Analyse de la migration des crêtes neurales et la différenciation par la Croix-espèces transplantation

L'objectif général de cette procédure est de greffer un explant de tube neural dorsal provenant d'un embryon de caille dans un embryon de poulet de stade correspondant, afin de suivre la migration et le destin des cellules de la crête neurale. Cette opération s'effectue en déchirant d'abord un petit trou dans la membrane IGN de l'embryon de poulet hôte pour accéder au tube neural. L'embryon de caille donneur est ensuite retiré de son œuf afin de le préparer à l'excision du greffon.

À l'étape suivante, la région d'intérêt est excisée du tube neural de l'embryon hôte. Une région similaire est ensuite excisée du tube neural du donneur pour la greffe. Ensuite, le tube neural du donneur est transplanté dans le tube neural de l'hôte.

Enfin, l'embryon chimérique est incubé jusqu'au stade souhaité afin de détecter les cellules arrivées de la crête neurale dans l'organe choisi. En définitive, la migration et la différenciation des cellules de la crête neurale issues du donneur vers divers emplacements dans l'embryon hôte peuvent être visualisées par microscopie d'immunofluorescence. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de microdissection et de greffe exigent des compétences motrices très fines, ce qui les rend difficiles à apprendre.

Commencez par laver tout débris des œufs de poussin à l’aide d’eau tiède. Disposez les œufs horizontalement sur un plateau, puis marquez au crayon les côtés orientés vers le haut afin d’indiquer la région où l’embryon sera localisé. Pour la préparation ex ovo des embryons donneurs, incubez les pattes de caille côté obtus.

Ensuite, placez les œufs dans une étuve incubée à 38 degrés Celsius avec humidification et activez la fonction d'oscillation. Une fois l'incubation terminée, stérilisez les sommets des œufs en les pulvérisant avec de l'éthanol à 70 %, puis essuyez-les rapidement avec un essuie-tout Kim. Pour éviter toute absorption à travers la coquille de l'œuf, placez chaque œuf stérilisé sur un support individuel pour œuf, similaire à la boîte de Pétri doublée avec des essuie-tout Kim pliés que l'on voit ici. Ensuite, à l’aide de pinces AA stérilisées, faites une petite ouverture en tapotant la surface supérieure de la coquille d’œuf à l’extrémité pointue de l’œuf.

Équipez une seringue de cinq millilitres d'une aiguille hypodermique de 18 et demi. Ensuite, avec le biseau orienté vers l'extrémité pointue de l'œuf, insérez l'aiguille verticalement dans le trou de la coquille d'œuf. Pour éviter d'endommager accidentellement le jaune par aspiration, nettoyez le trou avec de l'éthanol à 70 % comme précédemment et scellez-le avec du ruban adhésif transparent.

Ensuite, à l’aide de la pince double A, faites un autre trou sur la surface supérieure marquée de la branche horizontale, mais pas tout à fait au sommet. Insérez ensuite un côté de la pince à iris courbée dans le trou, parallèlement à l’œuf. Pincez ensuite la coquille en exerçant une pression vers le bas et en effectuant un mouvement circulaire.

Cassez un trou d’environ deux centimètres de diamètre dans la coquille de l’œuf de poule, jetez la partie de coquille retirée. L’embryon doit apparaître comme un disque opaque au-dessus du jaune. Écartez tous les œufs non fécondés, identifiables par une petite tache blanche à la surface du jaune ou par l’absence de l’ectoderme.

Maintenant, tout en portant une protection oculaire adéquate, courbez une aiguille hypodermique de calibre 26 et demi à un angle de 45 degrés à partir de la base de l'aiguille. Après avoir fixé l'aiguille courbée, côté biseau vers le haut, à une seringue d'un millilitre, remplissez l'aiguille avec de l'encre de Chine diluée. Percez la membrane du vitellus à l'extérieur du périmètre du blastoderme, puis glissez la pointe de l'aiguille sous l'embryon, près de la surface du vitellus, mais sans pénétrer les couches embryonnaires.

Ensuite, injectez juste assez d'encre pour délimiter l'embryon, en évitant d'injecter des bulles. Retirez soigneusement l'aiguille. Utilisez maintenant un microscope stéréo et une source de lumière à faible émission de chaleur, comme la lampe à fibre optique à col de cygne illustrée ici.

