Radioactif In situ D'hybridation pour détecter divers profils d'expression génique dans les tissus

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier des régions d’expression génique particulière et de caractériser le moment et les niveaux d’expression génique pour contribuer à la compréhension de la fonction des gènes. Ceci est réalisé en récoltant et en préparant rapidement le tissu à utiliser dans la procédure afin de préserver l’intégrité du tissu. Dans un deuxième temps, le tissu est traité pour réduire la liaison de fond des sondes rabo.

Ensuite, les sondes Ribo sont hybridées au tissu et la liaison de la sonde RIBA est visualisée. À l’aide d’un film radiographique ou d’une émulsion sensible à la lumière, on obtient des résultats qui montrent l’emplacement et le niveau d’expression des gènes sur la base d’images radiographiques ou de microscopie et d’analyse à fond sombre et clair. En utilisant le logiciel Image J, il y a environ plusieurs étapes critiques qui doivent être bien faites sur lesquelles beaucoup de gens font des erreurs et l’une d’entre elles est, est la prévention de l’arrière-plan.

Il y a donc un certain nombre d’étapes qui peuvent vous donner des informations de base, telles qu’une mauvaise sation ou une hybridation insuffisante à la bonne température. Une autre est la contamination par l’ARN qui dégradera votre sonde d’ARN. Vous devez donc faire attention à ce que tout soit exempt d’ARN.

Et la troisième, c’est que les diapositives, lorsqu’elles sont trempées dans l’émulsion, vous devez vous assurer qu’il n’y a pas de fuites de lumière dans votre chambre noire ou d’émulsion d’exposition à toutes les étapes de ce processus, qui peut durer trois semaines. Hun Chen, qui est postdoctorant dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette technique. Après avoir récolté un cerveau frais et l’avoir rincé une fois, PBS intègre le cerveau dans des milieux techniques tissulaires OCT en immergeant le cerveau dans un moule contenant le milieu à température ambiante.

Assurez-vous que le cerveau est orienté au besoin pour la section. Ensuite, après avoir pulvérisé la glace carbonique avec de l’éthanol, congelez le tissu en plaçant le bloc dans le mélange d’éthanol et de glace sèche. En prenant soin de ne pas faire pénétrer l’éthanol à l’intérieur du bloc à l’aide d’un cryostat, coupez le tissu congelé en sections de 10 à 12 microns d’épaisseur et montez-le sur des lames super plus pour le cerveau et le tissu embryonnaire.

La meilleure température de coupe se situe dans la plage de moins 18 degrés Celsius à moins 20 degrés Celsius. Rangez les sections dans une boîte à diapositives à moins 80 degrés Celsius. Transférez les diapositives d’un stockage à moins 80 degrés Celsius sur une grille métallique sur de la glace sèche.

Ensuite, pendant que vous travaillez dans une hotte certifiée, placez le support dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % qui a été pré-avertie à trois à cinq degrés Celsius au-dessus de la température ambiante. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante après l’incubation, retirer le support du paraformaldéhyde et laver les lames en trempant le support dans du PBS 15 fois. Répétez cette étape de lavage deux fois en utilisant une solution PBS fraîche à chaque fois.

Ensuite, plongez les lames dans un tampon d’acétylation fraîchement préparé pendant 10 minutes pour réduire la liaison non spécifique de la sonde RIBA. Ensuite, lavez les lames comme précédemment, mais cette fois en utilisant deux fois SSPE comme solution de lavage. Déshydratez le tissu à travers une série de 70, 95 et 100 % d’éthanol pendant deux minutes dans chaque solution.

Ensuite, séchez les lames dans la hotte pendant au moins 10 à 15 minutes. Après avoir synthétisé la sonde RIBA, conformément aux instructions du protocole écrit, calculez le volume requis de sonde RIBA et de solution d’hybridation nécessaire pour toutes les lames. Préchauffez le mélange d’hybridation de la sonde Ribo à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour dénaturer la pipette à sonde Ribo 100 microlitres de la solution d’hybridation de sonde Ribo et l’aligner sur la lamelle. Ensuite, utilisez une deuxième lamelle en verre pour répartir uniformément la solution sur le mouchoir et la lamelle. Placez la diapositive horizontalement et face verticale dans une grille métallique et une fois que toutes les lames sont prêtes, plongez lentement la grille dans un bain d’huile à 65 degrés Celsius pendant un minimum de quatre heures et un maximum de 16 heures.

