Name: Spatio-temporelle de manipulation de lactivité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Découvrez une méthode de contrôle spatio-temporel de l'activité des petites GTPases par la lumière UV. Cette technique utilise la photo-décage de la rapamycine pour induire une hétérodimérisation FKBP-FRB ciblée au niveau subcellulaire dans les cellules vivantes.

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Cette étude a été financée par le NIH financement de la recherche (DK090868 et GM092930 à TI). Il ya une attente de brevet sur un analogue de la rapamycine en cage.

1. La transfection de l&#39;ADN plasmidique <ol><li> Ajouter ADN plasmidiques, 0,5 ug membrane captif FRB (ci-après dénommé LDR) et 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cell invasion lymphome et les métastases induisant la protéine 1: Rac activateur) marqué avec la protéine fluorescente à 37,5 pi dH 2 O. Ajouter 1 ul FuGENE HD. </li><li> Vortex et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant ce temps, procéder aux étapes 1,3-1,8. </li><li> Laver chaque puits d&#39;une chambre de 8 puits avec 50 pl de poly-D-Lysine. </li><li> Laver le centre de chaque puits avec dH 2 O. </li><li> Trypsiniser 80-85% confluentes cellules NIH-3T3 et diluer à 10 ml du milieu de culture (DMEM avec 10% de FBS). </li><li> Retirer 375 ul de la suspension et centrifuger à 1750 rpm pendant 3 minutes. </li><li> Aspirer les médias, en faisant attention de ne pas perturber le culot. </li><li> Ajouter 750 ul de FBS DMEM w / 10% et remettre en suspension. </li><li> Ajouter suspension cellulaire à dH 2 O / ADN / FuGENE HD solution et mélanger doucement. </li><li> Ajouter 250ul de cellules / ADN de suspension dans chaque puits (remplira jusqu&#39;à 3 puits). </li><li> Incuber les cellules transfectées à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 15-18 h. </li></ol> 2. Préparation de la CRB-Une Solution <ol><li> Synthétiser en cage rapamycine-biotine adduit (CRB). Voir «schéma de synthèse du CRB&quot; pour plus de détails. Brièvement, des fragments de cages et de la biotine sont préparés séparément. Le fragment cage est ensuite conjugué à la rapamycine (CL laboratoire), le produit ensuite couplé à la fraction biotine par un moyen de réaction 7 clic pour donner CRB. </li><li> Préparer une solution à 1 uM de stock du CRB dans le DMSO. </li><li> Dissoudre 1 mg d&#39;avidine dans 250 ul de PBS dans un tube de 0,5 ml Eppendorf. </li><li> Ajouter 1 ml de solution stock de CEM pour l&#39;avidine dissous. Mélanger en retournant plusieurs fois. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 15 min pour obtenir CRB-avidine conjugué (CRB-A) Solution. </li><li> Exclure les petites molécules non liées et purifier CRB-A. En utilisant une colonne d&#39;exclusion de taille </li></ol> 3. Microscopie et un éclairage en lumière au niveau subcellulaire <ol><li> Sérum affamer les cellules transfectées dans du DMEM sans SVF pendant 12 heures. </li><li> Aspirer doucement les médias hors des cellules et ajouter 250 microlitres de la préparation 400 nM CRB-Une solution (de l&#39;étape 2.6). </li><li> Pour visualiser la dynamique des protéines dans les cellules vivantes à la résolution subcellulaire avant et après traitement par la lumière, la microscopie disque de rotation a été utilisé (Figure 2a). Illumination UV a été réalisée par couplage optique pour la lumière LED UV (365 nm) avec l&#39;épi-fluorescence en lumière (Figure 2b). </li><li> MetaMorph logiciel a été utilisé pour capturer des images de fluorescence des cellules transfectées toutes les 15 secondes. </li><li> Définir les coordonnées et la taille d&#39;un point d&#39;illumination en utilisant une plaque de verre revêtue avec des colorants fluorescents excités par la lumière UV. La taille peutfaire varier en appliquant lentille d&#39;objectif avec des grossissements différents et en sélectionnant des fibres optiques avec la taille de base différente. </li><li> Après la détermination des niveaux de fond de fronçage membrane, la lumière UV irradient à la périphérie de cellules. Les deux étapes suivantes sont à contraster précédant effets localisés. </li><li> Globalement irradier des cellules avec de la lumière à 365 nm fournie par une lampe à mercure. </li><li> Dissoudre Uncaged, ainsi rapamycine origine dans le DMSO, puis dans du PBS (400 nM final), et ajouter la solution à la chambre de l&#39;imagerie d&#39;induire des effets globaux. