Name: Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse and MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Découvrez l'analyse par échange hydrogène/deutérium et spectrométrie de masse MALDI-TOF pour étudier l'activation de la kinase PAK2. Cette méthode révèle les dynamiques structurales protéiques.

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Ce travail est soutenu en partie par le National Institutes of Health Grant GM-26738 (à la JAT).

1. PAK2 activation <ol><li> Ajouter la pré-testés appropriée le montant de la caspase 3 à 20 ul de 12 mg / ml dans le tampon A PAK2 et (50 mM DTT mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, et 2 à pH 7,5) incuber à 34 ° C pendant 30 min pleinement cliver et activer PAK2. </li><li> Analyser les produits de clivage par SDS-PAGE (10%) et Coommassie coloration au bleu. </li><li> Ajouter le PAK2 clivé pour l&#39;activation de tampon B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 10 mM ATP) à pH 7,5, dans 20 ul d&#39;une concentration finale de 10 mg / ml PAK2, et incuber à 34 ° C pendant 30 min pour activer complètement PAK2 par autophosphorylation sur 8 sites. </li><li> Confirmer le clivage complet de PAK2 par la migration de l&#39;p34 et p27 fragments tel que déterminé par SDS-PAGE 10. Vérification adéquate des conditions autophosphorylation se fait via autoradiographie dans une expérience séparée en utilisant (32 P) l&#39;ATP ou la spectrométrie de masse pour détecter phosphopeptides. </li></ol> 2. Identificationde la pepsine à digérer PAK2 Fragments <ol><li> Ajouter 1 ml d&#39;acide trifluoroacétique à 0,1% (TFA) à pH 2,5 à laver les billes d&#39;agarose deux fois avant d&#39;utiliser. Puis, centrifuger les échantillons pendant 15 s à 2000 xg pour éliminer les bourrelets. </li><li> Ajouter PAK2 (20 pg dans 2 pi de NaCl 150 mM, DTT 50 mM Tris-HCl et 2 à pH 7,5) à 100 ul de 0,1% de TFA, et incuber l&#39;échantillon pendant 5 min avec 30 ul de billes d&#39;agarose pepsine conjugués . </li><li> Equilibrer une HPLC en phase inverse C18 avec un système de solvant primaire de TFA 0,1% à pH 2,5. La digestion par la pepsine (50 pi) est élue en utilisant un linéaire de 100 min gradient de 0 - 80% d&#39;acétonitrile contenant 0,1% de TFA à un débit de 0,2 ml / min. Les fractions sont collectées toutes les 2 min. </li><li> Sécher les fractions HPLC avec un speed-vac (3 h) et remettre en suspension les échantillons dans une solution d&#39;acétonitrile (5 pi) et de 0,1% de TFA (5 pi) à pH 2,5. </li><li> Initialement, chaque fraction est projeté pour les peptides à l&#39;aide du MALDI-TOF Voyager DE PerSeptive Biosystems STR (PE biosystems, Foster City, Californie, Etats-Unis). </li><li> Les 16 fractions contenant les peptides sont soumis à une spectrométrie de masse en tandem en utilisant un spectromètre de masse Q-TOF et un QSTAR XL oMALDI MS / MS pour identifier les fragments. </li><li> La séquence de chaque peptide est vérifiée par les ions produits générés par la spectrométrie de masse tandem avec l&#39;théoriques m / z ratios basés sur la séquence primaire de PAK2 utilisant le site Web de protéines Prospector ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Mesure de l&#39;amide échange H / D <ol><li> Tenir toutes les solutions et les réactifs nécessaires pour échange H / D à 25 ° C dans un bain d&#39;eau. L&#39;ATP est dissous dans l&#39;eau et le pH est ajusté à 7,0 avant utilisation. L&#39;ATP 4 mM supplémentaires dans le tampon D 2 O est de prévenir l&#39;ATP dissociée de PAK2 après dilution. </li><li> Initier échange H / D par addition de 18 pl d&#39;tamponné D 2 O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM de NaCl) à 2 ul (20 pg) De PAK2 dans un tampon contenant 150 mM de NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl (pH 7,5) et 2, résultant en un niveau