L’huile crée un joint étanche à l’air autour des glissières de couvercle qui suivent le tissu d’incubation de tout excès d’huile du support métallique contenant les lames. Ensuite, placez la grille dans un plateau en verre ou en métal contenant du chloroforme dans une hotte. Répétez le lavage avec un deuxième plateau contenant du chloroforme frais.

Ensuite, trempez la grille dans un capuchon à 0,1 % de betta me à de l’éthanol plus deux fois de solution SSPE pour desserrer les lamelles et dissoudre l’excès de solution d’hybridation. Transférez ensuite les lames dans une deuxième solution d’éthanol TER frais à 0,1 % et deux fois de solution SSPE. Transférez les lames découvertes dans un nouveau support dans un plateau contenant 0,1 % d’éthanol bêta macca TER en deux fois SSPE, en incubant cette solution pendant une heure à température ambiante pour éliminer l’excès de sonde d’ARN non lié.

Transférez ensuite le rack de lames dans un préchauffage deux fois SSPE plus 50 % pour une solution principale large à 65 degrés Celsius contenant du bêta-ME captoéthanol à une concentration finale de 0,1 % et incubez à 65 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, jetez cette solution et toutes les solutions de lavage aqueuses précédentes ainsi que les lamelles de recouvrement en tant que déchets radioactifs. Ensuite, lavez les diapositives deux fois avant la guerre 0,1 fois que SSPE a 65 degrés Celsius pendant 30 minutes chacune.

Ensuite, déshydratez le tissu à travers une série de 70 %, 95 % et 100 % d’éthanol pendant deux minutes dans chaque solution. Enfin, séchez les lames dans une hotte pendant au moins 30 minutes. Tout d’abord, pour déterminer si un signal radioactif est présent dans le tissu.

Placez les lames séchées dans une cassette de film, en travaillant dans une pièce sombre à l’aide d’une lumière sûre, placez un film radiographique sur les lames. Assurez-vous que les diapositives font face à la face émulsion du film, puis fermez la cassette. Exposez les diapositives au film pendant un à sept jours, en fonction de l’abondance prévue des transcriptions.

Une fois l’exposition terminée, développez le film radiographique dans un révélateur et un fixateur standard. Le signal d’hybridation apparaîtra sous forme de zones noires sur le film résultant de grains d’argent exposés dans l’émulsion pour déterminer la résolution cellulaire et voir le signal sur le tissu lui-même. Les lames sont trempées dans une émulsion photographique puis les comptoirs sont teintés.

Si les lames doivent être des comptoirs teintés de violet crestal, les sections doivent être liquéfiées conformément aux instructions du protocole écrit. À ce stade, en travaillant dans la pièce sombre, versez de l’eau distillée dans un tube. Prélevez l’émulsion uc NTB et diluez l’émulsion avec de l’eau distillée à un à un.

Après avoir fait fondre l’émulsion dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes, transférez-la dans un récipient en verre dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Le niveau de l’émulsion diluée doit maintenant couvrir toutes les sections d’une lame lorsque la lame y est trempée. S’il y a beaucoup de lames, une émulsion supplémentaire peut être nécessaire.

Trempez maintenant les lames dans l’émulsion diluée dans un bain-marie à 42 degrés Celsius, puis séchez les lames dans un récipient fermé et étanche à la lumière pendant la nuit dans la pièce sombre ou dans un four à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures avec les lumières éteintes. Après séchage, transférez les lames dans une boîte à diapositives. Scellez les bords avec du ruban électrique noir, puis recouvrez de papier d’aluminium.

Conservez les boîtes à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours à plusieurs semaines lorsque vous êtes prêt à développer, réchauffez les lames à température ambiante. Ensuite, pendant que vous travaillez dans la chambre noire, retirez le support contenant les diapositives des boîtes et développez-les dans le développeur de codec D 19 à 16 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, lavez les lames développées à l’eau du robinet à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, incubez les lames deux fois dans une solution de fixation à 19 degrés Celsius pendant six minutes chacune, les lumières de la pièce peuvent être allumées pendant la deuxième incubation du fixateur. Lavez maintenant les lames à l’eau courante à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, grattez l’émulsion de l’arrière de la lame pendant qu’elle est encore humide.

Enfin, contre-colorez avec 0,3 % de violet crestal, puis déshydratez les lames de montage selon les instructions du protocole écrit si nécessaire. Nettoyez ensuite tout excès d’émulsion à l’arrière des lames en les mouillant avec de l’eau et en grattant avec une lame de rasoir. Rincez les lames dans une solution d’éthanol à 80 % et essuyez-les une à deux fois doucement pour vous débarrasser des débris et de la poussière.

