Spatio-temporelle de manipulation de l'activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Cette vidéo montre une méthode dans laquelle la lumière UV est utilisée pour manipuler l’activité d’une protéine au niveau de la membrane plasmique. Pour ce faire, les cellules sont transfectées avec la protéine FRB ancrée membranairement et la protéine fusionnée FK BP d’intérêt. Un dérivé de la rapamycine en cage photo est ajouté au support.

Ensuite, lors de l’imagerie de cellules vivantes, la lumière UV est appliquée à une région spécifique de la cellule. L’agent de liaison entre la rapamycine et la biotine est un dimériseur chimique clivé libérant et son sous-produit, le dimériseur libéré, diffuse dans les cellules et induit une dimérisation entre la protéine d’intérêt marquée FKBP et le FRB ancré dans la membrane plasmique dans la région irradiée. Sans le rayonnement UV, le FKBP et le FRB ne s’associent pas, ne produisant donc aucun effet.

L’analyse des données révèle un recrutement très localisé de la protéine fusionnée FKBP d’intérêt en fonction de son effet physiologique. L’avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la pharmacologie et l’approche génétique, est la combinaison de la vitesse d’action, de la spécificité de la cible et de la résolution spatiale. Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer métastatique est une conséquence de la migration par les cellules cancéreuses.

Par conséquent, la manipulation de l’activité des facteurs clés de migration peut révéler son mécanisme moléculaire précis, qui est une condition préalable à son traitement et à sa guérison. Chris Paul Meyer, un étudiant diplômé, et Bob de Rose, un technicien de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez ce protocole en combinant les éléments suivants dans un microtube à centrifuger stérile : plasmide, ADN, membrane FRB attachée FKBP marquée par fluorescence, TIA un et eau déminéralisée, ajoutez un microlitre, quelques gènes HD au mélange et vortex.

Incuber le tube à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant l’incubation, ajoutez 50 microlitres de poly de lycine dans chaque puits d’une chambre en verre à huit puits et incubez pendant une minute pour recouvrir la surface, puis aspirez la solution et lavez le centre de chaque puits avec 50 d’eau déminéralisée. Ensuite, la trypsine est composée de 80 à 85 % de cellules NIH trois T, trois cellules.

Une fois les cellules détachées, ajoutez 10 millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS, transférez 375 microlitres de la suspension dans un tube stérile de 15 millilitres et centrifugez à 1 500 g pendant trois minutes. Après l’essorage, aspirez soigneusement le fluide. Ajouter 750 microlitres de DMEM avec 10 %FVS et Resus.

Suspendez la pastille en la pipetant doucement de haut en bas plusieurs fois. Enfin, ajoutez la suspension cellulaire à la solution de transfection et, à l’aide de la pointe de la pipette, ajoutez doucement 250 microlitres de suspension de transfection cellulaire dans chaque puits de la chambre. Glissez-le et incubez-le.

37 degrés Celsius pendant 15 à 18 heures. Pour synthétiser la rapamycine en cage, l’adduit à la biotine. Commencez par préparer une solution mère d’un millimolaire de CRB dans du DMSO dans un tube de fuge stérile dans un microtube à centrifuger séparé de 1,5 millilitre et dissolvez un milligramme d’avadon dans 250 microlitres de PBS.

Ensuite, pour conjuguer la fraction cage à la rapamycine. Ajoutez 0,5 microlitre de la solution mère de CRB à l’AVID dissous mélangé en le retournant plusieurs fois, puis incubé à température ambiante pendant 15 minutes. Pour produire CRB AVID en solution conjuguée afin d’exclure les petites molécules non liées et de purifier l’équilibre CRBA une colonne d’exclusion de taille G 25 avec 300 microlitres de PBS.

Répétez l’opération cinq fois une fois que la colonne s’est équilibrée. Chargez 125 microlitres de solution CRBA sur le lit central de la colonne. Ensuite, faites tourner la solution pendant deux minutes à 800 G À température ambiante, recueillez le débit dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre après la transfection des cellules.

Remplacez le milieu par du DMEM sans FBS pour affamer le sérum, les cellules incubent pendant 12 heures. Après l’incubation, aspirez doucement le milieu et ajoutez 250 microlitres de la solution CRBA préparée à un micromolaire. Ensuite, pour visualiser la dynamique des protéines dans les cellules vivantes, utilisez un microscope confocal à disque rotatif avec éclairage UV pour coupler l’optique de la lumière LED UV à 365 nanomètres.

Avec lumière de fluorescence épi. Définissez les coordonnées et la taille d’un point d’éclairage à l’aide d’une plaque de verre recouverte de colorants fluorescents excités par la lumière UV. Cela permet un réglage précis de la zone à irradier.

Placez la lame de chambre avec les cellules sur la platine à l’aide d’un objectif 100 x et d’une épifluorescence. Mettez les cellules au point et trouvez une cellule. Pour l’imagerie, commencez à imager les cellules après avoir déterminé les niveaux de fond de l’effet physiologique.

Ici, le bourrelet de la membrane est mesuré irradier la lumière UV dans un quadrant choisi de la cellule, se dissoudre sans cage, donc la rapamycine originale dans le DMSO puis dans le PBS jusqu’à une concentration finale de 400 nanomolaires. Ajoutez 100 microlitres de la solution dans la chambre d’imagerie pour induire des effets globaux. Capturez des images de fluorescence toutes les 15 secondes pendant 20 minutes pour déterminer si l’activation localisée de RAC peut induire la formation locale de volants.

Trois cellules T 3 du NIH ont été transfectées avec l’activateur RAC FK bp, TIA one et LDR, qui est une membrane ancrée. L’irradiation localisée du FRB au bord de la cellule, indiquée par le cercle jaune, a été suivie d’une illumination globale avec une lampe au mercure pendant une seconde à partir de 1063 secondes. Comme on peut le voir ici, il n’y avait presque pas de froissures membranaires au début.

Cependant, après une illumination localisée, un bourdonnement spatialement confiné a été observé après l’illumination globale et l’ajout de rapamycine, ce qui provoque la translocation de FK bp TIA one vers la membrane plasmique. La cellule a montré une formation globale de volants, indiquant que la formation locale de volants précédemment observée était causée par l’activation spatialement confinée du rack. Pour une analyse quantitative, les cellules cibles ont été divisées en quatre quadrants et la fréquence de formation de volants dans chaque quadrant lors de la stimulation locale et globale suivante a été déterminée, comme le montre ce graphique.

Aucune des cellules observées n’a montré de formation de volants avec CRBA sans rayonnement UVE ou UVE local, un rayonnement avec ou sans Aden en milieu massif. Cependant, lorsque le CRBA a été ajouté et que l’irradiation UV a été effectuée, la formation de volants a été observée à peu près la même, environ 90 % dans tous les quadrants avec un rayonnement global lorsque seul le premier quadrant a été irradié, la fréquence de formation des volants était de 100 % contre 30%25 % et 30 % dans les quadrants deux à quatre. Ces résultats indiquent que la décage localisé de la rapamycine peut être utilisé pour induire des effets physiologiques hautement localisés dans une seule cellule.

Dans ce cas, l’ébouriffement de la membrane causé par l’activation de la crémaillère. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir un contrôle temporel spatial de l’activité des petits g TPA par la lumière. Cette méthode pourrait être appliquée à tout processus physiologique dépendant de la translocation de protéines spécifiques dans la membrane plasmique.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer fraîchement les solutions, les réactifs et les cellules pour chaque procédure. N’oubliez pas que travailler avec la lumière UV peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des lunettes UV doivent toujours être portées.