Préparation individuelle Drosophila Œuf Chambres pour l'imagerie en direct

L'objectif de l'expérience suivante est d'enregistrer les processus dynamiques dans les sites U vivants de drosophile. Cela est réalisé en isolant d'abord des ovaires intacts de mouches femelles âgées de deux jours et bien nourries. Dans un deuxième temps, des follicules individuels sont extraits des ovaires afin d'observer les chambres à œufs.

Ensuite, s'ils expriment une protéine fluorescente appropriée, des chambres œuf individuelles peuvent être directement observées ou subir des manipulations supplémentaires, telles que l'injection de marqueurs fluorescents avant l'observation. En fin de compte, grâce à l'analyse des séquences vidéo, les interactions dynamiques des composants intracellulaires peuvent être mises en évidence. Cette méthode nous a aidés à répondre à certaines questions clés dans le domaine du transport de l'ARN et de la traduction localisée.

Par exemple, comment l'expression des protéines qui établissent le plan corporel est-elle régulée dans le temps et l'espace au sein de l'embryon vivant ? En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car elle exige une grande rapidité et dextérité. Une pratique assidue permettra d'obtenir de meilleurs résultats.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les manipulations des chambres à œufs sont difficiles à décrire par écrit et nécessitent une expertise technique ainsi qu'une main sûre. Commencez cette procédure en déposant une petite goutte d'huile de carbone halogéné sur une lame couvre-objet et mettez-la de côté. Ensuite, anesthésiez les mouches préparées au dioxyde de carbone.

Utilisez une pince fine à pointe acérée pour saisir une femelle grasse à l'avant de l'abdomen. N'effectuez pas la saisie au centre de l'abdomen. Maintenez la femelle à environ deux à trois centimètres au-dessus de la lamelle préparée.

À l’aide d’une deuxième paire de forceps, retirer le tissu situé à l’extrémité postérieure de la femelle. Cela inclura généralement les tissus intestinaux, à prélever avec des forceps propres. Masser doucement l’abdomen de l’extrémité antérieure vers l’extrémité postérieure, comme si l’on pressait un tube de dentifrice.

Les ovaires ressemblent à de grandes structures opaques et adhèrent à l'extrémité de la pince. Ramassez les ovaires en les faisant toucher l'huile de carbone en halo sur la lame. Répétez ensuite le processus jusqu'à ce que quatre à six ovaires soient collectés.

Avant d'isoler les parties aériennes, régler la source lumineuse du microscope de manière à ce que l'illumination frappe la lame selon un angle faible et crée des ombres contrastées sur les tissus. Lors de la dissection des mouches, il est très important d'utiliser les outils appropriés.

Le stylet que nous utilisons n'est pas trop pointu afin de ne pas endommager le tissu, mais suffisamment émoussé pour que nous puissions saisir les pinces que nous utilisons. Encore une fois, pas trop pointu pour éviter d'abîmer les tissus, mais assez fin pour pouvoir manipuler les éléments sans courber l'outil. Il est également très important d'avoir des outils propres ; nous les nettoyons donc régulièrement tout au long de la procédure à l'aide de pinces fermées.

Séparez les deux ovaires en retirant le tissu conjonctif à l'extrémité postérieure. L'extrémité postérieure contient les chambres à œufs les plus matures. Orientez un ovaire horizontalement, avec les chambres à œufs les plus jeunes dirigées vers votre main dominante.

Ensuite, saisissez délicatement l'extrémité postérieure par le tissu conjonctif restant et utilisez une aiguille de dissection fine ou au tungstène pour extraire les follicules individuels ; les follicules allant du stade Jamar au stade 10 se sépareront les uns des autres, mais les follicules plus âgés resteront attachés à l'ovaire. À l’aide de la sonde, déplacez soigneusement 15 à 25 follicules séparés vers le centre de la goutte d’huile. Si plusieurs ovaires doivent être disséqués, choisissez-en un provenant d’une autre mouche.

Éliminez tout tissu ovarien excédentaire et travaillez rapidement, car les cytes commenceront à présenter des modifications phénotypiques dues au stress. Après 40 minutes d'excision de l'ovaire, retirez le tissu ovarien excédentaire de l'huile. En utilisant des instruments propres pour l'injection de cytes au stade intermédiaire, orientez les aiguilles perpendiculairement à l'axe longitudinal de la lame. Pour isoler les follicules ovariens au stade tardif.

Une méthode différente est requise pour saisir la partie postérieure de l'ovaire, comme décrit précédemment. Introduire la sonde de dissection à l'extrémité postérieure de l'ovaire, près de la pince. Pour éviter de percer les chambres à œufs, insérer la sonde entre les chambres à œufs de stade tardif.

