpoints de temps différentes, et chaque moment est une pseudo-couleur pour indiquer le temps (figure 4B). Sinon, les images d&#39;une particule traceur individuels sont affichées comme un montage pour montrer le mouvement de la particule traceur au cours du temps (figure 4C). Toutes analyse d&#39;image a été réalisée en utilisant ImageJ. Ces évaluations qualitatives de la déformation matrice, et donc les forces exercées par les cellules migrent, sont utiles en première approximation de la répartition de la force de traction. L&#39;estimation quantitative des forces de traction exercée par les cellules migrent en 3D est au-delà de la portée de ce protocole et est décrit ailleurs 3,4. Une reprise typique de fluorescence après photoblanchiment expérience est montré dans la figure 5. La région d&#39;intérêt doivent être photobleached utilisant des paramètres laser optimisés de sorte que l&#39;intensité de fluorescence est visiblement diminué par rapport aux niveaux de fond (pour maximiser signal-bruit), tout en préservant les cellules saines et en bon état. Le réglage optimal doit be déterminée empiriquement que chaque configuration est différente FRAP (par exemple, le FRAP en utilisant le système de balayage laser confocal). L&#39;exposition et intervalle de temps d&#39;acquisition des images post-FRAP doit être soigneusement contrôlée pour éviter photoblanchiment fond. L&#39;utilisation de faible puissance laser, temps d&#39;exposition court, et l&#39;utilisation de la caméra sensible et optique haute efficacité sont essentiels pour une qualité d&#39;image haute FRAP. Si la fluorescence de blanchiment lors de l&#39;acquisition d&#39;image est importante, ce fondu de fond doivent être quantifiés et normalisés de la reprise de l&#39;intensité de fluorescence observée. En raison de la nature 3D de l&#39;environnement, la composante z de la reprise d&#39;intensité de fluorescence peuvent devenir importants. Par conséquent, il est important de définir un volume photobleached en prenant pré-et post-stack images 3D de la région de photobleached. Une analyse plus poussée et la modélisation de la récupération de fluorescence est discutée ailleurs 5,6. La combinaison unique d&#39;imagerie des cellules vivantes techniques: GFP de suivre la dynamique des protéines du cytosquelette, la fluorescence rouge particules traceur pour surveiller la déformation de matrice, et l&#39;addition d&#39;inhibiteurs, peuvent être utilisés simultanément pour l&#39;analyse de la dynamique des protéines, la force de traction et de voies moléculaires. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Figure 1. Préparation du gel de collagène. A) la matrice de collagène polymérisé sur un plat à fond de verre. La couleur rose du gel est due à des particules fluorescentes intégré. B) Procédure pour traiter les plats à fond de verre pour réticuler le gel de collagène à la surface du verre. Tout d&#39;abord, le plat à fond de verre est traitée avec 3-aminopropyltriméthoxysilane solution, une solution de glutaraldéhyde alors que la matrice de collagène réticule sur le verre. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma de configuration microscope confocal / FRAP. Le confocalemicroscope est basé sur un AxioObserver Zeiss avec une caméra CCD Coolsnap HQ II et complètement automatisé par Slidebook logiciels (Intelligent innovations en imagerie). L&#39;unité est conçue sur mesure confocale et basé sur l&#39;unité Yokogawa disque rotatif CSU10 et deux lasers à état solide (488 nm à 50 mW et 561 nm avec 40 mW) avec acousto-optique à filtre accordable (AOTF) pour permettre la commutation entre deux millisecondes lasers. Les filtres d&#39;émission sont nm 525/50 et 620/60 nm (# 118661 et # 118085, technologie Chroma) et miroir dichroïque est Brightline 488-568 bi-bande (Semrock). Les objectifs sont une longue distance de travail 40x C-Apochromat objectif avec NA 1.1 et distance de travail de 0,62 mm, et un 63x Plan-Apochromat objectif avec NA 1,4 et une distance de travail de 0,19 mm. Le microscope comprend également un système de photoablation FRAP qui se compose d&#39;une fibre laser à colorant pompé optiquement, une position du faisceau contrôlé par ordinateur et d&#39;intensité, et une taille de tache de diffraction limitée. Par ailleurs, le microscope est équipéune platine XY motorisée, qui comprend 0,1 microns encodeurs linéaires sur chaque axe. Au cours de l&#39;imagerie time-lapse, la température ambiante est maintenue par une chambre du microscope conçu sur mesure et un appareil de chauffage avec un contrôle de température retour. Pour isoler le bruit et les vibrations, le système de microscope entier est sur une table de vibrations. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Figure 3. Direct imagerie cellulaire de cellules épithéliales exprimant la GFP-actine. Ces cellules forment un kyste au bout de 4 jours de culture dans une matrice de collagène 3D. Certaines cellules se déplacent le long de la surface du kyste (flèche jaune), tandis que d&#39;autres migrent à l&#39;intérieur de kystes (rouge pointe de flèche). La barre d&#39;échelle 10 microns, le temps en heures. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;effet de l&#39;inhibition de la Rho-kinase sur la force de traction. A) l&#39;image DIC d&#39;une cellule de migration MDCK exprimant GFP taggés marqueur nucléaire. L&#39;image a été prise immédiatement avant le traitement de l&#39;inhibiteur de la Rho-kinase Y-27632. La barre d&#39;échelle 10 microns. B) Le déplacement des particules résultant de l&#39;addition de Y-27632. Les positions des particules à différents temps (0 - 52 min) ont été pseudo-colorée en fonction de l&#39;échelle d&#39;intensité, puis projetée sur une seule image. La zone blanche est le noyau GFP-positives dans les cellules en migration. La barre d&#39;échelle 10 microns. Temps en minutes. C) Le mouvement des particules sur le bord de fuite de la cellule (voir flèche en B). Astérisque indique la dernière image capturée avant Y-27632 plus. La particule traceur déplacé vers et loin du bord de fuite de la cellule migration avant et après l&#39;ajout de Y-27632, respectivement. Échelle barre de 1 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Figure 5. Analyse du PAF de GFP-actine exprimer la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Images Timelapse A) de la GFPactine cellule exprimant des avant et après le photoblanchiment. Une petite région de la GFP-actine accumulée à l&#39;arrière des cellules a été photobleached (rouge pointe de flèche) au point de temps 0. Temps en secondes, barre d&#39;échelle 5 um. B) L&#39;intensité moyenne de fluorescence de la région photobleached (ligne continue), et l&#39;ajustement exponentiel de la reprise de fluorescence (cercles) en fonction au cours du temps. L&#39;intensité de fluorescence a été normalisée à la valeur initiale avant photoblanchiment.

