Name: Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de létiquetage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Découvrez le profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l'étiquetage chez les plantes de tomate infectées par Pseudomonas syringae. Cette méthode permet d'analyser les protéines régulées par le redox à grande échelle.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Greg Martin (Université Cornell) et son groupe de fournir la souche DC3000, les graines de tomates, et des conseils. Ils aimeraient également remercier le Dr Zhonglin Mou de l&#39;aide avec le protocole DAB et la Division de la protéomique à l&#39;UF Centre interdisciplinaire de recherche en biotechnologie de l&#39;aide dans le développement de la méthode. Le protocole d&#39;extraction de protéines a été modifié à partir de Hurkman et Tanaka 16. Le protocole sur l&#39;étiquetage cysTMT, les étapes 4 à 6 a été adapté en fonction de l&#39;original Thermo Fisher Scientific Pierce produit manuelle 17. Ce travail a été financé par la National Science Foundation (MCB 0818051 à S Chen).

1. Faire pousser des plants et des bactéries Préparation <ol><li> Les semis sont mis à germer dans un mélange Metromix sol 500 (Sociétés institutions de Bretton Woods) dans une chambre de croissance (160 umol photons m -2 s -1 avec une photopériode de 8 heures de lumière à 22 ° C et 16 heures d&#39;obscurité à 20 ° C pendant 1 semaine. Relative l&#39;humidité a été fixé à 70%. Les semis ont été arrosées avec l&#39;eau du robinet au besoin pour garder le sol de se dessécher. </li><li> Deux plants de taille similaire sont ensuite transplantées dans des pots de 4 po de diamètre contenant le Metromix 500 sol et cultivées pendant 3 semaines supplémentaires dans les mêmes conditions que les 1.1. </li><li> Pseudomonas syringae (Pst) est initialement T-strié sur Kings B moyen (KBM) plaques (par litre: 20 g protéose peptone, 0,1975 g MgSO 4, 1% glycérol, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g Agar) et cultivées pendant deux jours à 28 ° C. Une seule colonie est recueilli, mélangé à 300μl Kings liquide B moyen (20 g protéose peptone, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, 10 ml de glycérol, 10 ml de 100x K 2 HPO 4 actions (1,5 g de K 2 HPO 4 dans 10 ml de H 2 O), et étalée sur un plateau B Kings moyen. Ceci est cultivée pendant une nuit à 28 ° C. </li><li> L&#39;inoculum est préparé bactéries en grattant les bactéries cultivées à partir de la plaque KBM dans 20 ml H 2 O. Un DO 600 de 0,03 (~ 10 6 ufc / ml) est préparée dans 1 L de tampon d&#39;inoculation (10 mM MgCl 2 + 400 pi Silwett-70). Tampon d&#39;inoculation des bactéries moins a été préparé pour la solution de contrôle. </li></ol> 2. L&#39;inoculation de tomates avec Pst et H 2 O 2 histochimique Stain <ol><li> Quatre usines semaine anciens ont été inoculées par trempage dans la solution d&#39;ensemencement ci-dessus pendant 30 secondes. Des sacs en plastique ont été mis sur les plantes immédiatement après l&#39;inoculation. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine (DAB) tache 11 a été préparé (1 mg / ml DAB dans H 2 O, pH 3,8 (HCl)) trois days avant utilisation pour obtenir une solubilisation complète. La solution a été secouée pour mélanger à la température ambiante. </li><li> Vingt-quatre heures après le traitement, la feuille pleinement développée a été retiré, placé dans DAB tache côté épidermique en place, et le vide infiltré pendant 15 min. Les feuilles ont ensuite été mis dans le noir à température ambiante pendant la nuit pour la coloration. </li><li> Les feuilles ont été bouillis dans de l&#39;éthanol 95% pendant 10 min, puis conservés dans l&#39;éthanol à 75%. </li></ol> 3. Extraction des protéines <ol><li> Après la récolte, les feuilles de tomates ont été broyés en poudre fine avec de l&#39;azote liquide à l&#39;aide de mortier et un pilon. </li><li> Pour 0,5 g de tissu, ajoutez 1,25 ml de Tris pH 8,8 phénol tamponné et 1,25 ml / 0,5 g de tampon d&#39;extraction (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, EDTA 10 mM, 0,9 M de saccharose) puis continuer de broyage pendant quelques minutes plus dans un hotte. </li><li> Transférer l&#39;extrait dans le tube à centrifuger Oakridge (Thermo Fisher Scientific Nalgene Société) et agiter pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Centrifuger à 5000 xget 15 ° C pendant 10 min. Transférer la phase supérieure de phénol dans un nouveau tube propre. </li><li> Retour-extraire la phase aqueuse avec un volume égal de tampon extrait phénol; agiter sur un agitateur pendant 30 min. Centrifuger et transférer l&#39;extrait dans un nouveau tube Falcon. </li><li> Répétez l&#39;étape ci-dessus une fois de plus et de transférer l&#39;extrait à nouveau Oakridge tube. </li><li> Précipiter phénol protéines extraites en ajoutant 5 volumes de 0,1 M d&#39;acétate d&#39;ammonium dans le méthanol à 100% (stocké à -20 ° C). Vortex et incuber à -20 ° C pour la nuit. </li><li> Recueillir le culot de protéines par centrifugation à 20.000 xg, 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Laver les 2 granulés fois avec de l&#39;acétate d&#39;ammonium 0,1 M froid dans le méthanol et 2 fois avec de l&#39;acétone à froid de 80%. Ajouter 1,5 ml d&#39;éthanol à froid de 70% à granulés et à suspendre. Transférer dans un microtube de 2 mL (États-Unis scientifique) et centrifuger à 14000 rpm, 4 ° C pendant 20 min. Retirer l&#39;éthanol. </li><li> Sécher le culot brièvement dans un concentrateur SpeedVac et dissoudre dans une extr protéinestampon d&#39;action, par exemple des protéines ReadyPrep d&#39;extraction de réactif Kit 3 (8 M d&#39;urée, CHAPS 4%, 40 mM Tris-base, 2 M thiourée) (Bio-Rad). Centrifuger à 14000 rpm et 20 ° C pendant 30 min pour former une pastille. Recueillir le surnageant. </li><li> Mesurer la concentration de protéines en utilisant un dosage de protéines CB-X selon le manuel du fabricant (Geno technologie). </li></ol> 