Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

L'objectif général de cette procédure est de créer une fenêtre crânienne stable et mince au-dessus du cortex de la souris afin de permettre des imageries répétées sans perturber l'environnement intracrânien. Cela est réalisé en fixant d'abord un support pour la tête qui permettra de maintenir celle-ci de manière stable sous l'appareil d'imagerie. Ensuite, amincir soigneusement le crâne dans une région située au-dessus de la surface dorsale du cerveau et polir la surface avec une poudre abrasive fine.

Ensuite, recouvrir la fenêtre avec une petite quantité de colle cyanoacrylate et un coverslip afin de renforcer la fenêtre. La dernière étape consiste à préparer l'animal pour l'imagerie sous microscope à deux photons. En fin de compte, l'imagerie intravitale par microscopie à deux photons permet de visualiser des structures fines telles que les artérioles, les veinules, les capillaires et les dendrites neuronales, qui peuvent être observées jusqu'à 250 micromètres de profondeur dans le cortex pendant plusieurs semaines.

Le principal avantage de cette technique de fenêtre crânienne est que le crâne recouvrant le cortex n'est pas altéré. Tout d'abord, nous amincissons le crâne afin d'obtenir une transparence optique, puis nous renforçons le crâne avec de la colle cyanoacrylée et une lamelle de couverture. Cette méthode devrait être utile pour étudier une grande diversité de souris transgéniques fluorescentes à l'état anesthésié ou en état OIC.

Pour commencer cette procédure, stériliser les instruments chirurgicaux nécessaires au moyen d'un autoclave, puis anesthésier une souris âgée d'environ trois à six semaines selon les méthodes décrites dans le manuscrit accompagnant. Vérifier le réflexe en pinçant l'orteil afin de s'assurer que la souris est sous anesthésie chirurgicale. Ensuite, fixer la souris dans un cadre stéréotaxique.

Conserver la température corporelle de la souris à 37 degrés Celsius à l’aide d’une sonde rectale à régulation par rétroaction et d’un coussin chauffant. Appliquer un onguent ophtalmique sur ses yeux pour en maintenir l’humidité.

Ensuite, rasez le cuir chevelu avec le petit rasoir électrique. Après cela, nettoyez le cuir chevelu avec du Bétadine, puis passez-le avec de l'alcool isopropylique à 70 %. Puis réchauffez un aliquot de liquide céphalorachidien artificiel stérile à 37 degrés Celsius sous un microscope.

Retirer le cuir chevelu sur toute la surface dorsale du crâne à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux. Rogner la peau latéralement jusqu’aux bords des muscles temporaux de chaque côté du crâne et en arrière des muscles du cou. Ensuite, utiliser une lame de scalpel pour enlever le périoste fin de la surface du crâne.

Ensuite, séchez et nettoyez le crâne. Après cela, appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la surface du crâne. Laissez la colle sécher complètement.

Cette couche de colle est nécessaire pour une adhérence correcte du ciment dentaire. Dans les étapes suivantes, percez des trous et insérez deux vis autotaraudeuses de taille 0 0 0 dans la surface du crâne controlatérale.

Ensuite, fixez un connecteur rigide sur mesure doté de deux points d'attache sur le crâne. Cela réduit considérablement les degrés de liberté et simplifie la localisation du même champ d'imagerie lors d'études longitudinales. Une barre transversale large offre également suffisamment d'espace pour le positionnement des électrodes et la stimulation de la vibrance.

Ensuite, recouvrez toute la surface du crâne, à l'exception de l'emplacement de la fenêtre, d'une couche de ciment dentaire, en veillant à ce que tous les bords exposés de la peau soient recouverts de ciment. Avant d'aplanir le crâne, assurez-vous que les fraises de perçage sont bien aiguisées et évitez de les réutiliser. Utilisez une fraise dentaire à faible vitesse pour aplanir une région de deux millimètres sur deux millimètres au-dessus du cortex somatosensoriel à l'aide d'une fraise d'un demi-millimètre.

Ensuite, amincir la surface osseuse du crâne pendant seulement quelques secondes à la fois à l’aide du crâne avec un LCS de manière périodique pour éviter toute élévation de température. Puis amincir l’os. Passer ensuite à une vitesse plus lente et raser la surface du crâne en n’effectuant que de légers contacts.

