Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à l'aide Drosophila Tissus

Cette procédure permet d'obtenir des données de chromatine par immunoprécipitation à partir de tissus de drosophile disséqués afin de refléter précisément l'état de la chromatine dans les tissus de drosophile in vivo. Dans ce cas, des centaines de testicules sont récoltés par dissection manuelle. Des tests d'immunoprécipitation de la chromatine sont réalisés à l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt.

Effectuer un dosage d'analyse Q-P-C-R quantitative pour enrichir la région génomique spécifique dans l'ADN immunoprécipité purifié. Alternativement, le séquençage à haut débit de l'échantillon immunoprécipité permet d'obtenir un profil génomique complet. En fin de compte, l'analyse ChIP de tissus dissec­tés fournit une représentation de l'état de la chromatine dans les cellules issues de leurs conditions physiologiques.

Ce protocole est optimisé pour l'analyse de tissus directement isolés de l'organisme. Afin d'obtenir des états de la chromatine et des informations épigénétiques dans des conditions physiologiques réelles, nous allons démontrer l'utilisation de la technique ChIP chez la drosophile afin d'étudier l'état de la chromatine. Ce protocole peut désormais être appliqué à d'autres organismes tels que la souris ou le poisson zèbre.

La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle pour obtenir de l'ADN de qualité et en quantités insuffisantes afin de l'utiliser pour une puce ou la génération de bibliothèques de séquençage destinées à un séquençage à haut débit. Commencez par disséquer le tissu d'intérêt, dans ce cas environ 200 paires de testicules de drosophile, dans du PBS froid contenant un inhibiteur de protéase et 100 microgrammes par millilitre de PMSF. Après avoir rincé le tissu deux fois, resuspendez-le dans 200 microlitres de la même solution de PBS contenant les inhibiteurs.

Ensuite, fixer l'échantillon avec 5,5 microlitres de formaldéhyde à 37 % préchauffé. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Vortexer toutes les cinq minutes, puis laisser le tissu se déposer sur de la glace.

Rincer deux fois avec 450 microlitres de PBS contenant des inhibiteurs. Conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Combiner les échantillons de testicules de 200 oph dans un tube einor de 1,75 millilitre.

Aspirez le tampon et resuspendez les échantillons dans 200 microlitres de tampon de lyse. Dissociez complètement le tissu à l’aide d’un homogénéisateur bleu, en veillant à ce qu’il ne reste aucun agrégat, puis incubez 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, fragmentez l'échantillon à l'aide d'une puce microfluidique, puis laissez reposer sur de la glace pendant 50 secondes. Répétez l'opération quatre à cinq fois afin d'obtenir une taille de fragment optimale pour la cible de la puce. Ensuite, diluez avec 1,8 millilitre de tampon ripper pour obtenir un stock d'extrait de chromatine. Pour un dosage par puce réussi, il est essentiel de déterminer empiriquement la taille des fragments d'ADN.

Nous devons donc réaliser une électrophorèse sur gel avant de passer à l'expérience sur puce. Pour l'échantillon témoin d'entrée, prélever 50 microlitres. Ajouter deux microlitres de chlorure de sodium à cinq molaire et incuber à 65 degrés Celsius toute la nuit.

Pour inverser la réticulation, procédez à la conjugaison de l'anticorps à la protéine. Ajoutez des billes dans un tube fendor de 1,5 millilitre. Ajoutez 40 microlitres de billes de protéine A et 600 microlitres de PBS, puis agitez à quatre degrés Celsius pendant deux minutes.

Ensuite, appliquez les billes sur l'aimant et jetez le surnageant. Ajoutez maintenant 100 microlitres de PBS ainsi que l'anticorps d'intérêt. Incubez une heure à température ambiante.

Après avoir récupéré les billes au moyen d'un aimant, ajouter un millilitre d'extrait de chromatine tissulaire. Agiter à quatre degrés Celsius toute la nuit. Ensuite, placer l'échantillon de puces sur un aimant et éliminer le surnageant.

