Radioactif In situ D'hybridation pour détecter divers profils d'expression génique dans les tissus

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier les régions d'expression génique particulière et de caractériser le moment et les niveaux d'expression génique afin de contribuer à la compréhension de la fonction des gènes. Cela est réalisé en récoltant et en préparant rapidement le tissu destiné à être utilisé dans la procédure, afin de préserver l'intégrité du tissu. Dans une deuxième étape, le tissu est traité pour réduire la liaison de fond des sondes ribonucléiques.

Ensuite, les sondes ribo sont hybridées au tissu et la liaison de la sonde RIBA est visualisée. L'utilisation de film radiographique ou d'une émulsion sensible à la lumière permet d'obtenir des résultats montrant l'emplacement et le niveau d'expression génique, basés sur des images radiographiques ou sur une analyse en microscopie en champ clair et en contraste de phase. À l'aide du logiciel Image J, plusieurs étapes critiques doivent être correctement réalisées, des erreurs fréquentes étant commises par de nombreuses personnes, notamment la prévention du bruit de fond.

Il existe donc plusieurs étapes pouvant entraîner un fond élevé, comme une saturation insuffisante ou un hybride réalisé à une température inappropriée. Une autre cause est la contamination par des ARN, qui dégradera votre sonde d'ARN. Vous devez donc faire attention à maintenir tout le matériel exempt de RNases.

Et le troisième point est que, lorsque les lames sont plongées dans l'émulsion, vous devez vous assurer qu’il n’y a aucune fuite de lumière dans votre chambre noire ni d’exposition de l’émulsion à la lumière durant toutes les étapes de ce processus, qui peut durer trois semaines. Cette technique sera démontrée par Hun Chen, postdoctorant dans mon laboratoire. Après avoir prélevé un cerveau frais et l’avoir rincé dans du PBS 1x, inclure le cerveau dans un milieu OCT Tissue-Tek en immergeant le cerveau dans un moule contenant ce milieu à température ambiante.

Veillez à orienter le cerveau comme requis pour la sectionnement. Ensuite, après avoir vaporisé du dioxyde de carbone solide avec de l'éthanol, congeler le tissu en plaçant le bloc dans le mélange d'éthanol et de dioxyde de carbone solide. En prenant soin de ne pas introduire d'éthanol à l'intérieur du bloc, sectionner le tissu congelé à l'aide d'un cryostat en coupes de 10 à 12 micromètres d'épaisseur, puis monter celles-ci sur des lames super plus destinées aux tissus cérébral et embryonnaire.

La température optimale de coupe se situe entre moins 18 degrés Celsius et moins 20 degrés Celsius. Conservez les sections dans une boîte à lames à moins 80 degrés Celsius. Transférez les lames depuis le stockage à moins 80 degrés Celsius vers une grille métallique placée sur de la glace sèche.

Ensuite, tout en travaillant dans une hotte certifiée, placer la grille dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % préalablement réchauffée de trois à cinq degrés Celsius au-dessus de la température ambiante. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante ; après l'incubation, retirer la grille du paraformaldéhyde et laver les lames en immergeant la grille 15 fois dans du PBS. Répéter cette étape de lavage deux fois en utilisant à chaque fois une solution fraîche de PBS.

Ensuite, immergez les lames dans un tampon d'acétylation fraîchement préparé pendant 10 minutes afin de réduire la liaison non spécifique de la sonde RIBA. Puis lavez les lames comme précédemment, mais utilisez cette fois du SSPE deux fois comme solution de lavage. Déshydratez le tissu à l'aide d'une série d'éthanol à 70, 95 et 100 %, en deux minutes dans chaque solution.

Ensuite, faites sécher les lames dans la hotte aspirante pendant au moins 10 à 15 minutes. Après avoir synthétisé la sonde RIBA, conformément aux instructions du protocole écrit, calculez le volume requis de la sonde RIBA et de la solution d'hybridation nécessaire pour toutes les lames. Préchauffez le mélange d'hybridation de la sonde Ribo à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour dénaturer la sonde Ribo, pipeter 100 microlitres de la solution d'hybridation de la sonde Ribo et l'aligner sur la lame couvre-objet. Ensuite, utiliser une deuxième lame couvre-objet pour répartir uniformément la solution sur le tissu et la lame couvre-objet. Placer la lame horizontalement et orientée vers le haut dans un support métallique, puis, une fois que toutes les lames sont prêtes, immerger lentement le support dans un bain d'huile à 65 degrés Celsius pendant un minimum de quatre heures et un maximum de 16 heures.