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Un exemple de résultats représentatifs est illustré à la figure 3. Irradiation de lumière UV à une petite région près d&#39;un bord cellulaire induit rapidement la formation de volants localisée que dans et à proximité de la zone irradiée. Pour confirmer qu&#39;il s&#39;agissait effectivement d&#39;une activité locale, nous avons alors le monde irradié des cellules avec des UV, ou ajouté rapamycine aux médias en vrac, à la fois de la WHIch induit la formation tout au long de volant mondiale de la membrane. Pour une analyse quantitative, nous avons divisé les cellules cibles en quatre quadrants, et a compté la fréquence de formation volants dans chaque quadrant sur locale ainsi que suite à une stimulation globale dans diverses conditions, y compris les contrôles (Figure 4). Ce n&#39;est que cette combinaison de l&#39;irradiation UV, CRB-A, et appropriées FKBP-FRB constructions qui induit fronçage locale. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de la dimérisation des protéines dans l&#39;espace confiné à l&#39;aide en cage rapamycine-avidine conjugué (CRB-A) et de la lumière UV. Irradiation UV clive la liaison entre la rapamycine et de la biotine, entraînant la libération de produits chimiques de dimérisation (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroxyethyl) rapamycine) et son sous-produit. La dimérisation publié diffuse ensuite dans les cellules et induit la dimérisation entre FKBP-POI (protéine d&#39;intérêt) et le plasma membrane ancré FRB que dans la proximité de la région irradiée (cercle bleu). Sans l&#39;irradiation UV, FKBP et FRB n&#39;associent pas (croix rouge), donc ne produisant aucun effet. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> Figure 2. Image du microscope personnalisé confocale de fluorescence. (A) Vue de face du microscope confocal (inversé Axiovert 200, Zeiss). (B) Close-up, vue de dessus d&#39;une unité de couplage pour le PEV de fluorescence et d&#39;illumination UV. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> Figure 3. Formation volants spatialement confinée dans un transfectée NIH3T3 cellulaire induite par une irradiation UV localisée. Confocale de fluorescence images d&#39;un cellulaire de fibroblastes NIH3T3 qui est transfectée avec YFP-étiqueté FKBP-Tiam1 (Rac activateur) et LDR (membrane ancrée FRB) a subi une irradiation dans un espace confiné près de son bord avec LED lumière à 365 nm pour 15 secondes à partir de 210 sec en présence d&#39;CRb-Conjugué dans les supports en vrac. Ce traitement a été suivi par l&#39;illumination globale avec lampe au mercure pour 1 sec à 1063 sec plus et globale de la rapamycine finales 400 nM à 1560 sec. La cellule a montré presque aucune activité ébouriffant au début (a), mais a montré dans l&#39;espace confiné ébouriffant après l&#39;illumination localisée (cercle jaune) (b). La cellule a montré la formation de volant mondiale après l&#39;illumination globale et l&#39;ajout de la rapamycine (cd), indiquant que la formation locale a été volants provoquée par l&#39;activation dans l&#39;espace confiné de Rac. La barre d&#39;échelle: 10 um. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> Figure 4. Fréquence de la formation volants dans les quadrants de cellules NIH3T3 transfectées. Irradiation UV locale CRB-A et après irradiation UV mondiale ont été réalisées sur 13 cellules. CRB-A </sTrong outre&gt; (pas d&#39;irradiation UV), une irradiation UV locale avec ou sans l&#39;avidine ont été mis en oeuvre sur des cellules 13, 5 et 6, respectivement. Aucune des cellules observées ont montré la formation de volant CRB-A sans irradiation UV, ou l&#39;irradiation UV locale avec ou sans l&#39;avidine dans les médias en vrac. Nous avons recueilli des données à partir de cellules avec la formation de fond volant bas, mais qui a la capacité de la rapamycine induit la formation de volant, ce qui nous avons vérifié après chaque expérience en confirmant la formation volants mondiale en tant que résultat de l&#39;addition de la rapamycine (finales 400 nM). Ces résultats ont montré que CRB-A et l&#39;irradiation UV locale sont nécessaires pour la formation locale volant dans les cellules. (Copyright @ ACS2011) 6 Abréviations: FKBP: FK506-binding protein FRB: FKBP-rapamycine-binding protein Tiam1: T-cell invasion lymphome et les métastases induisant protein 1 (Rac FEM) LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: N-terminales 11 acides aminés de Lyn kinase) HE-Rapa: C40-O - (2-hydroxyéthyl) rapamycine CRB: la rapamycine en cage avec fragment de biotine CRB-A: CRB conjugué à l&#39;avidine