Stadez les embryons selon Hamburger et Hamilton. Notez le stade sur les coquilles d'œuf. Appliquez ensuite deux à trois gouttes de solution de Ringer stérile tiède sur la surface des embryons afin d'éviter la déshydratation et la contamination.

Ensuite, tendez une pellicule de parafilme à la surface des œufs pour sceller temporairement les fenêtres. Préparez ensuite les œufs de caille pour la transplantation. Avant de retirer les œufs de l'incubateur, remplissez une boîte de Pétri avec une solution de Ringer.

Ensuite, ouvrez les œufs du côté émoussé à l’aide de pinces courbes pour faire apparaître l’embryon. À l’aide de ciseaux de dissection, effectuez quatre incisions en forme de carré à travers la membrane des villosités et l’épiderme externe, en dehors de l’embryon, en veillant à ce que toutes les incisions se rejoignent. Puis, à l’aide de pinces courbes à iris, saisissez délicatement un des bords découpés et soulevez l’embryon de l’œuf pour le transférer dans la boîte de Pétri préparée.

Enfin, retirez délicatement la membrane vitelline à l’aide d’une pince n°5, puis déterminez le stade des embryons au microscope stéréoscopique. Retirez le film parafin de l’embryon de poulet hôte. Ensuite, à l’aide d’une aiguille en tungstène aiguisée, percez un petit trou dans la membrane VII au niveau de la région souhaitée du tube neural.

Ajoutez une goutte de solution de Ringer à l'embryon. Ensuite, pour les greffes unilatérales, comme celle réalisée dans cette vidéo, utilisez une aiguille en verre coulée pour effectuer soigneusement des incisions transversales rostrales et caudales dans la région du mésencéphale du tube neural, sans dépasser la lumière. Puis sectionnez bilatéralement entre le tube neural dorsal et le mésoderme pariétal.

Enfin, séparez soigneusement l'explant excisé du tube neural, puis retirez-le de l'embryon en l'aspirant dans une micropipette en verre. Commencez par utiliser un embryon de caille apparié au stade. Ensuite, excisez une région du tube neural de taille similaire à celle qui vient d'être montrée et aspirez l'explant donneur X dans une micropipette en verre contenant une solution de Ringer.

Transférez l'explant X à côté de la région excisée de l'hôte poulet. Puis, à l'aide d'une aiguille de verre étirée, orientez délicatement l'explant en le guidant dans la région ablatée. Ajoutez soigneusement quelques gouttes de solution de Ringer à l'embryon pour éviter la déshydratation.

Enfin, scellez la fenêtre avec du ruban adhésif, en veillant à ce que le ruban obture bien toute la région de l'œuf fenêtré, puis remettez l'œuf dans l'incubateur jusqu'au stade souhaité, en désactivant la fonction d'oscillation pendant l'incubation des kyira. Les œufs peuvent être doucement retournés à la main deux fois par jour afin d'en augmenter la viabilité. Si l'on vise des stades plus avancés du développement, cette image représentative de la région greffée du tube neural après six heures de réincubation jusqu'au stade HH 11 montre l'intégration attendue du tissu donneur de caille dans le tube neural de l'embryon de poulet. Cette coupe transversale de la région greffée au stade HH 11 montre des cellules de la crête neurale marquées avec hnk, dont l'une migre latéralement en s'éloignant du tube neural.

Les cellules de caille contribuant au flux migratoire des cellules de la crête neurale et au tube neural sont clairement marquées par QCPN. À des stades plus tardifs, on peut suivre les cellules dérivées des cellules de la crête neurale de caille jusqu'à leur tissu cible final. Comme on peut le voir sur cette figure, les cellules marquées par QCPN sont disséminées au sein du mésenchyme de l'embryon de poulet du processus maxillaire. À E5, l'anticorps QCPN peut facilement être combiné avec d'autres anticorps afin d'examiner la différenciation des cellules de la crête neurale d'origine caillette.

Dans l'environnement hôte. Comme on le voit ici, les neurones sensoriels trigéminés dérivés des cellules de la crête neurale de caille sont marqués par les anticorps QCPN et T UJ un. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie et l'hybridation in situ peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les tissus auxquels donnent les cellules de la crête neurale, et les gènes que ces cellules expriment lorsqu'elles se différencient en divers tissus.