L'huile crée un joint étanche autour des lamelles après l'incubation. Retirez tout excès d'huile du porte-objets métallique contenant les lamelles. Ensuite, placez le porte-objets dans un bac en verre ou en métal contenant du chloroforme, sous une hotte aspirante. Répétez le lavage avec un deuxième bac contenant du chloroforme frais.

Ensuite, plongez le porte-lame dans une solution d'éthanol à 0,1 % de betta me cap plus deux fois la solution SSPE afin de desserrer les lamelles et de dissoudre l'excès de solution d'hybridation. Puis transférez les lames dans une seconde solution fraîche d'éthanol à 0,1 % de betta me cap plus deux fois la solution SSPE. Transférez les lames découvertes dans un porte-lame neuf placé dans un bac contenant de l'éthanol à 0,1 % de beta macca TER dans deux fois la solution SSPE, et incubez cette solution pendant une heure à température ambiante pour éliminer l'excès de sonde d'ARN non liée.

Ensuite, transférez le porte-lame sur un bain préchauffé contenant deux fois la solution SSPE additionnée de 50 % de formamide à 65 degrés Celsius, avec du captoéthanol bêta-ME ajouté à une concentration finale de 0,1 %, et incubez à 65 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, éliminez cette solution ainsi que toutes les solutions de lavage aqueuses précédentes et les lamelles comme déchets radioactifs. Ensuite, lavez les lames deux fois dans une solution préchauffée de 0,1 fois SSPE à 65 degrés Celsius, pendant 30 minutes chacune.

Ensuite, déshydrater le tissu par une série d'éthanol à 70 %, 95 % et 100 % pendant deux minutes dans chaque solution. Enfin, sécher les lames dans une hotte aspirante pendant au moins 30 minutes. Premièrement, déterminer si un signal radioactif est présent dans le tissu.

Placer les lames sèches dans une cassette pour film, en travaillant dans une pièce sombre éclairée par une lumière sûre, puis poser un film radiographique sur les lames. S'assurer que les lames sont en contact avec le côté émulsion du film, puis fermer la cassette. Exposer les lames au film pendant un à sept jours, selon l'abondance attendue des transcrits.

Une fois l'exposition terminée, révélez le film radiographique dans un révélateur et un fixateur standards. Le signal d'hybridation apparaîtra sous forme de zones noires sur le film, résultant des grains d'argent exposés dans l'émulsion, permettant ensuite de déterminer la résolution cellulaire et d'observer le signal directement sur le tissu. Les lames sont plongées dans une émulsion photographique, puis contre-colorées.

Si les lames doivent être contre-colorées avec du violet de crésyl, les sections doivent alors être liquéfiées selon les instructions du protocole écrit. À ce stade, en travaillant dans la chambre noire, versez de l'eau distillée dans un tube. Prélevez de l'émulsion NTB uc et diluez l'émulsion avec de l'eau distillée à raison de un pour un.

Après avoir fait fondre l'émulsion dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes, transférez-la dans un récipient en verre pour trempage placé dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Le niveau de l'émulsion diluée doit maintenant recouvrir toutes les sections d'une lame lorsque celle-ci est immergée. S'il y a un grand nombre de lames, une quantité supplémentaire d'émulsion peut être nécessaire.

Plongez maintenant les lames dans l'émulsion diluée dans un bain-marie à 42 degrés Celsius, puis faites sécher les lames par trempage dans un récipient fermé, imperméable à la lumière, toute la nuit dans la chambre noire ou dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures, avec les lumières éteintes. Après le séchage, transférez les lames dans une boîte à lames. Scellez les bords avec du ruban adhésif électrique noir, puis recouvrez-les de papier d'aluminium.

Conserver les boîtes à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours à plusieurs semaines avant la révélation ; porter alors les lames à température ambiante. Ensuite, en travaillant dans la chambre noire, retirer le porte-lames contenant les lames des boîtes et les révéler dans le révélateur codec D 19 à 16 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Puis rincer les lames révélées à l’eau du robinet à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, incuber les lames deux fois dans la solution de fixation à 19 degrés Celsius pendant six minutes chacune ; les lumières de la pièce peuvent être allumées pendant la seconde incubation dans le fixateur. Laver maintenant les lames à l'eau courante à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Puis, à l'aide d'une lame de rasoir, gratter l'émulsion à l'arrière de la lame tant qu'elle est encore humide.

Enfin, réaliser une contre-coloration avec du violet de crésyl à 0,3 %, puis déshydrater et monter les lames selon les instructions du protocole écrit, si nécessaire. Retirer soigneusement tout excès d'émulsion sur l'arrière des lames en humidifiant avec de l'eau et en raclant avec une lame de rasoir. Rincer les lames dans une solution d'éthanol à 80 % et essuyer doucement une à deux fois pour éliminer les débris et la poussière.

