Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l'étiquetage

L'objectif général de cette expérience est d'observer les effets de Pseudomonas syringae pv. tomato sur les protéines régulées par le statut redox chez les plants de tomate. Inoculez d'abord les plants de tomate avec Pseudomonas syringae pv. tomato afin d'induire une infection par le pathogène et la réponse protéique. Procédez ensuite à la coloration au DAB (diaminobenzidine) pour observer les modifications des espèces réactives de l'oxygène.

Ensuite, effectuez un marquage des kystéines avec le réactif TMT afin d'examiner les kystéines régulées par le statut redox dans les protéines. Les résultats obtenus peuvent mesurer les variations entre les échantillons traités et les échantillons témoins. Bonjour, je suis Chen du département de biologie et de la plateforme de protéomique de l'Université de Floride.

L'avantage de notre marquage CTMT par rapport aux méthodes existantes, telles que le marquage par finition isotopique, également connu sous le nom d'ASCA, réside dans la possibilité de multiplexer tout en analysant des protéines sensibles au redox à grande échelle. Bien que cette démonstration fournisse des informations sur les protéines régulées par le redox chez la tomate en réponse à une infection par un agent pathogène, l'expérience peut être appliquée à d'autres systèmes tels que joof, mice cu, ainsi qu'à d'autres plantes et au contrôle de conditions de stress. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode après avoir observé des variations marquées entre les expériences ICAD, car seules deux étiquettes sont disponibles.

La démonstration par vidéo de cette méthode est essentielle, car les étapes de marquage et d'enrichissement sont difficiles à apprendre. Les variations expérimentales entre échantillons marqués doivent être minimisées, et les régions à réduction doivent être éliminées afin d'assurer un marquage efficace. Commençons. Faites pousser deux semis de tomate transplantés de taille similaire dans des pots de quatre pouces de diamètre pour la culture d'inoculum.

Une pelouse de Pseudomonas syringae sur une plaque KBM. Racler les bactéries dans 20 millilitres d'eau et préparer un inoculum bactérien d'environ 10⁶ unités formant colonies par millilitre. Dans un litre de tampon d'inoculation, immerger les plantes âgées de quatre semaines dans la solution d'inoculation bactérienne pendant 30 secondes.

Ensuite, recouvrir immédiatement avec des sacs en plastique transparents. Après le temps d'incubation souhaité, récolter la feuille complètement déployée en plaçant l'épiderme supérieur vers le haut dans une solution de colorant DAB à un milligramme par millilitre, puis effectuer une infiltration sous vide pendant 15 minutes. Incuber ensuite les feuilles au noir à température ambiante toute la nuit.

Faites maintenant bouillir les feuilles colorées dans de l'éthanol à 95 % pendant 10 minutes et conservez-les dans de l'éthanol à 75 % en utilisant un mortier pour broyer. Réduisez les feuilles récoltées en une fine poudre dans de l'azote liquide. Effectuez ensuite des extractions au phénol comme décrit dans le texte accompagnant.

Ensuite, précipitez les protéines extraites au phénol avec cinq volumes d'acétate d'ammonium froid 0,1 molaire dans du méthanol à 100 %. Récupérez les protéines par centrifugation et effectuez des lavages du culot. Puis, resuspendez les échantillons dans 1,5 millilitre d'éthanol froid à 70 % et transférez-les dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.

Après centrifugation, éliminer le surnageant d'éthanol et sécher brièvement le culot dans un speed vac. Après dissolution des échantillons dans un tampon d'extraction protéique dénaturant et centrifugation pour former un culot, récupérer le surnageant, mesurer le surnageant et déterminer la concentration en protéines conformément au mode d'emploi du fabricant. Pour chacune des six balises massiques, partir de 100 microgrammes d'échantillon protéique à volume égal de tampon d'alkylation IO 200 millimolaire fraîchement préparé afin de bloquer les groupes thiols libres, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, pour précipiter les protéines, ajouter un millilitre d'acétone froide à 80 % et placer à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit.

Centrifuger la protéine pour former un culot et effectuer trois lavages avec de l'acétone à 80 %. Après séchage à l'air des échantillons sur de la glace, resuspendre le culot dans 50 microlitres de tampon de lyse. Ensuite, pour réduire les liaisons disulfure, ajouter 0,5 microlitre de TCEP à 100 millimolaire et incuber pendant une heure à température ambiante.

Solubilisez les marqueurs en ajoutant 20 microlitres d'acétonitrile aux tubes de réactif. Vortexez puis centrifugez brièvement pour éliminer l'excès de TCEP. Chargez 50 microlitres d'échantillon sur une colonne MicroCon trois KD. Ajoutez 50 microlitres de tampon de lyse et centrifugez pendant 15 minutes à 10 000 ×g et à 4 °C.

Pour recueillir l'échantillon, retirez la colonne, retournez-la dans un tube propre et centrifugez. Vérifiez le pH de l'échantillon si nécessaire. Ajustez-le entre un pH de sept et huit à l'aide d'acide chlorhydrique un molaire.