Procédez à des lavages d'un millilitre des billes récoltées à quatre degrés SIU pendant 10 minutes par lavage, puis remettez en suspension les billes dans 100 microlitres de tampon TE. Pour inverser les liaisons croisées des complexes ADN-protéines, ajoutez trois microlitres de SDS à 10 % et cinq microlitres de protéinase K à 20 milligrammes par millilitre. Incubez à 65 degrés Celsius toute la nuit.

Récupérez les billes sur un aimant. Transférez le surnageant contenant l'ADN dans un nouveau tube. Lavez les billes une fois et combinez les surnageants contenant l'ADN 2D.

Ensuite, purifiez l'ADN par une extraction au phénol-chloroforme et transférez la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Précipitez l'ADN avec 20 microgrammes par millilitre d'acrylamide linéaire ou de glycogène, 20 microlitres d'acétate de sodium à trois molar et 500 microlitres d'éthanol à 100 %.

Mélanger soigneusement et incuber à moins 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Récupérer l'ADN par centrifugation. Jeter le surnageant et laver le culot une fois avec 300 microlitres d'éthanol à 70 % après séchage à l'air.

Resuspendez les culots d'ADN dans 50 microlitres de tampon TE. Conservez les échantillons d'ADN fragmenté à moins 20 degrés Celsius. Préparez une dilution sériée de l'ADN génomique pour la courbe standard.

Dans une plaque de 96 puits, à l’aide de dilutions d’ADN génomique servant de témoin d’entrée ou d’ADN fragmenté, préparez une PCR quantitative de 20 microlitres en double. Faites tourner la plaque de 96 puits dans un mini centrifugeuse à plaque. Exécutez la plaque d’échantillons sur un système de PCR en temps réel pour valider les données. Vérifiez d’abord la présence d’un pic unique sur le tracé de dissociation thermique, indicatif d’un seul amplicon issu de la PCR.

Ensuite, tracer la courbe standard. À l'aide des données provenant de la série d'ADN génomique dilué, calculer la formule permettant de déterminer la quantité d'ADN en fonction du seuil de cycle (Ct). Déterminer également la phase linéaire de l'amplification exponentielle de la PCR pour chaque jeu d'amorces.

Si la valeur CT des échantillons d'ADN chippé et des contrôles d'entrée se situe dans la plage linéaire de la valeur CT, calculez alors l'enrichissement de l'ADN chippé par rapport à l'entrée prise en compte. Le facteur de dilution des réparations de terminaisons permet d'ajuster 0,1 à cinq microgrammes d'ADN chippé dans des réactions de 50 microlitres contenant la polymérase ADN T4 et la polynucléotide kinase T4. Incubez pendant 45 minutes à température ambiante, conformément aux instructions du fabricant.

Ensuite, purifiez l'ADN à l'aide d'un kit de purification de réaction MinLu. Poursuivez en ajoutant des extrémités en surbrin à l'extrémité 3' à l'aide d'une grande fragment de polymérase ADN I CLA NOW et de DATP, puis incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Passez à nouveau la réaction sur une colonne filtrante par centrifugation pour purifier et concentrer l'ADN.

Procédez à la ligation avec l'oligo adaptateur. Mélangez à partir d'Illumina en utilisant la ligase T4 de l'ADN et incubez pendant une heure à température ambiante. Ensuite, passez l'échantillon à travers le kit de purification de réaction MinElute.

Élution de l'ADN dans 20 microlitres. Ensuite, séparer l'échantillon d'ADN par électrophorèse en utilisant l'appareil egel. Isoler la bande de 200 à 400 paires de bases dans le gel et purifier à l'aide du kit d'extraction de gel KYOGEN.

Amplifiez maintenant une bibliothèque en utilisant des amorces en lecture double, les enzymes de fusion HF et pH du programme Illumina pendant 20 cycles PCR. Puis, sur un gel standard d'AOSE à 2 %, isolez des fragments d'ADN de 200 à 400 paires de bases pour un séquençage à haut débit dans le logiciel d'Ellen. Alignez toutes les lectures sur le génome de drosophile, en autorisant jusqu'à deux erreurs par rapport à la séquence de référence.