4. Préparation de l&#39;échantillon et l&#39;étiquetage des peptides avec cysTMTs <ol><li> Préparer échantillon de protéine à une concentration de 2-5 mg / mL. Ici, nous utilisons 100 ug de protéines pour chaque marqueur de masse, 20 pl-50 échantillons ul. Pour cette expérience, tous les 6 balises ont été utilisés. </li><li> Ajouter un volume égal de tampon d&#39;alkylation (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM iodoacétamide) pour l&#39;échantillon de protéine de bloquer le groupe thiol libre. Tampon doit être préparé. Alkylation est effectuée à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Précipiter la protéine par addition de 1 ml d&#39;acétone 80% à froid à -20 ° C pendant une nuit. Pellet la protéine par centrifugation à 14.000rpm, 4 ° C pendant 20 min. Laver les 3 granules fois avec de l&#39;acétone 80% vortex à chaque fois. Eliminer le surnageant et laisser l&#39;air tout sec sur la glace. </li><li> Reprendre le culot dans 50 ul de tampon de lyse (6 M d&#39;urée, 50 mM Tris base, EDTA 1 mM). 0,5 pi de 100 mM de Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) est ensuite ajouté pour réduire les liaisons disulfures en incubation pendant une heure à température ambiante. </li><li> Préparer les balises en ajoutant 20 uL d&#39;acétonitrile pour les tubes réactifs pour solubiliser les balises. Vortex et spin vers le bas. </li><li> Laver PTCE en utilisant une Microcon 3Kd dispositif de filtre centrifuge (Millipore). Ajouter un échantillon de 50 ul à Microcon 3Kd colonne, et 50 ul de tampon de lyse à la colonne. Centrifuger pendant 15 min à 10000 xg et 4 ° C. Répétez cette étape pour un total de trois fois. Retirer la colonne et inverser dans un tube propre. Centrifuger pendant 5 min à 1000 xg et 4 ° C. </li><li> Vérifiez le pH. Si nécessaire, ajuster le pH à 7,0 à 8,0 avec 1 M HCl. </li><li> Ajouter 5 pi de l&#39;cysTMRéactif T pour chaque échantillon (Le kit de réactifs cysTMT fournit 20 balises ul pour jusqu&#39;à 500 ug de protéines. Cette méthode utilise 100 g de protéine, donc nous utilisons un cinquième de la balise.). Laisser la réaction se poursuivre pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Les échantillons ont été combinées avec du tampon échantillon de Laemmli (Bio-Rad) dans un rapport 1:1. </li></ol> 5. Retrait de la non-réagi Fractionnement Tag échantillon <ol><li> Les échantillons ont été bouillis pendant 5 min et séparés sur un gel pré-coulé de polyacrylamide à 12% (Bio-Rad). Le gel a été rincé trois fois par intervalles de 5 minutes avec filtre H 2 O et colorées avec du bleu de Coomassie (Bio-Rad) pendant 1 heure. Le gel a été teinté de nuit avec H 2 O. </li><li> Douze fractions ont été recueillies auprès de chaque voie de gel. Les fractions ont été déterminés par des concentrations de bandes protéiques. Les fractions ont été coupés en morceaux de 1 mm et recueilli dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Morceaux de gel étaient de-teinté à l&#39;aide d&#39;acétonitrile 50% et de 0,1 M de bicarbonate d&#39;ammonium dans H 2 </sub&gt; O. Cette étape doit être répétée jusqu&#39;à ce que la couleur bleue est supprimée à partir de morceaux de gel (environ 3-4 fois, à 15 min à chaque fois). </li><li> De morceaux de gel-tachées ont été séchés à l&#39;aide d&#39;acétonitrile 100% (couvrir morceaux de gel) pendant 15 min, le surnageant éliminé, et les morceaux séchés en utilisant un SpeedVac. </li><li> Dissoudre la trypsine (Promega) à 1:10 (la trypsine: protéines) rapport dans le même volume (comme échantillon composite étiqueté) de 25 mM de bicarbonate d&#39;ammonium. Par exemple, 600 g de protéine échantillon avec un volume de 500 ul besoin de 60 mg de trypsine dissous dans 500 ul de 25 mM de bicarbonate d&#39;ammonium. </li><li> Ajouter la solution de trypsine à des morceaux de gel et de mettre sur la glace pour se réhydrater. Si les morceaux ne sont pas couverts ajouter 50 tampon bicarbonate d&#39;ammonium mM. Après réhydratation, incuber à 37 ° C Pour les 12-16 heures. </li><li> Retirer l&#39;extrait protéique liquide à partir des échantillons incubés. </li><li> Arrêter la réaction et de supprimer toute digestion protéique restante en couvrant des morceaux de gel avec de l&#39;acide formique à 5%, 50% d&#39;acétonitrile .. Agiter morceaux de gel pendant 20 min à température ambiante température. Transférer le surnageant dans des tubes extraits des échantillons de protéines de 5,7. Répétez la procédure d&#39;extraction à deux reprises. Sécher les peptides extraits à l&#39;aide de la SpeedVac. </li></ol> 6. Enrichissement de l&#39;échantillon de cysTMT marqués-peptides <ol><li> Ajouter un gradient de l&#39;anti-TMT résine pour tubes de 0,5 mL pour une suspension de 50%. (Gradient a été déterminée à partir de la concentration dans le gel de la bande de fractionnement. Si une collection fraction se compose d&#39;une bande sombre, plus de résine est nécessaire. Fractions les plus faibles avec des bandes exigent moins de résine car il ya moins de protéines.) </li><li> La résine est ensuite lavée trois fois avec un volume de colonne de 1x Tris-solution saline tamponnée (SCT) (25 mM Tris, 0,15 M de NaCl, pH 7,2) (Thermo Scientific Pierce produits de recherche de protéines). </li><li> Ajouter 200 ul 1xTBS à chaque échantillon. Les échantillons sont ensuite ajoutés à l&#39;anti-TMT résine (Thermo Scientific Pierce produits de recherche de protéines) et on agite à température ambiante pendant 2 h puis en basculant une nuit à 4 ° C. </li><li> Ajouter l&#39;échantillon à la colonne (LeRMO scientifiques Produits Pierce recherche sur les protéines). </li><li> Laver chaque colonne trois fois avec 1x 200 ul du SCT. Cette étape est suivie avec lave trois fois avec CHAPs 0,05% (dissous dans 1x SCT). </li><li> La colonne est ensuite lavée trois fois avec 4 M d&#39;urée dans 1x SCT. Deux cents microlitres de H 2 O est ensuite utilisée pour laver les trois colonnes fois. </li><li> Chaque