Prendre des images en éclairage en champ sombre ou en champ clair. Les étapes de raclage et de nettoyage peuvent devoir être répétées deux à trois fois afin d'obtenir de bonnes images sans particules de poussière, facilement visibles en champ sombre au microscope stéréo. Les images suivantes sont des exemples d'autoradiographies d'hybridations in situ provenant de films radiographiques.

Cette image radiographique montre une section sagittale complète de la tête du passereau zébré au dixième jour embryonnaire, hybridée avec une sonde ribo antisense pour Fox P1. Les grains noirs exposés sur le film indiquent l'expression de l'ARN messager, visible dans les quatre régions cérébrales. L'ARN messager de Fox P1 est enrichi dans le mésencéphale, le striatum et le thalamus dorsal ici. L'image radiographique montre une section provenant du même passereau zébré hybridée avec la sonde RIBA de 90 cents pour Cuper.

TF deux Co.TF deux est enrichi dans la région du palatum alii et du thalamus plus ventral. Les images suivantes sont des exemples d'autoradiographies d'hybridations in situ provenant de lames plongées dans une émulsion. Cette image en champ sombre, prise au microscope stéréoscopique, montre une coupe sagittale complète de la tête du moineau zébré au sixième jour après l'éclosion, hybridée avec une sonde ARN antisens pour Fox P un.

Les grains d'argent blancs exposés dans l'émulsion au-dessus du tissu indiquent l'expression de l'ARN messager. La couleur rouge représente la coloration au violet de crésyl. La barre d'échelle représente un millimètre.

Ici, l'image montre une section du même passereau de zébra hybridée avec une sonde riboprobe antisens dirigée contre COOP TF2. Les images suivantes comparent les marquages antisens et sens, qui présentent des profils différents, visibles sur des autoradiographies obtenues par films radiographiques de coupes sagittales de cerveau de passereau de zébra prélevées au 12e jour embryonnaire. La ligne en pointillés indique le contour de l'ensemble du cerveau et la lettre C marque le cervelet.

On peut observer que le brin antisens de PAC six est exprimé dans le cerveau, particulièrement dans la zone ventriculaire. La coupe adjacente hybridée avec le brin sens de pack six ne révèle aucune expression de fond dans la tête de l'embryon, mais une expression apparente dans la couche pigmentaire de la rétine, tout comme le brin antisens. Les images suivantes montrent, en C, deux signaux d'expression génique et des lames recouvertes d'émulsion provenant du cerveau de moineau zébré lors des stades embryonnaires tardifs, observées en champ clair et en champ sombre.

Cette image en champ clair montre l'expression de D one B au dixième jour embryonnaire. À partir d'une exposition normale à l'émulsion, le marquage apparaissant en noir est à peine visible à cet agrandissement. Cette image montre une section identique et le même agrandissement que dans l'image précédente, mais en vue en champ sombre, mettant en évidence le marquage en blanc dans le striatum et le thalamus.

Cette image en champ clair montre l'expression de slit trois au douzième jour embryonnaire. Après une surexposition à l'émulsion, le marquage noir est facilement visible. SC indique la position de la moelle épinière et CB indique la position du cervelet.

Le rostral est orienté vers la gauche. L'image présentée ici correspond à la même section, et l'agrandissement est identique, mais passée en vision champ sombre, montrant une étiquette en blanc dans la moelle épinière qui correspond à l'image en champ clair. Les images suivantes montrent la résolution des grains d'argent au niveau cellulaire.

On observe ici l'hybridation d'un ARN messager de Fox P1 dans le cerveau antérieur du diamant mandarin ; les grains d'argent apparaissent comme des taches noires au-dessus des cellules colorées au violet de crésyl. Cette image montre une expression abondante au niveau de cellules individuelles dans le mésalium du diamant mandarin adulte. Cette image montre une expression faible au niveau de cellules individuelles dans l'alium adjacent de la même section ici.

Bonjour Fox. L'expression de l'ARN messager P1 est observée dans le mésentère au jour embryonnaire 12.

Les cellules embryonnaires visibles ici sont plus petites et plus étroitement compactées par rapport aux cellules adultes observées sur les deux images précédentes. Enfin, cette image montre une expression de faible abondance au niveau des cellules de l'aile adjacente de la même section. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme l'immunochimie, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le type cellulaire sur lequel le gène cible est exprimé.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'hybridation in situ. N'oubliez pas que le travail avec des réactifs radioactifs peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l'utilisation de protections individuelles, doivent toujours être prises durant cette procédure.