Conserver les lectures uniques pour l'analyse en aval en cas de lectures identiques multiples. Conserver jusqu'à trois copies afin de réduire les risques de biais dus à l'amplification par PCR. Ensuite, utiliser un script Python pour convertir la sortie du pipeline GA en fichiers de données extensibles pour navigateur.

Définir une taille de fenêtre de quatre paires de bases et une taille de fragment d'ADN de 160 paires de bases. Classifier les gènes de drosophile en gènes silencieux et gènes exprimés selon la valeur RPKM. Nombre numérique : désigner les gènes dont la valeur RPKM est égale à zéro.

En tant que groupe silencieux, classer les gènes ayant un RPKM supérieur à un dans un groupe exprimé, divisé en trois sous-groupes selon des niveaux d'expression faible, modéré et élevé. Enfin, comparer les niveaux de modification des histones et d'expression génique à l'aide d'un script Python décrit précédemment en 2007 dans « basal, the bag of marbles ». Les testicules mutants présentent un échec dans la transition des spermatogonies prolifératives vers les spermatocytes différenciant.

Cette expérience de QPCR sur puce utilise des testicules BAM comme source de cellules germinales indifférenciées afin d'analyser l'état de la chromatine des gènes clés requis pour la différenciation des spermatozoïdes, notamment l'enrichissement en modifications histoniques, comme la triméthylation de la lysine 27 de l'histone H3 ou la triméthylation de la lysine 4 de l'histone H3. L'expression des gènes de différenciation est déterminée par normalisation à un gène de référence exprimé de manière constitutive. Les gènes de différenciation, tels que le facteur de transcription spécifique au mâle 87 Don Juan et fuzzy onion, qui ne sont pas exprimés dans les testicules BAM, sont fortement enrichis en modification histonique répressive correspondant à la triméthylation de la lysine 27 de l'histone H3.

En outre, ils sont dépourvus de l'histone active. Trois, la modification histone lysine quatre méthylation trois. Une signature de la chromatine que nous appelons monovalente, en contraste avec la valence possédant à la fois l'histone trois lysine quatre méthylation trois et l'histone trois.

Lysine 27 méthylation trimé enrichie au niveau des gènes de différenciation dans les cellules souches embryonnaires. Données de séquençage ChIP utilisant le même jeu d'anticorps. Confirmer le résultat de qPCR ChIP montré dans la figure 1 : les régions génomiques des trois gènes de différenciation terminale testés sont fortement enrichies en triméthyl-lysine 27 de l'histone H3, mais pas en triméthyl-lysine 4 de l'histone H3.

En revanche, le cycline du vieillissement exprimé de façon constitutive présente une forte méthylation de la lysine 4 de l'histone H3 triméthylée, mais une faible méthylation de la lysine 27 de l'histone H3 triméthylée à proximité de son site de démarrage de la transcription. Cette figure montre les données de ChIP-séquençage de deux modifications histones situées près des sites de démarrage de la transcription de quatre classes de gènes différentiellement exprimés. La triméthylation de la lysine 27 de l'histone H3 est enrichie en aval des sites de démarrage de la transcription, ce qui est inversement corrélé au niveau d'expression des gènes.

Les gènes silencieux présentent le niveau le plus élevé de triméthylation de la lysine 27 de l'histone trois ; les gènes fortement exprimés ne montrent aucune liaison de la triméthylation de la lysine 27 de l'histone trois, ce qui est conforme au rôle répresseur de la triméthylation de la lysine 27 de l'histone trois sur l'expression génique. Inversement, l'enrichissement de la modification triméthylique de la lysine 4 de l'histone trois autour des sites d'initiation de la transcription montre une corrélation opposée avec le niveau d'expression génique, en accord avec le rôle activateur de cette marque histone trois, lysine quatre, triméthylée sur l'expression génique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être correctement réalisée en deux à trois jours. N'oubliez pas d'appliquer les précautions de sécurité lors de l'utilisation de phyl, du chloroforme et du formaldéhyde. Nous espérons que ce protocole vous a donné une compréhension suffisante de l'utilisation de l'immunoprécipitation de la chromatine afin d'analyser le paysage de la chromatine dans un tissu in vivo.