Prenez des photos sous un éclairage en fond noir ou en fond clair. Il peut être nécessaire de répéter deux à trois fois les étapes de grattage et de nettoyage afin d’obtenir de bonnes images sans particules de poussière, qui sont facilement visibles en fond noir sous un microscope à dissection. Les images suivantes sont des exemples d’autoradiographie d’hybridation in situ à partir de films radiographiques.

Cette image radiographique montre une section sagittale de toute la tête de l’oiseau chanteur zèbre Finch au 10e jour embryonnaire qui a été hybridée avec une sonde ribo antisens à Fox P one. Les grains exposés en noir sur le film montrent l’expression de l’ARN messager, comme on peut le voir dans les quatre cerveaux Fox P un messager, l’ARN est enrichi dans le mésoalium stri aum et le thalamus dorsal ici. L’image du film radiographique montre une section du même oiseau chanteur de pinson zébré qui a été hybridé avec la sonde RIBA à 90 cents à Cuper.

TF deux Co.TF deux s’enrichit en raison du besoin de palamalium et de thalamus plus ventral. Les images suivantes sont des exemples d’autoradiographie d’hybridation in situ à partir de lames d’émulsion. Cette image en fond sombre prise sous un microscope de dissection montre une section sagittale de la tête entière du diamant zébré au sixième jour après l’éclosion qui a été hybridée avec une sonde RIBA antisens à Fox P one.

Les grains d’argent blancs exposés dans l’émulsion au-dessus du tissu montrent l’expression de l’ARN messager. La couleur rouge représente la tache violette kressel. La barre d’échelle représente un millimètre.

Ici, l’image montre une section du même oiseau chanteur de pinson zébré qui a été hybridé avec une preuve de ribo antisens pour coop TF deux. Les images suivantes comparent l’étiquetage antisens et sensoriel qui montre différents motifs montrés lors de son autoradiographie sur des films radiographiques de tranches de tête de Saul prélevées sur un pinson zébré au 12e jour embryonnaire. La ligne pointillée indique le contour de l’ensemble du cerveau et le C marque le cervelet.

On peut voir que le brin antisens de PAC six est exprimé dans le cerveau comme surtout dans la zone ventriculaire. Cette section adjacente hybridée avec le brin odorant de la meute six ne révèle aucune expression de fond dans toute la tête de l’embryon, mais une expression apparente dans la couche pigmentaire de la rétine en tant que brin antisens. Les images suivantes montrent en C deux signaux d’expression génique et des lames trempées dans une émulsion prélevées dans le cerveau d’un pinson zébré au cours des derniers stades embryonnaires sous des vues en fond clair et en fond noir.

Cette image en fond clair montre l’expression de D un B au 10e jour embryonnaire. D’une exposition normale à l’émulsion, l’étiquette qui apparaît noire est à peine visible à ce grossissement. Cette image montre une coupe et un grossissement identiques à ceux de l’image précédente, mais sont passés à la vue en champ sombre montrant l’étiquetage en blanc dans le striatum et le thalamus.

Cette image en champ clair montre l’expression de la troisième fente au 12e jour embryonnaire. Après une surexposition à l’émulsion, l’étiquette noire est facilement visible. SC marque la position de la moelle épinière et CB marque la position du cervelet.

Le Rostral est orienté vers la gauche. L’image montrée ici est la même section et le grossissement est juste vu, mais passe en mode fond sombre montrant un étiquetage en blanc dans la moelle épinière qui correspond à l’image en fond clair. Les images suivantes montrent la résolution du grain d’argent au niveau cellulaire.

Montré ici est Fox P un messager, l’ARN, le marquage dans le diamant zébré les grains d’argent antérieurs apparaissent comme des taches noires au-dessus de la cellule colorée au violet crestal. Cette image montre une expression d’abondance élevée sur des cellules individuelles chez le mésoalium adulte du roselin mandarin. Cette image montre l’expression d’une faible abondance sur des cellules individuelles dans l’alium adjacent de la même section ici.

Salut Fox. P un messager. L’expression de l’ARN sur les cellules est observée dans le mésoalium embryonnaire du jour 12.

Les cellules embryonnaires observées ici sont plus petites et plus serrées par rapport aux cellules adultes observées dans les deux images précédentes. Enfin, cette image montre une expression de faible abondance sur les cellules de l’alium adjacent de la même section. En suivant cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunochimie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le type de cellule sur lequel le gène cible est exprimé.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire l’hybridation de l’institut. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs radiatifs peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des protections personnelles doivent toujours être prises pendant cette procédure.