échantillon est élué trois fois avec 200 ul de tampon d&#39;élution de 50% (50% d&#39;acétonitrile, 0,4% de TFA). </li><li> Les échantillons sont ensuite séchés dans un concentrateur sous vide. </li></ol> 7. Spectrométrie de masse <ol><li> Remettre en suspension les échantillons dans 12 uL d&#39;acétonitrile 3% avec de l&#39;acide formique 0,1% et injecter 5 pi directement sur un Eksigent NanoLC-1D colonne de chromatographie liquide haute pression (AB SCIEX, Etats-Unis). </li><li> Peptides sont séparés sur une colonne ID Proteopep II um C18 75 x 20 cm Objectif Nouveau, Etats-Unis) à l&#39;aide d&#39;un gradient 4-60% (R: acétonitrile 3%, 0,1% d&#39;acide formique; B: acétonitrile 97%, 0,1% formique acide)à 3 pl / min pendant 60 min. </li><li> Un Thermo Scientific LTQ XL Orbitrap spectromètre de masse a été utilisée pour détecter des peptides en utilisant un top 2 x 3 expérimentation consistant en une seule étape suivie par MS acquisition de 3 spectres MS / MS avec une plus grande consommation d&#39;énergie C-trap de dissociation (HCD) fragmentation suivie par 3 MS / MS avec dissociation induite par collision (CID) pour l&#39;identification des protéines. Paramètres de ce mode sont les suivantes: largeur d&#39;isolement: 3,0 m / z, l&#39;énergie de la collision: 50% (10% en deux étapes). Seulement peptides doublement et triplement-accusés ont été sélectionnés pour la fragmentation. Paramètres d&#39;exclusion dynamiques ont été mis à: Répétez count = 1; Durée répétition = 60; taille de la liste d&#39;exclusion = 500; Exclusion durée = 28. Les valeurs cibles sont les suivants: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. Temps de transfert d&#39;ions ont été fixés à 500 pour 300 pour FTMS et MS / MS (HCD). Deux microscans ont été nécessaires pour spectres HCD. </li></ol> 8. Recherche base de données et quantification <ol><li> Les données acquises CID et HCD étaient una analysé: à l&#39;aide du logiciel Thermo Scientific Discoverer Proteome 1.2 (Thermo Scientific Pierce produits de recherche de protéines) à travers un flux de travail mis en place un ramifiée qui Reporter Ion Quantizer (20 ppm tolérance de la masse d&#39;ions fragments) afin de quantifier le rapport. Un segment distinct du traitement MS 2 spectres à travers le spectre de sélection, Normalizer spectre, et les nœuds de mérou spectre. </li><li> Les données ont été ensuite recherché contre le moteur de recherche SEQUEST. Une tolérance de 20 ppm en masse a été utilisé. Modifications statiques ont été mis à l&#39;réactif cysTMT (304,18 Da) et les modifications dynamiques inclus phosphorylation et l&#39;oxydation méthionine (15,99 Da). Une base de données personnalisée pour Solanum lycopersicum a été composé à partir d&#39;ARN de données (avec environ 350.000 entrées de l&#39;Université Harvard) 13 a été utilisé dans les deux cas. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Une image représentative d&#39;une feuille de plante témoin de tomate et une feuille de Pseudomonas inoculé estle montre la Figure 1. Une différence entre le contrôle et les feuilles traitées Pseudomonas traités est observée. Après les feuilles sont enlevées et colorées à l&#39;aide DAB, le processus de la coloration permet de la tache histochimique à montrer des signes de ROS dans le tissu végétal (Figure 2). Figure 2A est représentatif d&#39;une feuille de contrôle sans coloration. La figure 2B est représentatif d&#39;une feuille traitée avec une coloration positive pour Pseudomonas et H 2 O 2. Un exemple de données Découvrez Proteome de sortie d&#39;une protéine redox différemment réglementée est illustré à la figure 3. Cette protéine est un connu ferrédoxine-1 redox protéines réglementé 14 et a été montré à jouer un rôle dans la défense contre Pseudomonas syringae pv de tomate 15. Pic d&#39;intensité entre le contrôle et les échantillons inoculés est utilisé pour obtenir une quantification relative, qui a montré des changements significatifs dans ferredoxen-1 régulation redox (p &lt;0,05). Des pics d&#39;intensité élevés suggèrent que cette protéine est oxydée dans la réponse au traitement des agents pathogènes. La figure 4 est un exemple de données Découvrez Proteome sortie d&#39;une protéine qui a même la régulation redox d&#39;une protéine entre un contrôle et échantillon inoculé. Pics d&#39;intensité similaire suggèrent la présence de ponts disulfure pas réglementé par un changement de traitement. La méthode va révolutionner la façon dont les scientifiques à détecter redox des cystéines réactives et des disulfures 10. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Figure 1. Une image représentative de la tomate inoculés laisse avec la solution de contrôle (A) et Pseudomonas (B). &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Figure 2. Une image représentant de coloration DAB de la tomate inoculés laisse avec la solution de contrôle (A) et Pseudomonas (B). Les feuilles ont été colorées à l&#39;aide 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine. La chlorophylle a été retiré de feuilles en faisant bouillir dans de l&#39;éthanol à 95%. Coloration foncée indique la présence de H 2 O 2. Ne laisse que inoculé avec la culture des bactéries ont montré une coloration foncée. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Figure 3. Un exemple de données Découvrez Proteome de sortie de la ferrédoxine-1, protéine régulée différemment redox 14. L&#39;intensité de crête au-dessus de chaque pic est utilisée pour la quantification absolue. Pic d&#39;intensité entre le contrôle et les échantillons inoculés est utilisépour effectuer une quantification relative. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Figure 4. Un exemple de données Découvrez Proteome sortie d&#39;une protéine qui a une intensité de crête similaire entre un contrôle et échantillon inoculé. Pics d&#39;intensité similaire suggèrent la présence de ponts disulfure pas réglementé par un changement de traitement.

