Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse & MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation

Cette expérience montre comment utiliser la spectrométrie de masse pour surveiller l’échange d’hydrogène et de deutérium associé aux protéines. Changements structurels qui conduisent à des états d’activation d’abord Cleve protéine kinase PAC deux avec caspase trois, puis activent PAC deux par autophosphorylation en utilisant un TP comme substrat comme deuxième étape digérer PAC deux avec Pepin et analyser les fragments de Prote PAC deux par spectrométrie de masse en tandem procéder à l’analyse des modèles d’échange d’hydrogène deutérium de PAC deux par moulage surveillance du niveau de durée de chaque PAC deux fragment le précis niveau d’échange d’hydrogène deutérium à l’aide du moule à l’analyse. Fournir des informations importantes sur le clivage de la caspase trois et l’autophosphorylation de PAC deux.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions de dynamique des protéines telles que les changements de conformation des protéines, les interactions entre les ligands des protéines et les interactions protéine-protéine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la spectrométrie de masse LCQ à échange HD est déterminant. Cette procédure ne nécessite pas de spectrométrie de masse liée à HPLC pour analyser les résultats d’échange HD, et la procédure est facile à utiliser pour cliver 0,6 microgramme de PAC deux.

Ajoutez la caspase trois et incubez la réaction à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Vérifier le PAC deux et compléter le clivage du PAC deux par l’analyse des produits par page FDS. Pour la réaction d’activation, ajoutez l’emballage clivé de deux à 20 microlitres de tampon d’activation B et incubez à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Utilisez la page SDS pour confirmer l’autophosphorylation par migration des fragments P 34 et P 27. Tout d’abord, lavez deux fois les vitesses aro conjuguées puriques avec un millilitre d’acide trifluoroacétique à 0,1 % et diluez deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre. Emballez-en deux dans 100 microlitres de 0,1 % TFA, ajoutez 30 microlitres de Pepsi lavé dans des billes agro conjuguées et incubez pendant cinq minutes.

Procéder à l’équilibrage d’une colonne H-P-L-C-C 18 en phase inverse avec 0,1 % d’AGT à pH 2,5. Chargez maintenant le Pepin Digest et diluez-le à l’aide d’un gradient linéaire de 100 minutes. Collectez les fractions toutes les deux minutes après séchage des fractions HPLC avec un VAC reus rapide.

Suspendre les échantillons dans cinq microlitres d’acéto-nitrile et de 0,1 % de TFA à un pH de 2,5. Comme premier écran. Analysez chaque fraction pour les peptides par moisi à pour toutes les fractions contenant des peptides.

Identifier les fragments par spectrométrie de masse en tandem. Utilisez la fonction du produit MS dans le prospecteur de protéines pour faire correspondre les ions filles et les rapports MZ théoriques basés sur la séquence primaire de PAC deux. Tout d’abord, équilibrez toutes les solutions et tous les réactifs pour l’échange d’hydrogène et de deutérium.

Initier l’échange d’hydrogène deutérium en ajoutant 18 microlitres de tampon D deux O à deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre. Emballez-en deux, effectuez des réactions en trois exemplaires sur une période donnée. Trempez la réaction d’hydrogène-deutérium avec 180 microlitres de glace froide à 0,1 % TFA à pH 2,2.

Distribuez maintenant 100 aliquotes de microlitres d’hydrogène-deutérium. Emballez deux pour 30 microlitres de billes d’agrégat conjuguées à la pépine activée. Incuber cette digestion pépin sur de la glace pendant cinq minutes.

Le vortex toutes les 30 secondes met fin efficacement aux réactions de digestion par centrifugation pour éliminer rapidement la pépin. Congelez les échantillons dans de l’azote liquide pour l’analyse. Préparez la matrice et conservez-la à zéro degré Celsius, décongelez partiellement chaque échantillon rapidement.

Mélangez un microlitre d’échantillon avec un microlitre de matrice, puis placez-le sur une plaque cible moisie à quatre degrés Celsius 30 secondes avant de moisir pour l’analyse. Appliquez un vide modéré sur la plaque pour qu’elle sèche. Les taches continuent d’acquérir des spectres de moisi à de masse en moyenne 100 balayages en deux minutes.

Utilisez le programme informatique Data Explorer 4.0 pour calculer la durée de chaque fragment. Calculez ensuite l’échange inverse en fonction du rapport de l’incorporation réelle due à un nombre à 24 heures d’échange d’hydrogène deutérium divisé par tous les sites échangeables possibles, qui sont les amides du squelette, à l’exception de l’amide terminal terminal. Dans cet exemple, le clivage et l’autophosphorylation de CASP Bay sont vérifiés par coloration de Kumasi.

Le PAC inactif non phosphorylé deux est une bande unique de 58 kilodaltons de baie CASP. Le clivage de PAC deux est complet et produit deux fragments, P 27, le domaine régulateur et P 34, le domaine catalytique après autophosphorylation. La migration du P 27 autophosphorylé et du P 34 montre un chevauchement sur le gel protéique en raison de la migration retardée du fragment P 27 entièrement phosphorylé par rapport au deuxième paquet non phosphorylé.

Ce spectre de masse montre une évolution temporelle de l’incorporation du deutérium pour PAC deux inactif. Le pic MZ 1697.85 est composé de plusieurs pics isotopiques, comme le montre le décalage de l’enveloppe de masse. Au fil du temps, la ligne pointillée rouge indique la moyenne de l’enveloppe de masse et le décalage de l’enveloppe de masse indique la durée d’un peptide une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée. N’oubliez pas que travailler avec de l’azote liquide peut être extrêmement dangereux, alors prenez des précautions telles que percer un trou sur le capuchon du tube EOL de 1,5 mil avant de le mettre dans des azotes liquides.