PAK2 de 10 mg / ml et un pH de 7,0 à 0 ° C. </li><li> Incuber les échantillons en trois exemplaires, l&#39;échange H / D de 0, 0,5, 1, 3, 5 et 10 min, ou 24 h. </li><li> Quench le processus échange H / D en ajoutant 180 pl d&#39;glacée TFA 0,1% à pH 2,2, ce qui amène le pH à 2,5 dans un volume final de 200 pl. Pour les échantillons contenant de l&#39;ATP, 180 pl d&#39;glacée TFA 0,11% à pH 2,2 est utilisé pour maintenir le pH à 2,5 à l&#39;état trempé. </li><li> Ajouter une aliquote (100 pi) de chaque échantillon trempé à 30 ul de billes d&#39;agarose activé la pepsine-conjugué. La digestion par la pepsine est autorisé à procéder sur la glace pendant cinq minutes et les échantillons sont vortexés toutes les 30 secondes. </li><li> Mettre fin à la digestion par centrifugation de l&#39;échantillon pendant 15 s à 5000 xg à 4 ° C pour éliminer la pepsine. </li><li> Rapidement congeler les échantillons dans l&#39;azote liquide 2 et conserver à -80 ° C pendant plus de 2jours avant analyse MALDI-TOF. </li><li> La matrice pour MALDI est de 5 mg / ml d&#39;α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) dissous dans une solution (1:1:1) de l&#39;acétonitrile, l&#39;éthanol et 0,1% de TFA à pH 2,5 et maintenue à 0 ° C. </li><li> Décongeler partiellement chaque échantillon rapidement et mélanger 1 ul de chaque échantillon avec 1 pl de matrice et place sur une plaque à 4 ° C cible MALDI. </li><li> Appliquer un vide modéré à la plaque à sécher les taches en 30 secondes avant analyse MALDI-TOF. Le temps écoulé entre la décongélation de l&#39;échantillon et extraction du spectre est d&#39;environ 3 min. </li><li> Acquérir des spectres de masse MALDI-TOF avec un STR PerSeptive Biosystems Voyager DE. Acquérir des données à un taux d&#39;échantillonnage de 2 GHz à 100 000 canaux de données, avec une tension de 20.000 V accélération, et une tension de grille de 65% en utilisant l&#39;extraction retardée avec un retard d&#39;impulsion de 180 ns. Une centaine de scans sont en moyenne en 2 min. L&#39;instrument MALDI-TOF n&#39;est pas limité à n&#39;importe quelle marque ou tout autre logiciel particulier. </li><li> Utilisez le programme Data Explorer 4.0 à l&#39;ordinateur Calculmangé la deutération de chaque fragment. </li><li> Calculer l&#39;échange de retour basée sur le ratio du nombre deutéron incorporé réel à 24 heures de échange H / D divisé par tous les sites possibles échangeables, qui sont les amides épine dorsale, sauf l&#39;amide N-terminale (figure 1). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Le clivage des caspases et l&#39;autophosphorylation sont vérifiées par SDS-PAGE coloration Commassie. PAK2 inactif est une seule bande de 58 kDa. Le clivage de la caspase PAK2 est complet, et produit deux fragments, p27 et p34 qui migrent séparément. La migration de p27 et p34 autophosphorylée montre un chevauchement sur ​​le gel en raison de la migration de l&#39;retardé totalement phosphorylés p27 fragment (Figure 2). H / D des expériences de change sont effectuées plusieurs fois entre 0 et 10 min (figure 3). À titre d&#39;exemple, le cours moment de l&#39;incorporation de deutérium dans le m / zpEAK 1697.85 des PAK2 inactif est composé de plusieurs pics isotopiques comme le montre l&#39;évolution de l&#39;enveloppe de masse au cours du temps. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Figure 1. Équation pour le calcul de la deutération. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Figure 2. Autophosphorylation et le clivage des caspases d&#39;PAK2. Caspase-clivé PAK2 (voie de gauche), intactes PAK2 inactifs (au milieu voies) et de la caspase-clivé PAK2 autophosphorylée (voie de droite) ont été analysés par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coommassie. Adapté de Hsu, AJ et al 2. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Figure 3. Spectre de masse d&#39;un cours moment de l&#39;incorporation de deutérium pendant PAK2 inactif. PAK2 inactifs a été soumis à H / D ExchaESN pour les 0-10 min et analysés par MALDI-TOF. Un exemple de la distribution élargie isotopique de MALDI-TOF du pic m / z 1697,85 au cours du temps d&#39;échange H / D est montrée. La ligne pointillée rouge indique la moyenne de l&#39;enveloppe de masse et le déplacement de l&#39;enveloppe de masse montre l&#39;deutération d&#39;un peptide.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