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce protocole fournit des informations sur l&#39;exécution de coloration DAB ainsi que la quantification cysTMT étiquetés cystéine redox. Ces procédures sont bénéfiques dans l&#39;examen de la production de ROS ainsi que l&#39;effet sur ​​la régulation des protéines lors de Solanum lycopersicum est inoculé avec Pseudomonas syringae. Les méthodes présentées dans ce protocole constituent un moyen d&#39;examiner ROS dans des échantillons de feuilles entières d&#39;une manière qui cause le moins de dommages aux tissus de la feuille. La procédure d&#39;étiquetage fournit un moyen d&#39;examiner potentiellement redox protéines réglementés en utilisant une méthode de marquage la cystéine. Cela est bénéfique lorsque l&#39;on examine un stade précoce de la réponse au stress. Méthodes comme marqueur d&#39;affinité codé par un isotope (ICAT) et cysTMT peut être utilisé dans l&#39;examen potentiels redox protéines régulées dans des échantillons biologiques. ICAT permet l&#39;étiquetage et la comparaison de deux échantillons 12. Les deux méthodes étiqueter cystéines libres et peut être utilisé pour la protéine quantification 10,12. Cependant, la méthode permet cysTMT pour une diminution de la variation expérimentale ainsi que le multiplexage 10. Le nombre de balises disponibles permet aux chercheurs d&#39;inclure les répliques ou les échantillons multiples dans leur conception expérimentale. Avoir plus d&#39;échantillons fournit le potentiel pour un plus grand nombre de protéines identifiées. Un inconvénient majeur de la technique cysTMT parce qu&#39;elle compromet la qualité globale de l&#39;identification des protéines en raison des mesures d&#39;enrichissement sélectif pour cysTMT marqués (6.5 à 6.6-peptides). Le nombre de peptides pour l&#39;identification des protéines dépend en grande partie sur le nombre de résidus cystéine dans la séquence protéique. Ce problème peut être surmonté en soumettant une partie de l&#39;échantillon avant enrichissement tryptique pour l&#39;identification par spectrométrie de masse des protéines. En raison de la nature de la conception expérimentale ainsi que le mécanisme de l&#39;étiquetage que la méthode cysTMT utilise, certaines étapes sont essentielles. Lors de l&#39;exécution des protéines précisionpitation et le culot de lavage (3,9), il est important de conserver des échantillons dans de la glace pour réduire la dégradation des protéines. Au cours de l&#39;étiquetage cysTMT, l&#39;enlèvement de l&#39;agent réducteur (4,6) est important parce que les échantillons peuvent être soumis à l&#39;étiquetage inverse. L&#39;étiquetage inverse est possible si la réduction de réactif reste dans l&#39;échantillon. Si les échantillons sont réduites après l&#39;étiquetage, la balise cysTMT peut être retiré. Une fois que les étiquettes sont ajoutés aux échantillons, le niveau de pH doit être vérifié (4.7) afin d&#39;avoir une efficacité optimale étiquetage. En outre, l&#39;analyse des données dépend de ce qui est requis du chercheur et le but ultime en utilisant le protocole. Il est également tributaire du logiciel utilisé comme chaque logiciel dispose d&#39;algorithmes différents. Cette expérience utilise des agents pathogènes comme un éliciteur pour la production accrue de réactifs espèces oxydantes dans la tomate, mais d&#39;autres réponses redox réglementés peuvent être évalués en conséquence. Cette conception expérimentale est adaptable à d&#39;autres plantes et systèmes animaux. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Metromix 500 </td><td> Les entreprises des IBW </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep réactif séquentielle kit extraction 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> Dosage de la protéine CB-X </td><td> Geno technologie </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> réactifs cysTMT </td><td> Thermo Scientific Pierce produits de recherche de protéines </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Tampon d&#39;échantillon Laemmli </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250 tache) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3Kd colonne </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Immobilisé Anti-TMT résine </td><td> Thermo Scientific Pierce produits de recherche de protéines </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Colonne Centrifugeuse </td><td> Thermo Scientific Pierce produits de recherche de protéines </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II colonne C18 </td><td> Nouvel Objectif </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ XL Orbitrap </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteome Discoverer 1.2 du logiciel </td><td> Thermo Scientific Pierce produits de recherche de protéines </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Tube Centrifugeuse Oakridge </td><td> Thermo Scientific NalgeSociété ne </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microtube (2ml) </td><td> États-Unis scientifique </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% Mini-PROTEAN TGX préfabriqué Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Haut de Forme &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom du formulaire </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Kit d&#39;enrichissement TMT </td><td> Thermo Scientific Pierce produits de recherche de protéines </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l&#39;étiquetage