Ajoutez cinq microgrammes du réactif TMT pour les cystéines et incubez la réaction pendant deux heures à température ambiante. Combinez les échantillons, ajoutez un volume égal de tampon d'échantillonnage Laemmli, faites bouillir pendant cinq minutes, puis séparez sur un gel préfabriqué de polyacrylamide à 12 %. Après avoir rincé le gel trois fois avec de l'eau filtrée, colorez avec du bleu de Kumasi pendant une heure et délignez toute la nuit dans l'eau en fonction des concentrations des bandes protéiques. Divisez en 12 fractions par piste de gel. Hachez chaque fraction en morceaux d'un millimètre et placez-les dans un tube de 1,5 millilitre.

Immobilisez complètement les morceaux de gel avec du bicarbonate d'ammonium 0,1 M dans 50 % d'acétonitrile. Recouvrez maintenant les morceaux d'acétonitrile à 100 % pendant 15 minutes. Éliminez le liquide et séchez les morceaux à l'aide d'un évaporateur sous vide rapide.

Ensuite, ajoutez un volume égal de solution de tripsine et placez sur de la glace pour réhydrater. Incubez ensuite à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures pour la digestion triptyque. Ensuite, retirez l'extrait protéique liquide des échantillons incubés.

Arrêter la réaction et éliminer tout résidu de protéine digérée en recouvrant les morceaux de gel avec de l'acide formique à 5 % et du acétonitrile à 50 %. Puis agiter les morceaux de gel pendant 20 minutes à température ambiante. Transférer le surnageant dans les tubes d'échantillons de protéines extraites après deux autres extractions.

Séchez les échantillons sous vide accéléré dans des tubes de 0,5 millilitre. Préparez une suspension à 50 % de résine anti-TMT dans du TBS à une concentration proportionnelle à l'intensité de la bande protéique respective. Lavez la résine trois fois avec un volume de colonne de TBS 1X, puis ajoutez 200 microlitres de TBS à chaque échantillon.

Transférez ensuite sur une résine anti-TMT et agitez à température ambiante pendant deux heures, puis laissez agiter doucement toute la nuit à quatre degrés Celsius. Chargez chaque échantillon sur une colonne. Effectuez des lavages de colonne de 200 microlitres chacun.

Ensuite, éluer chaque échantillon trois fois avec 200 microlitres de tampon d'élution à 50 % et sécher sous vide. Reese, suspendre les échantillons dans 12 microlitres d'acétonitrile à 3 % contenant 0,1 % d'acide formique et injecter directement 5 microlitres sur une colonne HPLC. Éluer les peptides à l'aide d'un gradient d'acétonitrile croissant, comme indiqué dans le texte accompagnant.

Utilisez la spectrométrie de masse pour détecter des peptides selon un flux de travail « top two by three ». Commencez par une spectrométrie de masse en une seule étape. Ensuite, acquérez trois spectres MS/MS avec une fragmentation par dissociation piégée à haute énergie C suivie de trois autres.

Ms.MS avec dissociation par collision pour l'identification des protéines. Analyser les données de spectrométrie de masse à l'aide d'un flux de travail ramifié. Mettre en œuvre un quantificateur à ions marqueurs pour quantifier le rapport.

Traitez également le spectre MS de la MSM à l’aide des nœuds de sélection de spectre, de normalisation de spectre et de regroupement de spectres, puis interrogez les données contre le moteur de recherche Seaquest. Cette image montre des exemples de feuille de plante de tomate témoin à gauche et de feuille inoculée avec Pseudomonas à droite, après coloration des feuilles au DAB. Le processus de coloration au DES permet au colorant histochimique de révéler la présence d'espèces réactives de l'oxygène dans le tissu foliaire.

Comme prévu, le témoin ne montre aucune coloration significative, tandis que les feuilles traitées avec *Pseudomonas* présentent une coloration positive pour la production de peroxyde d'hydrogène. Cet exemple illustre les données de sortie de Proteome Discover concernant l'aire des pics protéiques différentiellement régulés au niveau redox pour chaque échantillon, permettant une quantification absolue. L'aire des pics entre les échantillons témoins et inoculés indique les quantités relatives.

Ici, la régulation redox d'une protéine entre un échantillon témoin et un échantillon inoculé est similaire. Des pics d'intensité comparable suggèrent la présence de liaisons dissulfure non régulées par un changement de traitement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être correctement réalisée en une semaine.

N'oubliez pas de maintenir les échantillons au froid et de garder les étiquettes bien organisées. Prenez également des précautions lors de l'utilisation du phénol, comme le port de gants résistants aux produits chimiques et de travailler sous hotte en suivant cette procédure. D'autres analyses, telles que la spectrométrie de masse spécifique des modifications post-traductionnelles, peuvent être réalisées afin de déterminer d'autres modifications du système, comme l'acide onique et la stimulation du gluten.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer la qualification CTMD en position debout DIB, l'activation et le test redox 16.