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<li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns%284%2C5%29P2+gate+KCNQ+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li>
<li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons décrit une technique qui emploie un roman composé en cage avec le système hétérodimérisation FKBP-FRB afin de manipuler Rho GTPase activité à un endroit précis sur une échelle subcellulaire de temps en secondes. Il ya trois limites de l&#39;approche actuelle. Tout d&#39;abord, parce que la méthode est basée sur la prévention ou permettant la diffusion des dimérisation travers la membrane plasmique, l&#39;emplacement cible cellulaire doit être la membrane plasmique ou dans ses envi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / équipements </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La rapamycine </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidine </td><td> Sigma </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Taille-exclusion colonne </td><td> GE Healthcare </td><td> Piège Spin G-25 </td></tr><tr><td> À fond de verre de 8 puits de chambre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Microscope inversé à fluorescence </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> LED UV source de lumière </td><td> Rapp Opto Electronics </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Confocale disque en rotation </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100x l `objectif </td><td> Zeiss </td><td> Plan Apochromat </td></tr></tbody></table> Schéma de synthèse du CRB (droit d&#39;auteur ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Schéma 1" /></a> Les conditions de synthèse: (a) BnBr, K 2 CO 3, du DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargyl-Br, K 2 CO 3, du DMF, (e) glycérol, le chat. pTSA, toluène (f) NaBH 3 CN, TiCl 4, MeCN (g) Tf 2 O, pyridin méthanol (h) HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, pyridine, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, ascorbate, le 2-propanol, H 2 O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporelle de manipulation de l&#39;activité gtpase petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Régulation dynamique de la famille Rho guanosine triphosphatases petites GTPases) avec une précision spatio-temporelle est grande essentiels pour diverses fonctions cellulaires et des événements 1, 2. Leur nature spatio-temporelle dynamique a été révélé par la visualisation de leur activité et la localisation en 3 temps réel. Afin d&#39;obtenir une meilleure compréhension de leurs rôles dans diverses fonctions cellulaires au niveau moléculaire, la prochaine étape devrait être la perturbation des activités de protéines à un endroit précis subcellulaire et le calendrier. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé une méthode pour induite par la lumière, spatio-temporellement activation contrôlée de petites GTPases en combinant deux techniques: (1) rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et (2) une méthode de photo-mise en cage de la rapamycine. Avec l&#39;utilisation de la rapamycine-FKBP-FRB médiation hétérodimérisation, nous avons développé une méthode pour rapidement inductible activation ou l&#39;inactivation des petites GTPases including Rac 4, Cdc42 4, 4 RhoA et Ras 5, dans lequel la rapamycine induit la translocation de la FKBP-condensés, ou leurs GTPases activateurs, à la membrane plasmique, où FRB est ancré. Pour le couplage avec ce système hétérodimérisation, nous avons également développé un système de photo-mise en cage de la rapamycine analogues. Un composé photo-cage est une petite molécule dont l&#39;activité est supprimée avec un groupe photoclivable protéger connu sous le nom d&#39;un groupe de mise en cage. Pour supprimer l&#39;activité hétérodimérisation complètement, nous avons conçu une rapamycine en cage qui est attaché à une macromolécule de telle sorte que le complexe résultant grande ne peut pas traverser la membrane plasmique, ce qui conduit à pratiquement aucune activité de fond comme une dimérisation chimique à l&#39;intérieur des cellules 6. Figure 1 illustre un schéma de notre système. Avec la combinaison de ces deux systèmes, nous recrutés localement un activateur de Rac à la membrane plasmique sur une échelle de temps de quelques secondes et atteint induite par la lumière d&#39;activation Rac à la subcellulaire level 6.

Procédé pour spatio-temporel de commande de l&#39;activité GTPase de petite par la lumière est décrite. Cette méthode est basée sur la rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et photo-cages systèmes. Optimisation de la lumière-l&#39;irradiation permet l&#39;activation spatio-temporellement contrôlée de petites GTPases au niveau subcellulaire.

Spatio-temporelle de manipulation de l&#39;activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

La régulation dynamique de la famille des petites guanosine triphosphatases (GTPases) Rho avec une grande précision spatiotemporelle est essentielle pour divers processus cellulaires...

