Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Cette démonstration vise à imager des protéines marquées par fluorescence dans des cellules vivantes au sein d'une matrice 3D. Commencez par générer des lignées cellulaires stables exprimant des protéines marquées par fluorescence. Ensuite, semez ces cellules dans une matrice de collagène 3D, puis acquérez des images en laps de temps de cellules migratrices à l’aide d’un microscope confocal.

En définitive, les résultats mettent en évidence la localisation et la dynamique des protéines au sein des cellules migratrices par imagerie en temps-lapse et analyse des protéines fluorescentes, en observant la dynamique et la localisation des protéines en 3D et en temps réel. Offre une voie pour répondre à des questions fondamentales en biologie de la migration cellulaire. Par exemple, comment les contacts adhésifs sont-ils régulés par les protéines cytoplasmiques ?

Et aussi comment ces contacts sont perturbés par des inhibiteurs spécifiques. Dans une culture de cellules en plat de 35 mm à une confluence de 80 à 90 %, transfectez les cellules avec le plasmide d’intérêt en utilisant du lipo 2000 conformément aux instructions du fabricant. Puis placez les cellules dans une étuve.

Le lendemain, répartir les cellules dans deux boîtes de Pétri P150 et incuber toute la nuit. Renouveler le milieu en ajoutant 50 microgrammes par millilitre de G418. Poursuivre la culture sous sélection antibiotique pendant deux semaines.

Examinez la culture à la recherche de quatre colonies résistantes à la G418. Ensuite, à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé, identifiez et marquez les colonies positives pour la GFP.

Lavez les cellules deux fois avec du PBS. Après le deuxième lavage, laissez une fine couche de liquide pour éviter que les cellules ne s'assèchent pour chaque colonie marquée. Essuyez au plus près du bord avec un coton stérile et ajoutez 10 microlitres de trypsine sur la colonie à l’aide d’une pipette.

Répétez rapidement pour chaque colonie. Incubez ensuite la boîte à 37 degrés Celsius pour détacher les cellules. Vérifiez l'aspect arrondi au microscope.

Ajouter 10 microlitres de trypsine sur chaque colonie, puis pipeter afin de détacher complètement les cellules de la plaque. Ensuite, transférer chaque colonie de cellules dans un puits individuel d'une plaque de culture 24 puits pour amplifier les colonies stables. Ensuite, évaluer l'expression protéique des colonies à l'aide d'un immunoblot standard et d'une immunofluorescence.

Étendre la modification de surface des lignées cellulaires sélectionnées sur le verre. Le fond de la boîte permet une fixation optimale du collagène. À l’aide d’une pipette, déposer 300 microlitres de solution de silanisation sur la partie en verre de chaque boîte P 35 ayant une ouverture de 10 millimètres.

Incuber pendant une heure à température ambiante. Aspirer la solution et laver avec de l'eau filtrée trois fois, dix minutes à chaque fois. Éliminer l'eau et placer les boîtes sur une plaque chauffante à 50 degrés centigrades pendant 1,5 heure.

Placer les couvercles des boîtes légèrement de travers pour permettre le séchage. Une fois les boîtes sèches refroidies, pipeter 300 microlitres de solution de glutaraldéhyde à 2 % sur la partie en verre de chaque boîte. Incuber pendant une heure, puis rincer avec du PB S3 fois pendant 10 minutes chacun.

Procéder à la stérilisation des boîtes par exposition à la lumière UV pendant une heure. Commencer par former un culot de 100 microlitres de particules marquées fluorescentes par centrifugation. Jeter le surnageant et resuspendre les particules dans 500 microlitres de milieu.

Effectuez cinq lavages, puis resuspendez les particules dans 30 microlitres de milieu. Ensuite, récoltez les cellules exprimant la GFP à l’aide de trypsine et préparez une suspension de 2 millions de cellules par millilitre dans un tube einor. Pipetez 240 microlitres de milieu de croissance. Ajoutez 12,6 microlitres d’heaps à une molaire, 20 microlitres d’eau filtrée, 50 microlitres de solution cellulaire et 10 microlitres des particules fluorescentes.

Enfin, ajoutez 167 microlitres de collagène de derme bovin et mélangez soigneusement la solution. Transférez maintenant 80 microlitres sur la partie en verre de la boîte préparée et silanisée. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes afin que le gel polymérisé.

