Modèles de MAME pour 4D imagerie des cellules vivantes de la tumeur: Interactions microenvironnement Progression impact malin

L'objectif général de cette procédure est de construire des modèles de co-culture tridimensionnels appelés ingénierie de l'architecture et du microenvironnement mammaires, ou MAM, destinés à l'imagerie en temps réel de cellules vivantes pour l'étude des interactions entre cellules. Cela est réalisé en premier lieu en recouvrant des lamelles avec du collagène de type I marqué DQ, ou DQ collagène I. Matrice de collagène I.

Ensuite, du collagène DQ inactivé. Quatre. Une matrice de membrane basale reconstituée est ajoutée par-dessus le collagène DQ solidifié, la matrice de collagène I contenant des fibroblastes intégrés. Dans la troisième étape, une suspension de cellules épithéliales ou tumorales est déposée sur les lamelles, permettant aux cellules de s'attacher au collagène DQ, à la matrice de membrane basale reconstituée, puis le milieu est ajouté.

Enfin, la microscopie confocale est utilisée pour réaliser une imagerie en quatre dimensions, qui analyse une image selon trois dimensions spatiales, plus le temps, dans des cocultures vivantes de mam. En définitive, l'imagerie en quatre dimensions permet la visualisation et l'analyse des interactions dynamiques entre les cellules tumorales du sein et les autres cellules du microenvironnement tumoral susceptibles d'influencer la progression vers un phénotype invasif. Un avantage majeur de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'imagerie intravitale, est que les interactions observées dans notre modèle se produisent entre des cellules d'une même espèce, à savoir des cellules tumorales humaines et des cellules associées au tumeur humaines, plutôt que, par exemple, entre des cellules tumorales humaines et des cellules stromales murines.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car l'assemblage des cultures du noyau principal nécessite d'abord d'être visualisé, puis exige des compétences modérées et de la pratique pour réussir. Commencez par placer une lame rectangulaire en plastique stérilisée à l'alcool. Insérez-la dans une boîte de culture de 35 millimètres ou utilisez une boîte IBI, une boîte mu de 35 millimètres.

Ensuite, mélanger le nombre souhaité de fibroblastes avec du collagène DQ. Puis, à l’aide d’une micropipette de 100 microlitres, pipeter soigneusement et étaler 70 microlitres du mélange fibroblastes-collagène DQ, une matrice de collagène un, sur toute la surface du lamelle et placer la boîte de culture dans une étuve humidifiée à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Une fois les matrices solidifiées, les laisser équilibrer pendant 10 minutes dans une étuve à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, placer la boîte sous une hotte jusqu'à ce qu'elle atteigne la température ambiante. Ajouter 60 microlitres de collagène DQ, puis quatre matrices de membrane basale réconstituées par-dessus le collagène DQ solidifié, suivis d'une matrice de collagène I contenant des fibroblastes intégrés. Puis, à l'aide d'une pipette, étaler soigneusement le collagène DQ et la matrice de membrane basale réconstituée de manière uniforme, en évitant de rayer la matrice de collagène DQ I contenant les fibroblastes.

Ensuite, transférez la boîte et la lamelle dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 minutes, le temps que la matrice de membrane basale reconstituée au collagène DQ durcisse. Traitez les cellules au trypsine et comptez-les pour la co-culture. Déposez maintenant 50 microlitres de la suspension cellulaire sur la lamelle revêtue et placez la boîte dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 40 à 60 minutes, afin de permettre aux cellules de s’attacher au collagène DQ. Quatre, après que les cellules se soient attachées à la matrice, reconstituez une matrice de membrane basale et ajoutez deux millilitres de milieu de culture contenant 2 % de membrane basale reconstituée dans la boîte de 35 millimètres.

Incuber ensuite pendant la durée souhaitée avant l'observation, après avoir lavé avec du PBS. Incuber les cocultures avec du traceur cellulaire orange à cinq micromolaire dans du milieu MEGM, dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, pendant 45 minutes. Après cette incubation, laver à nouveau les cocultures avec du PBS et les incuber avec du milieu MEGM préalablement réchauffé pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Observer les cocultures vivantes en faible grossissement. Par exemple, à 10 x à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau sur un microscope confocal, acquérir des sections optiques à des intervalles de 10 micromètres sur toute la profondeur des structures.

Utilisez les coupes optiques pour reconstruire les images en 3D à l'aide du logiciel Velocity ou d'un programme similaire. Créez des films à partir des reconstructions 3D afin de visualiser les structures, les interactions entre cellules et les interactions avec la matrice environnante. Dans ce schéma représentatif d'une co-culture maim, une plaque IBI treat mu a d'abord été recouverte de collagène, l'une contenant du collagène DQ, l'autre en présence de fibroblastes, comme indiqué ici en magenta.

Ensuite, une seconde couche de membrane basale reconstituée contenant du collagène IV DQ a été ajoutée. Puis, les cellules tumorales marquées en rouge ont été ensemencées en surface avec 2 % de membrane basale reconstituée, en culture.

Le milieu représenté par les points de couleur crème a été ajouté à chaque changement de milieu. Les produits de clivage fluorescents du collagène DQ un et quatre sont représentés en vert. Au cours des 23 jours de ce co-culture représentatif MCF 10 DCIS et WS 12 TI, il y a eu une prolifération des cellules observées ici et dans les figures suivantes, en rouge, ainsi qu'une dégradation du collagène DQ quatre et un observée ici et dans les figures suivantes, en vert, et une réduction des matrices de collagène, indiquée par la diminution du volume des co-cultures.

Les mêmes co-cultures vivantes ont été observées pendant 23 jours, avec des images capturées par microscopie confocale aux jours 3, 16 et 23 de la co-culture. Les interactions dans les co-cultures Mame sont dynamiques et peuvent évoluer au fil du temps. Par exemple, comme on le voit dans ce modèle 3D de la co-culture cellulaire Mame au jour 3, les cellules commencent tout juste à proliférer dans les matrices à ce stade, restant encore assez stables, comme en témoigne l'absence de fluorescence verte.

Cependant, au jour 16, alors que les cellules continuent de proliférer, elles ont également commencé à dégrader la structure de la matrice, comme observé ici par les produits de clivage du collagène DQ, un et quatre, en vert, et par la dégradation active de la matrice par les cellules, là où la matrice et les cellules présentent une co-localisation fluorescente observée en jaune. Au jour 23, près de la moitié de la matrice a été dégradée par les cellules en prolifération rapide, comparé au jour 3 où le volume de la co-culture était de 110 000 micromètres cubes. Entre le jour 16 et le jour 23, le volume a été réduit à seulement 46 250 micromètres cubes à ce jour.

16 co-culture, la protéolyse du collagène DQ quatre à la surface des cellules DCIS en rouge, et la protéolyse diffuse du collagène DQ, un dans les zones proches des fibroblastes en blanc, peuvent être observées. La coloration différentielle utilisée dans cette co-culture permet également d'observer les schémas distincts de migration et de prolifération des deux types cellulaires après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer du sein pour explorer les effets du macroenvironnement tumoral sur la progression du cancer, en conservant l'imagerie en temps réel des interactions dynamiques entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales environnantes.