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<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Identification de la pepsine fragments digérés est une étape critique de l&#39;expérience échange H / D. Identification incorrecte du peptide peut conduire à une conclusion erronée. PAK2 pepsine-digérée est éluée à travers une colonne HPLC phase inverse C18 pour obtenir un fond propre. Dans nos expériences, un total de 40 fractions ont été recueillies et soumises à MALDI-TOF. Peptides multiples pourraient être identifiés dans chacune des fractions. Les peptides ont été soumis à la spectrométrie de masse (Q-TOF MS / MS et oMALDI MS / MS) pour identifier leurs séquences. Les spectres MS / MS d&#39;un peptide devrait avoir au moins trois ions de produit pour confirmer l&#39;identification du peptide. Le programme Data Explorer 4.0 ordinateur (Applied Biosystems) effectue la correction de base initial et la filtration du bruit. Chaque spectre doit être étalonné sur deux pics séquencé. Nous calibrer notre spectre par la masse théorique de l&#39;undeuterated m / z qui sont 923,45 et 1697,84. TIl précision de la masse après l&#39;étalonnage peut atteindre 10 ppm. Après deutération, les mono-isotopique peut passer à un supérieur de masse. Augmentations d&#39;échelon unitaire de ces rapports m / z donné les masses améliorée associée à deutération. Les intensités maximales de l&#39;enveloppe de masse ne sera pas affecter le niveau de deutération. Toutefois, les intensités des pics des pics isotopiques dans une enveloppe de masse sont particulièrement critiques pour le calcul de la masse moyenne. La première étape du calcul de la deutéron est incorporé soustrayant la masse peptidique de l&#39;échantillon des non-deutérés de l&#39;échantillon deutérié. Trois autres facteurs, la D 2 O de dilution, les deutons résiduelle dans les chaînes latérales et l&#39;échange dos, devra être examiné plus avant dans le calcul (figure 1). La dilution de D 2 O est le facteur de dilution de D 2 O après le mélange de l&#39;échantillon et D 2 O buffer pour initier l&#39;échange H / D. Le deuton résiduelle (4,5%) dans les chaînes latérales de la pepsine digérerpeptides éd doit être soustraite. L&#39;arrière-échange est la perte inévitable de deutération dans tous les peptides deutérés et la pepsine-digérés dans le processus de mesure de masse. Le peptide le plus accessible au solvant (m / z = 1105,60) après 24 heures d&#39;échange H / D représente une région pleine de deutération. Le nombre deutéron constituée pour chacun des peptides est la différence entre le centroïde des peptides deutérés et non deutérés peptique PAK2. Le plus hautement deutéré peptide m / z 1105 a été choisie pour représenter deutération plein quand PAK2 était à 24 heures de échange H / D. Le ratio d&#39;échange Retour a été calculé par le nombre deutéron incorporé réel à 24 heures de échange H / D divisé par tous les sites possibles échangeables à peptide m / z 1105.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamique </td><td> Sigma </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF spectromètre de masse </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Explorer 4.0 programme informatique </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