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv DC3000 souche. Tomate non seulement provoque la maladie bactérienne chez grain Solanum lycopersicum, mais aussi sur les espèces de Brassica, ainsi que tous les Arabidopsis thaliana, un 1,2 hôte génétiquement traitable plante. L&#39;accumulation d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) dans les cotylédons inoculés avec DC3000 indique un rôle de ROS dans la mort cellulaire nécrotique moduler cours de la maladie grain bactérien de la tomate 3. Le peroxyde d&#39;hydrogène, un composant de ROS, est produite après l&#39;inoculation des plants de tomates avec Pseudomonas 3. Le peroxyde d&#39;hydrogène peut être détectée en utilisant un histochimique tache 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidine (DAB) 4. Coloration DAB réagit avec le peroxyde d&#39;hydrogène pour produire une tache brune sur les 4 tissus de la feuille. ROS a un rôle réglementaire de l&#39;environnement redox cellulaire, qui peut changer l&#39;état d&#39;oxydo-réduction de certaines protéines 5. La cystéine est un acide aminé important sensibles àchangements redox. En vertu de l&#39;oxydation légère, oxydation réversible de groupes cystéine sulfhydryle sert en tant que capteurs et transducteurs de signaux redox qui régissent une variété de processus physiologiques 6,7. De masse en tandem tag (TMT) réactifs permettre l&#39;identification simultanée et multiplexés quantification des protéines dans des échantillons différents en utilisant la spectrométrie de masse 8,9. Les cystéine-réactifs TMT (cysTMT) réactifs permettant l&#39;étiquetage sélectif et quantification relative de la cystéine-contenant des peptides à partir de six échantillons biologiques. Chaque étiquette cysTMT isobare a la masse même parent nominale et est composé d&#39;un groupe sulfhydryle réactif, un bras espaceur MS neutre et d&#39;un rapporteur MS / MS 10. Après l&#39;étiquetage, les échantillons ont été soumis à la digestion de la protéase. Les peptides cystéine-marquées ont été enrichie en utilisant une résine contenant des anticorps anti-TMT anticorps. Au cours de MS / MS, une série d&#39;ions rapporteurs (c.-à-, 126-131 Da) émergent dans la région de faible masse, fournissant des informations sur une quantification relative.Le flux de travail est efficace pour réduire la complexité de l&#39;échantillon, l&#39;amélioration de la plage dynamique et d&#39;étudier les modifications de cystéine. Ici, nous présentons redox analyse protéomique de la tomate Pst DC3000 traités (Rio Grande) laisse en utilisant la technologie cysTMT. Cette méthode à haut débit a le potentiel pour être appliqué à l&#39;étude d&#39;autres redox processus régulés physiologiques.