La fraise doit s'approcher de la surface à un angle d'environ 30 degrés par rapport à la verticale. Continuer à amincir l'os au-delà de la couche vasculaire, jusqu'à la deuxième couche osseuse, au-dessus de la surface du cerveau.

Tenez la fraise avec de petits mouvements contrôlés et appliquez uniquement une force dans le sens latéral. Lorsque l'os mesure environ 50 micromètres d'épaisseur, les vaisseaux épluchés doivent être clairement visibles à travers l'os humide. À cette profondeur, de petites taches blanches apparaîtront brièvement à l'intérieur de l'os pendant quelques secondes.

Immédiatement après humidification de la surface osseuse sèche, l'épaisseur osseuse finale doit être d'environ 10 à 15 micromètres. Lorsque l'os est suffisamment mince, les petits points blancs dans l'os ne doivent plus être visibles après humidification de la surface osseuse sèche. Polissez maintenant la fenêtre avec de la poudre d'oxyde d'étain.

Utilisez une petite pincée de poudre d'environ un quart de la taille de la fenêtre, agitez une suspension de poudre avec un LCR à l'aide d'un foret préfabriqué muni d'une rallonge en silicone. Polissez la surface pendant 10 minutes, rincez soigneusement la poudre d'oxyde d'étain de la fenêtre et séchez l'os. Ce processus devrait aider à réduire les éventuels bords rugueux laissés par le foret lors de la procédure d'amincissement.

Ensuite, découpez quelques carrés en verre de couverture n°0 dont la taille est légèrement inférieure à celle de la fenêtre. Utilisez un stylet pour marquer délicatement des lignes horizontales et verticales séparées sur le verre de couverture. Faites glisser selon un bord droit sans casser le verre.

Ensuite, placez la lamelle dans une boîte de Pétri. Séparez les morceaux de verre en frappant la boîte contre le bord d'une table. Ensuite, appliquez une petite quantité de colle Sano ACRL sur la fenêtre à l'aide de l'extrémité en bois d'un applicateur en coton cassé.

Placez rapidement un morceau de verre de couverture préalablement découpé sur la colle. Évitez de former des bulles sous le verre de couverture après avoir laissé la colle sécher complètement pendant 15 minutes. Retirez l'excès de colle cyanoacrylée de la surface supérieure du verre de couverture à l’aide d’une lame de scalpel.

Scellez les bords de la fenêtre avec du ciment dentaire. Formez ensuite une chambre légèrement surélevée destinée à contenir de l'eau pour l'objectif à immersion à l'extrémité. Placez l'animal dans une cage chauffée jusqu'à ce qu'il se réveille complètement de l'anesthésie.

À cette étape, stabilisez l'animal sur une platine optique pour l'imagerie et utilisez le cadre comme support pour la tête. Notre plaque séparée permet de transporter l'animal ainsi que tous les dispositifs de surveillance physiologique assemblés en une seule unité entre le site chirurgical et celui d'imagerie à deux photons. Si une imagerie du flux sanguin est souhaitée, injectez 0,05 millilitres de colorant au dextran fluorescent à 5 % par la veine infra-orbitaire afin de marquer le sérum sanguin.

Cette procédure doit être réalisée sous anesthésie générale et le colorant reste généralement dans la circulation pendant plusieurs heures. Injecter une solution de Ringer lactatée par voie intrapéritonéale à un volume de trois microlitres par gramme toutes les deux heures afin de maintenir les besoins en liquides corporels et en énergie. Réveiller la souris en arrêtant l'isoflurane.

Une heure après le réveil, la souris est prête pour l'imagerie. Fermez la cage au-dessus du microscope afin d'éviter toute contamination lumineuse. Voici un exemple de la vascularisation corticale d'une cuisse, chez une souris YFP marquée par injection intraveineuse de dextran conjugué au Texas red ; les vaisseaux duraux sont souvent visibles légèrement au-dessus de la surface corticale dans la dure-mère.

De grosses artères de surface et des veines se trouvent sur la surface corticale. Les vaisseaux pénétrants partent de ce réseau superficiel et plongent dans le cortex, où ils se ramifient en un lit capillaire dense qui alimente le tissu cortical. Ce film montre la vascularisation à la surface de la lame chez une souris éveillée.

Des oscillations spontanées du diamètre artériel peuvent être observées lorsque l'animal se trouve dans un état de repos calme. Cette méthode devrait s'avérer utile pour étudier une grande variété d'animaux transgéniques fluorescents, qu'ils soient anesthésiés ou éveillés.