amide hydrogène / deutérium analyse bourse &amp; maldi-tof spectrométrie de masse de pak2 activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogène / deutérium échange (échange H / D) couplée à la spectrométrie de masse a été largement utilisée pour analyser l&#39;interface des interactions protéine-protéine, protéine de conformation change, la dynamique des protéines et des interactions protéine-ligand. Échange H / D sur les positions amide épine dorsale a été utilisé pour mesurer le taux de deutération des micro-régions dans une protéine par spectrométrie de masse 1,2,3. La résolution de cette méthode dépend de digestion par la pepsine de la protéine deutérée d&#39;intérêt en peptides qui varient normalement de 3 à 20 résidus. Bien que la résolution de l&#39;échange H / D mesurée par spectrométrie de masse est inférieure à la résolution seul résidu mesuré par le simple hétéronucléaire cohérence quantique (HSQC) méthode de RMN, la spectrométrie de masse en mesure échange H / D n&#39;est pas limité par la taille de la protéines 4. Échange H / D est réalisé dans une solution aqueuse qui maintient la conformation des protéines. Nous fournissons une méthode qui utilIZES l&#39;MALDI-TOF pour la détection de deux, au lieu d&#39;un système HPLC / ESI (ionisation par électrospray)-MS 5,6. Le MALDI-TOF fournit des données précises sur l&#39;intensité de masse pour les peptides de la protéine digérée, dans ce cas la protéine kinase PAK2 (aussi appelée γ-Pak). Protéolyse de Pak 2 est réalisée en une digestion par la pepsine déconnecté. Cette méthode alternative, lorsque l&#39;utilisateur n&#39;a pas accès à une colonne de CLHP et la pepsine connecté à la spectrométrie de masse, ou lorsque la colonne de pepsine sur HPLC ne résulte pas en une carte de digestion optimale, par exemple, le disulfure fortement lié phospholipase A 2 sécrétée (SPLA 2). Utilisant cette méthode, nous avons réussi à surveiller l&#39;évolution du niveau lors de l&#39;activation de la deutération PAK2 par la caspase 3 clivage et l&#39;autophosphorylation 7,8,9.