Tirer l’aiguille de dissection à travers l’ovaire jusqu’à ce qu’elle ressorte au niveau des chambres à œufs au stade précoce. Lorsque l’opération est effectuée correctement, la sonde détache le tissu conjonctif qui maintient en place les aréoles et les chambres à œufs au stade tardif. Répéter cette étape jusqu’à ce que les aréoles soient bien étalées sur la lamelle.

Lorsque les chambres à œufs ne sont plus empilées les unes sur les autres, cette étape est terminée. À l’aide d’une sonde de dissection, séparez les chambres à œufs de stade tardif afin de faciliter l’imagerie pour positionner le stade 14. Pour les chambres du col, utilisez une pince pour saisir leurs appendices dorsaux.

Préparez les solutions à injecter en centrifugeant brièvement le mutt à grande vitesse. Cela formera un culot avec tout dépôt solide susceptible d'obstruer l'aiguille d'injection. Chargez ensuite l'aiguille d'injection à l'aide d'une pointe de chargement et fixez soigneusement l'aiguille chargée à l'injecteur.

Placez maintenant un petit morceau de verre à côté des échantillons et fixez la lame sur la platine du microscope. Le verre servira de paroi pour rompre ou défaire. Débranchez l'aiguille.

Préparez le microscope et l'appareil d'injection pour l'expérience. Veillez à ne pas casser la pointe de l'aiguille. Si possible, utilisez une platine motorisée dotée d'une fonction de visite de points pour marquer toutes les cellules au stade huit et au stade neuf destinées à l'injection.

Abaissez maintenant l'aiguille d'injection jusqu'à ce qu'elle touche l'huile. Sélectionnez le premier point sur la liste des points marqués et focalisez-vous sur le cyte. Abaissez manuellement l'aiguille jusqu'à ce qu'elle se trouve dans le même plan de focalisation que le cyte.

À l’aide des commandes du manipulateur, déplacez la pointe de l’aiguille d’injection jusqu’à ce qu’elle se trouve à l’intérieur du site U. Un mouvement rapide de pénétration est souvent plus efficace qu’un mouvement lent. Une fois en place, expulsez un petit volume à partir de l’aiguille et évaluez visuellement les effets.

Une répétition est requise. Si l'injection est réussie, le cytoplasme à l'intérieur de la cellule sera déplacé. La quantité précise de liquide injecté est difficile à quantifier.

Pour augmenter le volume injecté, ajustez soit la pression, soit la durée de l'impulsion d'injection. Cassez légèrement la pointe de l'aiguille pour agrandir légèrement l'ouverture, ou utilisez simplement plusieurs impulsions d'injection avant de sélectionner le cyte suivant. Soulevez suffisamment l'aiguille d'injection dans l'huile pour qu'elle n'entre pas en contact avec d'autres cytes.

Piquer de manière excessive ou laisser l'aiguille à l'intérieur de la cellule endommage gravement la chambre de l'ovocyte. Agissez donc rapidement. L'injection doit prendre moins de 10 secondes.

Si une erreur est commise, passez à la marque suivante sur le site. Ne perdez pas de temps sur les zones endommagées à la vue. Lorsque l'aiguille est bouchée, déplacez l'aiguille vers le fragment de verre cassé.

Avec le verre et l'aiguille dans le même plan focal, enfoncer délicatement l'aiguille dans le verre. Vérifier que l'aiguille n'est pas bouchée en appuyant sur le bouton d'injection et en observant si un liquide s'écoule de l'extrémité de l'aiguille. Lorsque tous les sites d'injection aux États-Unis ont été traités, retirer manuellement l'aiguille de l'huile et l'orienter hors du trajet du faisceau du microscope.

Veillez à ce qu'il soit en position sûre afin d'éviter tout dommage oculaire, et éteignez les lumières. Pour faciliter l'imagerie par fluorescence, la rapidité est impérative. Si une heure ou plus s'est écoulée entre l'isolement de la chambre œufs et l'injection des cytes, ces derniers seront difficiles à injecter et présenteront des modifications phénotypiques associées au stress.

Des problèmes similaires peuvent survenir en cas de manipulation brutale de la cyte ou d'injection de volumes excessifs. Les chambres œuf exprimant des protéines fluorescentes transgéniques peuvent être observées sans nécessiter d'injection. L'étiquetage par MS2 de l'ARN endogène peut être visualisé avec de bons résultats en utilisant les procédures d'isolement des tissus associées à la synthèse in vitro complète.

Des ARN Alexa 546 ont été injectés dans une chambre œuflée ME 31 BGFP ; les ARN se sont localisés à l'avant dorsal du cyte et ont formé un capuchon autour du noyau. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 10 minutes, du début de la dissection jusqu'au démarrage de l'observation. Lors de l'exécution de cette procédure, manipulez le tissu rapidement mais avec précaution. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment enregistrer des processus dynamiques dans des cytes vivants de Drosophila.