Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

L'objectif global de cette procédure est de générer une fenêtre crânienne stable et fine sur le cortex de la souris pour permettre une imagerie répétée sans perturbation de l'environnement intracrânien. Ceci est réalisé en attachant d'abord un support de tête qui permettra de tenir la tête de manière stable sous l'appareil d'imagerie. Ensuite, amincissez soigneusement le crâne dans une région au-dessus de la surface dorsale du cerveau et polissez la surface avec une pierre à grain fin.

Ensuite, couvrez la fenêtre avec un petit point de colle cyanoacrylate et un verre de couverture pour renforcer la fenêtre. La dernière étape consiste à préparer l'animal pour l'imagerie sous le microscope à deux photons. En fin de compte, en vivo, la microscopie à deux photons est utilisée pour montrer des structures fines telles que les artères, les capillaires veineux et les dendrites neuronales, qui peuvent être imagées jusqu'à 250 micromètres de profondeur dans le cortex sur plusieurs semaines.

Le principal avantage de cette technique de fenêtre crânienne est que le crâne recouvrant le cortex n'est pas atteint. Tout d'abord, nous amincissions le crâne pour obtenir une clarté optique, puis nous renforcions le crâne avec de la colle cyanoacrylate et le verre de couverture. Cette méthode devrait être utile pour étudier une diversité de souris transgéniques fluorescentes dans les états anesthésiés ou OIC.

Pour commencer cette procédure, stérilisez les outils chirurgicaux requis, anesthésiez une souris âgée d'environ trois à six semaines selon les méthodes du manuscrit qui l'accompagne. Vérifiez le réflexe en pinçant le doigt pour vous assurer que la souris est dans le plan d'anesthésie chirurgicale. Ensuite, fixez la souris dans un cadre stéréotaxique.

Maintenez la température corporelle de la souris à 37 degrés Celsius. Utilisez une sonde rectale à régulation de rétroaction et un coussin chauffant. Appliquez une pommade ophtalmique sur ses yeux pour retenir l'humidité.

Ensuite, rasez le cuir chevelu avec le petit rasoir électrique. Après cela, nettoyez le cuir chevelu avec du Betadine, suivi d'un tamponnement avec de l'alcool isopropylique à 70%. Ensuite, réchauffez un aliquot de liquide cérébrospinal artificiel stérile à 37 degrés Celsius sous un microscope.

Retirez le cuir chevelu sur toute la surface dorsale du crâne avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Coupez la peau latéralement jusqu'aux bords des muscles temporaux de chaque côté du crâne et postérieurement aux muscles du cou. Ensuite, utilisez une lame de scalpel pour retirer le périoste mince de la surface du crâne.

Ensuite, séchez et nettoyez le crâne. Après cela, appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la surface du crâne. Laissez la colle sécher complètement.

Cette couche de colle est nécessaire pour une adhérence correcte du ciment dentaire. Dans les étapes suivantes. Pour la préparation d'imagerie éveillée, percez des trous et introduisez deux vis autoperceuses numéro 0 0 0 dans la surface du crâne contralatéral.

Ensuite, fixez un connecteur rigide personnalisé avec deux points d'attache au crâne. Cela réduit considérablement les degrés de liberté et simplifie la relocalisation du même champ d'imagerie dans les études longitudinales. Une barre transversale large donne également amplement de place pour le placement des électrodes et la stimulation de la vivacité.

Ensuite, couvrez toute la surface du crâne, à l'exclusion de l'emplacement de la fenêtre avec une couche de ciment dentaire, assurez-vous que tous les bords exposés de la peau sont recouverts de ciment. Avant d'amincir le crâne, assurez-vous que les forets de perçage sont tranchants et évitez de les réutiliser. Utilisez un foret dentaire à basse vitesse pour amincir une région de deux millimètres sur deux millimètres sur le cortex somatosensoriel avec un foret d'un demi-millimètre.

Amincissez ensuite la surface du crâne sec pendant seulement quelques secondes à la fois avec le crâne périodiquement à un LCS pour éviter le chauffage. Ensuite, amincir l'os. Ensuite, passez le foret à une vitesse plus lente et rasez la surface du crâne avec de légères touches.

Le foret doit aborder la surface à environ 30 degrés de la verticale. Continuez à amincir l'os au-delà de la couche vasculaire jusqu'à la deuxième couche d'os. Au-dessus de la surface du cerveau.

Tenez le foret avec de petits mouvements contrôlés et n'appliquez de force que dans la direction latérale. Lorsque l'os est d'environ 50 microns d'épaisseur, les vaisseaux de pelage doivent être clairement visibles à travers l'os humide. À cette profondeur, de petits points blancs à l'intérieur de l'os deviendront visibles pendant quelques secondes.

Immédiatement après que la surface du crâne sec soit humidifiée, l'épaisseur finale de l'os doit être d'environ 10 à 15 microns. Lorsque l'os est suffisamment mince, les petits points blancs dans l'os ne seront plus visibles lorsque la surface du crâne sec est humidifiée. Polissez maintenant la fenêtre avec de la poudre d'oxyde d'étain.

Utilisez une petite pincée de poudre d'environ un quart de la taille de la fenêtre, agitez une bouillie de poudre avec un LCS en utilisant une broche de foret préfabriquée avec une tige en silicone. Polissez la surface pendant 10 minutes, éliminez soigneusement la poudre d'oxyde d'étain de la fenêtre et séchez l'os. Ce processus devrait aider à réduire les bords rugueux laissés par la broche de forage pendant la procédure d'amincissement.

Ensuite, coupez quelques morceaux carrés de verre de couverture numéro zéro de taille légèrement inférieure à la taille de la fenêtre. Utilisez un stylet pour marquer doucement les lignes horizontales et verticales séparées dans le verre. Glisser avec un bord droit sans casser le verre.

Placez ensuite le verre de couverture dans une boîte de Pétri. Séparez les morceaux de verre en frappant la boîte contre un bord de table. Ensuite, appliquez un petit point de colle Sano ACRL sur la fenêtre en utilisant l'extrémité en bois d'un applicateur en coton cassé.

Placez rapidement un morceau de verre de couverture prédécoupé sur la colle. Évitez de créer des bulles sous le verre de couverture une fois que la colle a été laissée sécher complètement pendant 15 minutes. Enlevez l'excès de colle cyanoacrylate de la surface supérieure du verre de couverture avec une lame de scalpel.

Scellez les bords de la fenêtre avec du ciment dentaire. Ensuite, formez un puits légèrement surélevé pour retenir l'eau pour la lentille de trempage. À la fin. Placez l'animal dans une cage chaude jusqu'à ce qu'il se rétablisse complètement de l'anesthésie.

Dans cette étape, stabilisez l'animal sur une planche optique pour l'imagerie et utilisez le cadre comme support de tête. Notre plaque séparée peut transporter l'animal et tous les dispositifs de surveillance physiologique assemblés comme une unité entre les sites chirurgicaux et d'imagerie à deux photons. Si une imagerie du flux sanguin est souhaitée, injectez 0,05 millilitres de colorant dextran fluorescent à 5%