MALDI-TOF spectrométrie de masse a été utilisé avec succès pour contrôler l&#39;amide d&#39;hydrogène / deutérium de change dans la protéine kinase PAK2 activation.

Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse &amp; MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation

L'échange hydrogène/deutérium des amides (échange H/D) couplé à la spectrométrie de masse a été largement utilisé pour analyser l'interface des interactions protéine-protéine...

Cette expérience montre comment utiliser la spectrométrie de masse pour suivre l'échange hydrogène-deutérium associé aux protéines. Les changements structuraux menant à des états d'activation consistent d'abord à cliver la protéine kinase PAC deux avec la caspase trois, puis à activer PAC deux par autophosphorylation en utilisant le TP comme substrat. Dans un second temps, digérer PAC deux avec la pepsine et analyser les fragments protéiques de PAC deux par spectrométrie de masse en tandem. Procéder ensuite à l'analyse des profils d'échange hydrogène-deutérium de PAC deux par une surveillance « mold off » du niveau de chaque fragment de PAC deux, et déterminer précisément le degré d'échange hydrogène-deutérium à l'aide d'une analyse par « mold to ». Ces données fournissent des informations importantes sur le clivage par la caspase trois et l'autophosphorylation de PAC deux.Cette méthode peut aider à répondre à des questions relatives à la dynamique des protéines, telles que les changements conformationnels des protéines, les interactions entre protéines et ligands, et les interactions protéine-protéine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la spectrométrie de masse LCQ avec échange de HD, est d'ordre instrumental. Cette procédure ne nécessite pas de spectrométrie de masse couplée à une HPLC pour analyser les résultats d'échange de HD, et elle est facile à mettre en œuvre. Pour cliver 0,6 microgramme de PAC deux.Ajoutez la caspase 3 et incubez la réaction à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Vérifiez la PAC 2 et la clivaison complète de la PAC 2 par analyse des produits par électrophorèse SDS-PAGE. Pour la réaction d'activation, ajoutez la PAC 2 clivée à 20 microlitres de tampon d'activation B et incubez à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes.Utilisez un gel SDS pour confirmer l'autophosphorylation par la migration des fragments P 34 et P 27. Commencez par laver deux fois les billes d'agro conjuguées à la purine avec un millilitre d'acide trifluoroacétique (TFA) 0,1 %, puis diluez deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre. Prélevez deux fois 100 microlitres de TFA 0,1 %, ajoutez 30 microlitres des billes d'agro conjuguées à la Pepsi lavées et incubez pendant cinq minutes.Procédez à l'équilibration d'une colonne en phase inverse HPLC-C18 avec 0,1 % de TFA à pH 2,5. Chargez ensuite le digest de Pepin et diluez à l’aide d’un gradient linéaire de 100 minutes. Récoltez les fractions toutes les deux minutes, après avoir séché les fractions HPLC à l’aide d’un évaporateur sous vide rapide.Suspendre les échantillons dans cinq microlitres d'acétonitrile et de 0,1 % de TFA à pH 2,5. Comme tamisage initial, analyser chaque fraction pour les peptides par moldy afin de détecter toutes les fractions contenant des peptides.Identifier les fragments par spectrométrie de masse en tandem. Utiliser la fonction produit MS dans Protein Prospector pour faire correspondre les ions fils aux rapports théoriques M/Z basés sur la séquence primaire de PAC deux. Équilibrer d'abord toutes les solutions et réactifs pour l'échange hydrogène-deutérium.Initier l'échange hydrogène-deutérium en ajoutant 18 microlitres de tampon D deux O à deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre. Conditionner deux, effectuer les réactions en triple exemplaire selon un cours temporel. Arrêter la réaction d'échange hydrogène-deutérium avec 180 microlitres de TFA à 0,1 % glacé à pH 2,2.Répartissez maintenant des aliquotes de 100 microlitres d'hydrogène deutérié. Ajoutez deux aliquotes pour chaque 30 microlitres de billes agrégées conjuguées de pépine activées. Incubez cette digestion à la pépine sur de la glace pendant cinq minutes.Vortexez toutes les 30 secondes pour interrompre efficacement les réactions de digestion par une centrifugation permettant d'éliminer rapidement la pépsine. Congelez les échantillons dans l'azote liquide en vue d'une analyse ultérieure. Préparez la matrice et conservez-la à zéro degré Celsius, puis décongelez partiellement chaque échantillon rapidement.Mélanger un microlitre d'échantillon avec un microlitre de matrice, puis déposer sur une plaque cible moisie à quatre degrés Celsius 30 secondes avant l'analyse. Appliquer un vide modéré sur la plaque pour sécher. Les taches continuent d'acquérir des spectres de masse moyennant 100 balayages en deux minutes.Procédez à l'utilisation du programme informatique Data Explorer 4.0 pour calculer la durée de chaque fragment. Calculez ensuite l'échange arrière en fonction du rapport entre l'incorporation réelle due à un nombre après 24 heures d'échange hydrogène-deutérium divisé par tous les sites échangeables possibles, qui sont les amides du squelette, à l'exception de l'amide terminal. Dans cet exemple, la clivaison et l'autophosphorylation de CASP Bay sont vérifiées par électrophorèse sur gel SDS et coloration au Kumasi.Le PAC deux inactif non phosphorylé est une bande unique de 58 kilodaltons CASP bay. Le clivage du PAC deux est complet et produit deux fragments : P 27, le domaine régulateur, et P 34, le domaine catalytique, suite à l'auto-phosphorylation. La migration des fragments P 27 et P 34 auto-phosphorylés montre un recouvrement sur le gel protéique en raison de la migration retardée du fragment P 27 entièrement phosphorylé par rapport au PAC deux non phosphorylé.Ce spectre de masse montre un suivi temporel de l'incorporation de deutérium pour la PAC inactive deux. Le pic MZ 1697,85 est composé de plusieurs pics isotopiques, comme illustré par le déplacement de l'enveloppe de masse. Au fil du temps, la ligne pointillée rouge indique la moyenne de l'enveloppe de masse, et le déplacement de cette enveloppe indique la durée d'un peptide une fois maîtrisée.Cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. N'oubliez pas que le travail avec de l'azote liquide peut être extrêmement dangereux ; prenez donc des précautions, telles que percer un trou dans le bouchon du tube EOL de 1,5 ml avant de le placer dans l'azote liquide.