Ensuite, ajoutez soigneusement deux millilitres de milieu de croissance. Équilibrez la chambre du microscope à une température constante de 37 degrés Celsius et renouvelez le milieu des cellules. Pour maintenir un pH neutre pendant l’imagerie en contraste de phase, remplacez le couvercle de la boîte par un couvercle en verre muni d’une fine bande de paraforme.

Couvrez le côté de la boîte pour éviter l'évaporation lors de l'utilisation d'un objectif à immersion huileuse. Déposez une goutte de liquide d'immersion sur la position de l'objectif. Placez le gel de collagène contenant la boîte sur la platine du microscope de manière à ce que la boîte entre en contact avec le liquide d'immersion.

Mettre au point l'échantillon et rechercher les cellules d'intérêt à imager afin de minimiser la dérive de la platine. Laisser le plat se stabiliser pendant environ 45 minutes. Avant de commencer une acquisition prolongée, définir les paramètres d'acquisition d'images pour les expériences d'ajout d'inhibiteur.

Préparez le milieu supplémenté avec le médicament à une concentration de travail souhaitée. Renouvelez le milieu cellulaire pour maintenir un pH neutre, mais n’ajoutez pas de perfil. Transférez l’échantillon sur le microscope et procédez à l’imagerie au moment du traitement par le médicament.

Mettons l'image en pause, capturons et retirons soigneusement le couvercle de la boîte sans perturber celle-ci. Aspirons le milieu et pipetons le milieu contenant le médicament dans la boîte. Puis remplaçons soigneusement la boîte.

La configuration du système de FRAP en haut varie selon les systèmes. Consultez donc les instructions du fabricant. Réglez d'abord les paramètres pour l'imagerie de cellules vivantes.

Pour la photodégradation. Testez ces paramètres sur des cellules d'entraînement afin d'obtenir une puissance laser suffisante pour photodégrader le signal fluorescent sans endommager la cellule. Ensuite, commencez l'acquisition d'images sur l'échantillon en enregistrant au moins cinq images.

Ensuite, photoblanchir la région d’intérêt. Continuer à acquérir les images pendant le temps de récupération. Mesurer l’intensité fluorescente moyenne de la zone photoblanchie avant et après le photoblanchiment au fil du temps, à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique.

Ajustez la courbe de récupération à l'équation exponentielle. Obtenez les paramètres du temps demi et de l'intensité finale à partir de la courbe d'ajustement exponentiel. Calculez ensuite la fraction mobile en prenant le rapport entre les intensités de fluorescence finale et initiale.

Ces images en 3D de cellules vivantes montrent des cellules épithéliales saines exprimant l'actine GFP. Après quatre jours de culture, ces cellules ont formé un kyste dans une matrice de collagène en 3D. Certaines cellules ont migré le long de la surface du kyste, tandis que d'autres se sont déplacées à l'intérieur du kyste.

La déformation de la matrice résultant des forces de traction exercées par les cellules migrantes est analysée par le déplacement de particules traceuses intégrées dans la matrice environnante. L'effet de l'inhibition de la kinase RO sur la force de traction est illustré ici. Les déplacements des particules traceuses sont représentés sous forme d'une image de projection maximale à différents points de temps, chaque point de temps étant coloré artificiellement.

Alternativement, les images d'une particule traceuse individuelle sont affichées sous forme de montage afin de montrer le déplacement de la particule traceuse. Au fil du temps, cette particule traceuse s'est déplacée vers et loin du bord postérieur de la cellule en migration, respectivement avant et après l'ajout de Y 2 7 6 3 2. L'analyse de type FRAP suit des cellules exprimant l'actine GFP pendant leur migration dans une matrice tridimensionnelle, indiquant une récupération typique de la fluorescence. Après une expérience de photoblanchiment réalisée avec des paramètres laser optimisés, l'intensité de fluorescence de la région d'intérêt est visiblement réduite par rapport au niveau du fond, tout en maintenant des cellules saines et non endommagées.

Ce graphique montre l'ajustement de la courbe de récupération à une fonction exponentielle. Une fois maîtrisée, la mise en place des cellules dans la matrice peut prendre une heure. N'oubliez pas que le travail avec la triméthylaminopropylamine peut être extrêmement dangereux.

Prenez donc des précautions, comme travailler sous hotte chimique. N'oubliez pas également de maintenir des conditions stériles lors de la manipulation de cellules dans une matrice 3D.