<ol><li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li>
<li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li>
<li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li>
<li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
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<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes de la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Le succès de cette technique dépend de l&#39;obtention de &quot;bons&quot; clones exprimant de façon stable la GFP-tagged protéines. Le faible niveau de protéines GFP, il faudra une exposition d&#39;excitation en excès qui compromet la santé des cellules, alors que le niveau trop élevé GFP aura des effets secondaires indésirables sur la cellule. Ainsi, le...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Collagène, bovins, de type I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stock est d&#39;environ 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltriméthoxysilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Diluer dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> glutaraldéhyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Diluer dans du PBS </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Polystyrène Fluospheres microsphères 1 pm, fluorescence rouge (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Généticine (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Culture composantes médias: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionnellement, la migration cellulaire a été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Toutefois, au cours des processus biologiques importants tels que la cicatrisation des plaies, la régénération des tissus, et les métastases du cancer, les cellules doivent naviguer à travers complexe, en trois dimensions du tissu extracellulaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes derrière ces processus biologiques, il est important d&#39;examiner les rôles des protéines responsables de la conduite de migration cellulaire. Ici, nous présentons un protocole d&#39;étudier les mécanismes de la migration cellulaire en utilisant la lignée cellulaire épithéliale (MDCK), et un en trois dimensions, fibreuse, autopolymérisant matrice comme un système modèle. Cette matrice extracellulaire est optiquement clair facilement s&#39;adapter à des études d&#39;imagerie des cellules vivantes et mieux imite le physiologiques, l&#39;environnement des tissus mous. Ce rapport démontre une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et la dynamique, et la déformation de la entourant matrice tridimensionnelle. Exammination de la localisation des protéines et la dynamique des processus cellulaires au cours donne un aperçu de la clé dans les fonctions des protéines. Génétiquement codés étiquettes fluorescentes offrent une méthode unique pour l&#39;observation de la localisation des protéines et de dynamique. En utilisant cette technique, nous pouvons analyser l&#39;accumulation intracellulaire de la clé, la force génératrice de composants du cytosquelette en temps réel que les manœuvres des cellules à travers la matrice. De plus, en utilisant de multiples balises fluorescentes avec différentes longueurs d&#39;onde, nous pouvons examiner la localisation de protéines multiples simultanément, nous permettant ainsi de tester, par exemple, si différentes protéines ont des rôles similaires ou divergents. Par ailleurs, la dynamique des protéines par fluorescence marqués peuvent être quantifiés à l&#39;aide de récupération fluorescent après photoblanchiment (FRAP) analyse. Cette mesure de la mobilité des dosages des protéines et comment stablement lié les protéines sont sur le réseau du cytosquelette. En combinant imagerie des cellules vivantes avec le traitement des inhibiteurs de la fonction des protéines,nous pouvons examiner en temps réel l&#39;évolution de la répartition des protéines et la morphologie des cellules migrantes. Par ailleurs, nous aussi combiner imagerie des cellules vivantes avec l&#39;utilisation de particules de traceur fluorescent incorporé dans la matrice pour visualiser la déformation de matrice lors de la migration cellulaire. Ainsi, nous pouvons visualiser comment une cellule migration distribue la force génératrice de protéines, et où les forces de traction sont exercées à la matrice environnante. Grâce à ces techniques, nous pouvons avoir un aperçu précieux sur les rôles des protéines spécifiques et de leurs contributions aux mécanismes de la migration cellulaire.