Réactif niveau de l&#39;espèce d&#39;oxygène est élevé lorsque les cellules rencontrent des conditions de stress. Ici, nous montrons l&#39;exemple de la coloration diaminobenzidine 3&#39;-3 &#39;ainsi que l&#39;étiquetage cysTMT et spectrométrie de masse pour établir le profil du protéome redox dans<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Traités feuilles de tomate.

Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l&#39;étiquetage

La souche DC3000 de Pseudomonas syringae pv. tomato cause non seulement la tache bactérienne chez Solanum lycopersicum, mais aussi chez les espèces de Brassica, ainsi que chez...

L'objectif général de cette expérience est d'observer les effets de Pseudomonas syringae pv. tomato sur les protéines régulées par le statut redox chez les plantes de tomate. Inoculez d'abord les plantes de tomate avec Pseudomonas syringae pv. tomato afin d'induire une infection par le pathogène et la réponse protéique. Procédez ensuite à la coloration au DAB (diaminobenzidine) pour observer les modifications des espèces réactives de l'oxygène.Ensuite, effectuez un marquage des cystéines par TMT afin d'examiner les cystéines régulées par le statut redox dans les protéines. Les résultats obtenus peuvent mesurer les variations entre les échantillons traités et les échantillons témoins. Bonjour, je suis Chen du département de biologie et de la plateforme de protéomique de l'Université de Floride.L'avantage de notre marquage CTMT par rapport aux méthodes existantes, telles que le marquage par finition isotopique, également connu sous le nom d'ASCA, réside dans la possibilité de multiplexer tout en analysant des protéines sensibles au redox à grande échelle. Bien que cette démonstration fournisse des informations sur les protéines régulées par le redox chez la tomate en réponse à une infection par un agent pathogène, l'expérience peut être appliquée à d'autres systèmes tels que joof, souris cu, ainsi qu'à d'autres plantes et au contrôle de conditions de stress. Nous avons eu l'idée de cette méthode après avoir observé des variations marquées entre les expériences ICAD, car seules deux étiquettes sont disponibles.La démonstration par vidéo de cette méthode est essentielle, car les étapes de marquage et d'enrichissement sont difficiles à apprendre. Les variations expérimentales entre échantillons marqués doivent être minimisées, et les régions à réduction doivent être éliminées afin d'assurer un marquage efficace. Commençons. Faites pousser deux semis de tomate transplantés de taille similaire dans des pots de quatre pouces de diamètre pour la culture de l'inoculum.Une pelouse de Pseudomonas syringae sur une plaque KBM. Racler les bactéries dans 20 millilitres d'eau et préparer un inoculum bactérien d'environ 10⁶ unités formant colonies par millilitre. Dans un litre de tampon d'inoculation, immerger les plantes âgées de quatre semaines dans la solution d'inoculation bactérienne pendant 30 secondes.Ensuite, recouvrir immédiatement avec des sacs en plastique transparents. Après le temps d'incubation souhaité, récolter la feuille complètement déployée en plaçant l'épiderme supérieur vers le haut dans un milligramme par millilitre de colorant DAB, puis effectuer une infiltration sous vide pendant 15 minutes. Incuber ensuite les feuilles au noir à température ambiante toute la nuit.Faites maintenant bouillir les feuilles colorées dans de l'éthanol à 95 % pendant 10 minutes et conservez-les dans de l'éthanol à 75 % en utilisant un mortier pour broyer. Réduisez les feuilles récoltées en une poudre fine dans de l'azote liquide. Effectuez ensuite des extractions au phénol comme décrit dans le texte accompagnant.Ensuite, précipitez les protéines extraites au phénol avec cinq volumes d'acétate d'ammonium froid à 0,1 molaire dans du méthanol à 100 %. Récupérez les protéines par centrifugation et effectuez des lavages du culot. Puis, resuspendez les échantillons dans 1,5 millilitre d'éthanol froid à 70 % et transférez-les dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.Après centrifugation, éliminer le surnageant d'éthanol et sécher brièvement le culot dans un speed vac. Après dissolution des échantillons dans un tampon d'extraction protéique dénaturant et centrifugation pour former un culot, récupérer le surnageant, mesurer le surnageant et déterminer la concentration en protéines conformément au manuel du fabricant. Pour chacune des six balises massiques, partir de 100 microgrammes d'échantillon protéique à volume égal de tampon d'alkylation IO 200 millimolaire fraîchement préparé afin de bloquer les groupes thiols libres, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, pour précipiter les protéines, ajouter un millilitre d'acétone froide à 80 % et placer à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit.Centrifuger la protéine pour former un culot et effectuer trois lavages avec de l'acétone à 80 %. Après séchage à l'air des échantillons sur de la glace, resuspendre le culot dans 50 microlitres de tampon de lyse. Ensuite, pour réduire les liaisons disulfure, ajouter 0,5 microlitre de TCEP à 100 millimolaire et incuber pendant une heure à température ambiante.Solubilisez les marqueurs en ajoutant 20 microlitres d'acétonitrile aux tubes de réactif. Vortexez et centrifugez brièvement ensuite pour éliminer l'excès de TCEP. Chargez 50 microlitres d'échantillon sur une colonne MicroCon trois KD. Ajoutez 50 