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Nous décrivons ici un protocole pour la purification et la caractérisation de complexes de protéines végétales. Nous démontrons que par immunoprécipitation une seule protéine dans un complexe, afin que nous puissions identifier ses modifications post-traductionnelles et ses partenaires d'interaction.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

En utilisant des puces à protéines contenant presque toute la S. cerevisiae protéome est sondé pour interrogatoire impartiale rapide de milliers d'interactions protéine-protéine en parallèle. Cette méthode peut être utilisée pour la molécule de protéine-petite, la modification post-traductionnelle, et d'autres dosages in à haut débit.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Les protéines kinases sont des enzymes de signalisation hautement évoluées et des échafaudages qui sont essentiels pour la transduction du signal inter et intracellulaire. Nous présentons un protocole pour mesurer l'activité de la kinase par l'utilisation d'adénosine triphosphate radiomarqué ([γ- 32 P] ATP), une méthode fiable pour faciliter l'élucidation de la régulation de la signalisation cellulaire.

Dosage de l&#39;activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

Ce flux de travail décrit la performance de l’enrichissement rentable et temporel de multiples modifications post-traductionnelle (PTM) de protéines simultanément pour l’analyse protéomique globale quantitative. Le protocole utilise l’enrichissement ptM de niveau peptidique avec de multiples anticorps conjugués, suivi d’une analyse de spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données pour obtenir des connaissances biologiques sur le crosstalk PTM.

Enrichissement simultané d’affinité de deux modifications post-traductionnelle pour la quantification et la localisation des sites

Les synthetases de lanthipeptide catalysent les réactions en plusieurs étapes pendant la biosynthèse des produits naturels peptidiques. Ici, nous décrivons un flux de travail continu, ascendant, de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) qui peut être employé pour étudier la dynamique conformationnelle des synthetases de lanthipeptide, aussi bien que d’autres enzymes semblables impliquées dans la biosynthèse de produit naturel de peptide.

Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

L’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et le marquage isobarique (cPILOT) est une stratégie améliorée de multiplexage d’échantillons qui est capable d’augmenter le nombre d’échantillons qui peuvent être analysés simultanément avec les étiquettes isobariques disponibles. L’incorporation d’une plate-forme robotique a considérablement augmenté le débit expérimental, la reproductibilité et la précision quantitative.

Multiplexage automatisé de l’échantillon à l’aide de l’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et du marquage isobarique (cPILOT)

La capacité d’évaluer l’engagement cible par les inhibiteurs candidats dans les cellules intactes est cruciale pour la découverte de médicaments. Ce protocole décrit un test de décalage thermique cellulaire de format 384 qui détecte de façon fiable l’engagement cellulaire des inhibiteurs ciblant soit le SHP2 de type sauvage, soit ses variantes oncogènes.

Évaluation de l’engagement des cibles cellulaires par inhibiteurs de la phosphatase SHP2 (PTPN11)

Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement des phosphoprotéines phosphatases endogènes et de leurs protéines en interaction à partir de cellules et de tissus et leur identification et quantification par spectrométrie de masse protéomique.

Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs

Découvrez l'analyse par échange hydrogène/deutérium et spectrométrie de masse MALDI-TOF pour étudier l'activation de la kinase PAK2. Cette méthode révèle les dynamiques structurales protéiques.

Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse & MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation

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