Processus cellulaires tels que la migration des cellules ont traditionnellement été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Ce rapport décrit une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et l&#39;analyse de la dynamique des protéines dans les cellules de migrer dans un plus physiologiquement pertinents, en trois dimensions de la matrice.

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Traditionnellement, la migration cellulaire a été étudiée sur des surfaces plastiques rigides bidimensionnelles. Cependant, lors de processus biologiques importants tels que la cicatrisation des plaies...

Cette démonstration vise à imager des protéines marquées par fluorescence dans des cellules vivantes au sein d'une matrice 3D. Commencez par générer des lignées cellulaires stables exprimant des protéines marquées par fluorescence. Ensuite, semez ces cellules dans une matrice de collagène 3D, puis acquérez des images en laps de temps de cellules migratrices à l’aide d’un microscope confocal.En définitive, les résultats mettent en évidence la localisation et la dynamique des protéines au sein des cellules migratrices par imagerie en temps-lapse et analyse des protéines fluorescentes, en observant la dynamique et la localisation des protéines en 3D et en temps réel. Offre une voie pour répondre à des questions fondamentales en biologie de la migration cellulaire. Par exemple, comment les contacts adhésifs sont-ils régulés par les protéines cytoplasmiques ?Et aussi comment ces contacts sont perturbés par des inhibiteurs spécifiques. Dans une culture de cellules en plat de 35 mm à une confluence de 80 à 90 %, transfectez les cellules avec le plasmide d’intérêt en utilisant du lipo 2000 conformément aux instructions du fabricant. Puis placez les cellules dans une étuve.Le lendemain, rép

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Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cet article présente une méthode pour étiqueter fluorescence collagène qui peut encore être utilisé à la fois fixe et imagerie en temps réel des cultures cellulaires en 3D. Nous fournissons également un protocole optimisé pour visualiser les protéines du cytosquelette endogènes des cellules cultivées dans des environnements 3D.

Révéler l&#39;organisation du cytosquelette des cellules invasives du cancer en 3D

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

La migration des cellules est un phénomène biologique qui est impliquée dans une grande variété de physiologiques, telles que la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires, et des processus physiopathologiques, comme le cancer. La détermination de la migration de la matrice 3D-collagène est un outil polyvalent pour analyser les propriétés de migration de différents types de cellules à l'intérieur dans un environnement physiologique analogue à 3D.

Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

Les propriétés mécaniques et la microstructure de la matrice extracellulaire affectent fortement la migration de cellules 3D. Une méthode in vitro pour étudier le comportement de migration cellulaire spatio-temporelle dans des environnements biophysique variables, à des niveaux de cellules individuelles à la fois la population et, est décrit.

Système de Gel concentrique à étudier le rôle biophysique de Matrix microenvironnement sur 3D migration cellulaire

Combinant des approches de transplantation cellulaire, de marquage cytosquelettique et de perte/gain de fonction, ce protocole décrit comment la plaque préchordale prospective du poisson-zèbre en migration peut être utilisée pour analyser la fonction d’un gène candidat dans la migration cellulaire in vivo.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les cellules immunitaires noyées dans une matrice tridimensionnelle (3D) collagène microscope à lumière-feuille. Ce protocole précise également comment suivre la migration cellulaire en 3D. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans la matrice 3D.

Microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines

Le protocole actuel décrit une méthode intégrée sur le cancer cell migration et invasion sur une seule plateforme en temps réel, offrant une option facilement reproductible et plus économes en temps d’étudier la morphologie et la mobilité de la cellule.

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Cette étude présente un protocole d’immunocytochimie de cellules 3D vivantes appliqué à une lignée cellulaire de gliome diffus pédiatrique, utile pour étudier en temps réel l’expression des protéines sur la membrane plasmique au cours de processus dynamiques tels que l’invasion et la migration des cellules 3D.

Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes du gliome médian diffus pédiatrique

Nous décrivons les pipelines d’imagerie confocale et de suivi appliqués à deux stratégies de rapporteurs : les organoïdes mosaïques pour résoudre le comportement cellulaire individuel et les organoïdes rapporteurs du destin pour la surveillance des transitions de type cellulaire chez les organoïdes intestinaux humains et murins.

Imagerie cellulaire vivante et suivi unicellulaire pour surveiller la dynamique clonale et les transitions de destin chez les organoïdes intestinaux humains et murines

Découvrez l'imagerie de protéines fluorescentes dans des cellules vivantes migrant dans une matrice de collagène 3D. Cette méthode permet de visualiser la localisation et la dynamique des protéines en temps réel pour étudier la migration cellulaire.

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

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