microlitres de tampon de lyse et centrifugez pendant 15 minutes à 10 000 ×g et à 4 degrés Celsius.Pour recueillir l'échantillon, retirez la colonne, retournez-la dans un tube propre et centrifugez. Vérifiez le pH de l'échantillon si nécessaire. Ajustez-le entre un pH de sept et huit à l'aide d'acide chlorhydrique un molaire.Ajoutez cinq microgrammes du réactif TMT pour kyste et incubez la réaction pendant deux heures à température ambiante. Combinez les échantillons, ajoutez un volume égal de tampon d'échantillonnage Laemmli, faites bouillir pendant cinq minutes, puis séparez sur un gel préfabriqué de polyacrylamide à 12 %. Après avoir rincé le gel trois fois avec de l'eau filtrée, colorez avec du bleu de Coomassie pendant une heure et délignez toute la nuit dans l'eau en fonction des concentrations des bandes protéiques. Divisez en 12 fractions par piste de gel. Hachez chaque fraction en morceaux d'un millimètre et placez-les dans un tube de 1,5 millilitre.Retenir complètement les morceaux de gel avec du bicarbonate d'ammonium 0,1 M dans 50 % d'acétonitrile. Recouvrir maintenant les morceaux avec 100 % d'acétonitrile pendant 15 minutes. Éliminer le liquide et sécher les morceaux à l'aide d'un évaporateur sous vide rapide.Ensuite, ajoutez un volume égal de solution de tripsine et placez sur de la glace pour réhydrater. Incubez ensuite à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures pour la digestion triptyque. Ensuite, retirez l'extrait protéique liquide des échantillons incubés.Arrêter la réaction et éliminer tout résidu de protéine digérée en recouvrant les morceaux de gel avec de l'acide formique 5 % et du acétonitrile 50 %. Agiter ensuite les morceaux de gel pendant 20 minutes à température ambiante. Transférer le surnageant dans les tubes d'échantillons de protéines extraites après deux autres extractions.Séchez les échantillons sous vide accéléré dans des tubes de 0,5 millilitre. Préparez une suspension à 50 % de résine anti-TMT dans du TBS à une concentration proportionnelle à l'intensité de la bande protéique respective. Lavez la résine trois fois avec un volume de colonne d'une fois du TBS, puis ajoutez 200 microlitres de TBS à chaque échantillon.Transférez ensuite sur une résine anti-TMT et agitez à température ambiante pendant deux heures, puis laissez osciller toute la nuit à quatre degrés Celsius. Chargez chaque échantillon sur une colonne. Effectuez des lavages de colonne de 200 microlitres chacun.Ensuite, éluer chaque échantillon trois fois avec 200 microlitres de tampon d'élution à 50 % et sécher sous vide. Reese, suspendre les échantillons dans 12 microlitres d'acétonitrile à 3 % contenant de l'acide formique à 0,1 %, puis injecter directement 5 microlitres sur une colonne HPLC. Éluer les peptides à l'aide d'un gradient d'acétonitrile croissant, comme indiqué dans le texte accompagnant.Utilisez la spectrométrie de masse pour détecter des peptides selon un flux de travail en deux étapes par trois. Commencez par une spectrométrie de masse en une seule étape. Ensuite, acquérez trois spectres MS/MS avec une fragmentation par dissociation piégée à haute énergie C suivie de trois autres.Ms.MS avec dissociation par collision pour l'identification des protéines. Analyser les données de spectrométrie de masse à l'aide d'un flux de travail ramifié. Mettre en œuvre un quantificateur à ions marqueurs pour quantifier le rapport.Traitez également le spectre MSM MS à l’aide des nœuds de sélection de spectre, de normalisation de spectre et de regroupement de spectres, puis interrogez les données contre le moteur de recherche Seaquest. Cette image montre des exemples de feuille de plante de tomate témoin à gauche et de feuille inoculée avec Pseudomonas à droite, après coloration des feuilles au DAB. Le processus de coloration par DES permet au colorant histochimique de révéler la présence d'espèces réactives de l'oxygène dans le tissu foliaire.Comme prévu, le témoin ne montre aucune coloration significative, tandis que les feuilles traitées avec Pseudomonas présentent une coloration positive pour la production de peroxyde d'hydrogène. Cet exemple illustre la sortie de données Proteome Discover concernant l'aire des pics d'une protéine régulée de manière différentielle par le statut redox, permettant une quantification absolue pour chaque échantillon. L'aire des pics entre les échantillons témoins et inoculés indique des quantités relatives.Ici, la régulation redox d'une protéine entre un échantillon témoin et un échantillon inoculé est similaire. Des pics d'intensité comparable suggèrent la présence de liaisons dissulfure non régulées par un changement de traitement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être correctement réalisée en une semaine.N'oubliez pas de maintenir les échantillons au froid et de garder les étiquettes bien organisées. Prenez également des précautions lors de l'utilisation du phénol, comme le port de gants résistants aux produits chimiques et le travail sous hotte en suivant cette procédure. D'autres mesures, telles qu'une analyse spécifique par spectrométrie de masse des modifications post-traductionnelles, peuvent être effectuées afin de déterminer d'autres modifications du système, comme l'acide onique et la simulation du gluten.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser la qualification CTMD en position debout DIB, l'activation et le test d'oxydoréduction 16.