Ce vidéo montre une méthode dans laquelle la lumière UV est utilisée pour contrôler l'activité d'une protéine au niveau de la membrane plasmique. Pour ce faire, les cellules sont cotransfectées avec une protéine FRB ancrée à la membrane et la protéine d'intérêt fusionnée à FK BP. Un dérivé de la rapamycine photo-capturée est ajouté au milieu.Ensuite, lors de l’imagerie de cellules vivantes, une lumière UV est appliquée à une région spécifique de la cellule. Le lien entre la rapamycine et la biotine est clivé, libérant le dimérisateur chimique ainsi que son sous-produit ; le dimérisateur libéré diffuse dans les cellules et induit la dimérisation entre la protéine cible marquée par FKBP et la FRB ancrée à la membrane plasmique dans la région irradiée. En l’absence de rayonnement UV, FKBP et FRB ne s’associent pas, n’entraînant ainsi aucun effet.L'analyse des données révèle un recrutement hautement localisé de la protéine d'intérêt fusionnée à FKBP, basé sur son effet physiologique. L'avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les approches pharmacologiques et génétiques réside dans la combinaison de la rapidité d'action, de la spécificité ciblée et de

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Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

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Récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum</em

La levure de fission, Schizosaccharomyces pombe est un excellent modèle pour étudier la cytocinèse, la dernière étape de la division cellulaire. Nous décrivons ici une approche de microscopie pour analyser différents événements cytokinétique dans des cellules vivantes de levure fission.

Analyse spatiotemporelle des cytokinétique événements dans la levure de Fission

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Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la prénylation et la guanosine-5'-triphosphate (GTP)-chargement de la Rho GTPase. Ce protocole comprend deux méthodes détaillées, à savoir fractionnement membrane et une GTPase-immuno assay. Le protocole peut être utilisé pour mesurer la prénylation et la GTP chargement de différentes autres petites GTPases.

Détection des petits GTPase prénylation et GTP Binding utilisant le fractionnement Membrane et GTPase-linked Immunosorbent Assay

Interactions protéines-protéines sont essentielles pour les systèmes biologiques, et des études de la cinétique de liaison donnent un aperçu de la dynamique et la fonction de complexes protéiques. Les auteurs décrivent une méthode qui quantifie les paramètres cinétiques d’une protéine complexe à l’aide de transfert d’énergie de fluorescence par résonance et la technique de flux stoppé.

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Présenté ici est un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes de super-résolution dans le tissu intact. Nous avons normalisé les conditions d’imagerie d’une population de cellules souches adultes très sensibles dans son environnement tissulaire natif. Cette technique consiste à équilibrer la résolution temporelle et spatiale pour permettre l’observation directe des phénomènes biologiques dans les tissus vivants.

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

Les inhibiteurs typiques des microtubules, largement utilisés dans la recherche fondamentale et appliquée, ont des effets de grande portée sur les cellules. Récemment, les photostatines sont apparues comme une classe d’inhibiteurs de microtubules photoscommutables, capables de manipulation instantanée, réversible et spatio-temporelle précise des microtubules. Ce protocole étape par étape détaille l’application de photostatines dans un embryon de souris préimplantatoire vivant en 3D.

Manipulation subcellulaire spatio-temporelle du cytosquelette de microtubules dans l’embryon de souris préimplantatoire vivant à l’aide de photostatines

Ici, un essai de reconstitution in vitro basé sur la microscopie TIRF est présenté pour quantifier et comparer simultanément la dynamique de deux populations de microtubules. Une méthode est décrite pour visualiser simultanément l’activité collective de plusieurs protéines associées aux microtubules sur des faisceaux de microtubules réticulés et des microtubules simples.

Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Ce protocole décrit l’application d’un domaine d’interrupteur allostérique activé par la lumière bleue (LightR) pour un contrôle spatio-temporel réversible de l’activité protéique. En utilisant la tyrosine kinase Src comme modèle, cette étude propose un protocole élaboré pour développer et caractériser la Src régulée par la lumière (LightR-Src). Il démontre la polyvalence de cette approche dans toutes les classes d’enzymes.

Contrôle spatio-temporel de l’activité des protéines par la régulation allostérique optogénétique

Les fonctions des protéines de la superfamille des dynamines dépendent des changements de conformation couplés à l’hydrolyse des GTP. Un système est décrit à l’aide de la technique FRET à molécule unique (smFRET) pour surveiller la dynamique conformationnelle de l’atlastine GTPase de type dynamine dans différents états de charge nucléotidique.

Imagerie FRET à molécule unique pour l’observation de la dynamique conformationnelle de l’atlastine GTPase de type dynamine

Découvrez une méthode de contrôle spatio-temporel de l'activité des petites GTPases par la lumière UV. Cette technique utilise la photo-décage de la rapamycine pour induire une hétérodimérisation FKBP-FRB ciblée au niveau subcellulaire dans les cellules vivantes.

Spatio-temporelle de manipulation de lactivité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal

Spatio-temporelle de manipulation de l'activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

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