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Protéomique quantitative à l&#39;aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

marquage isotopique de précurseur combiné et le marquage isobare (cPILOT) est une stratégie de protéomique quantitative qui améliore les capacités de multiplexage échantillon d'étiquettes isobares. Ce protocole décrit l'application de cPILOT aux tissus à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage.

Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l&#39;aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Nous présentons un protocole d’étiquetage optimisé de l’étiquette de masse en tandem (TMT) qui comprend des informations détaillées pour chacune des étapes suivantes : extraction de protéines, quantification, précipitations, digestion, étiquetage, soumission à une installation de protéomique et analyses de données.

Préparation de l’échantillon TMT pour la soumission des installations de protéomique et l’analyse subséquente des données

Le protocole décrit fournit une analyse protéomique quantitative optimisée des échantillons de tissus à l’aide de deux approches : la quantification basée sur l’étiquette et la quantification sans étiquette. Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines, tandis qu’une approche sans étiquette est plus rentable et utilisée pour analyser des centaines d’échantillons d’une cohorte.

Flux de travail complet de protéomique des échantillons de tissus basée sur la spectrométrie de masse

La méthylation de l’arginine (R) est une modification post-traductionnelle généralisée régulant de multiples voies biologiques. La spectrométrie de masse est la meilleure technologie pour établir le profil global du R-méthyl-protéome, lorsqu’elle est couplée à des approches biochimiques pour l’enrichissement peptidique modifié. Le flux de travail conçu pour l’identification à haut niveau de confiance de la R-méthylation globale dans les cellules humaines est décrit ici.

Une approche protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse globale et à haut niveau de confiance de la R-méthylation des protéines

L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.

Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

Cet article décrit une méthode de préparation d’échantillons basée sur l’inactivation thermique pour préserver les peptides endogènes en évitant la dégradation post-mortem, suivie d’une quantification relative utilisant le marquage isotopique plus LC-MS.

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Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l'étiquetage

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