Vecteurs d'ingénierie et de l'évolution de la synthèse Adeno-Associated Virus (AAV) thérapie génique par la famille de réarrangement d'ADN

L'objectif général de l'expérience suivante est de créer une bibliothèque très diversifiée de capsides virales synthétiques associées aux adénovirus, à partir de laquelle des particules possédant une propriété souhaitée peuvent être sélectionnées. Cette étape est réalisée en fragmentant d'abord, en clonant et en sélectionnant des gènes de capsides d'AAV par une digestion contrôlée de l'ADN à l'aide d'une enzyme de restriction, afin de permettre leur réassemblage ultérieur en séquences chimériques grâce à deux réactions de PCR. Dans un deuxième temps, le produit de PCR obtenu est réinséré par clonage dans un vecteur d'AAV compétent pour la réplication, afin de produire une bibliothèque de plasmides comprenant au moins 1 million de gènes de capsides d'AAV différents.

Ensuite, cette bibliothèque de plasmides est transféctée dans des cellules 2 9 3 T, conjointement avec un plasmide auxiliaire d'adénovirus afin de produire une bibliothèque de virus chimériques qui peut ensuite être sélectionnée sur des cellules cibles ou chez des animaux. Les résultats montrent l'ingénierie moléculaire réussie et l'évolution de nouveaux vecteurs synthétiques A A V, basés sur une expression améliorée ou plus spécifique d'un gène rapporteur dans des cellules en culture ou chez des souris adultes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'affichage de peptides réside dans le fait que le brassage génétique familial peut modifier et améliorer simultanément plusieurs caractéristiques de la capside du virus A, allant de la liaison à la cellule et du trafic intracellulaire jusqu'à la décapsidation et à l'expression génique dans le noyau.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la thérapie génique et de la virologie, telles que la manière d'obtenir un vecteur idéal pour une application thérapeutique donnée ou comment analyser les domaines d'une capside virale responsables d'une propriété spécifique. Les implications de cette technique s'étendent au traitement de nombreuses maladies humaines, y compris les infections causées par des agents pathogènes viraux, car notre méthode permet l'évolution moléculaire de vecteurs A V capables d'infester spécifiquement et efficacement des cellules cibles virales, comme les lymphocytes T pour le VIH ou les hépatocytes pour les virus des hépatites. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la biologie des A V et puisse être utilisée pour améliorer les vecteurs A V destinés à la thérapie génique.

Elle peut également être facilement appliquée à d'autres familles de gènes ayant une pertinence fondamentale ou appliquée, telles que la fluorescence codant la dose, les trois rapporteurs, les enzymes cellulaires ou les protéines impliquées dans l'interférence ARN. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous cherchions un bon vecteur pour transfecter des fragments de souris adultes avec des gènes thérapeutiques, et avons réalisé que tous les sérotypes viraux adéno-associés (AV) naturellement présents présentaient des inconvénients, tels qu'une prévalence élevée dans la population humaine et, par conséquent, une incidence importante d'immunité préexistante, ou encore une faible efficacité in vivo malgré une transduction efficace en culture. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la fragmentation du gène de la capside virale AV basée sur l'ADN et certaines étapes de production de la banque virale sont difficiles à maîtriser, nécessitant de l'expérience et une attention particulière aux étapes critiques, afin de faciliter la préparation courante de quantités suffisantes des différents gènes de capside virale adéno-associée.

Pour le mélange d'ADN, ces gènes sont d'abord sous-clonés dans un vecteur plasmidique commun. Pour ce faire, les gènes cap désirés sont d'abord amplifiés par PCR à partir de plasmides AAV couramment disponibles, en utilisant les amorces cap F et cap R. Les gènes cap sont ensuite clonés dans un plasmide conçu pour contenir des sites spécifiques de liaison des amorces ainsi que des sites de restriction. Dans cet exemple, le gène cap est cloné dans les sites PAC un et SC un, présents dans les amorces utilisées pour l'amplification du cap et dans le plasmide récepteur, mais absents dans la plupart des AAV. Après génération des jeux de plasmides codant pour les gènes de capsides AAV, commencez la procédure de recombinaison du cap par PCR, en amplifiant les gènes cap choisis à l'aide des amorces T trois et T sept.

Préparez une réaction de PCR de 50 microlitres contenant 200 nanogrammes de plasmide cap, chaque amorce à une concentration finale de deux micromolaire, 10 microlitres de tampon five x high five et un microlitre de polymérase high five. Cette réaction produira environ trois microgrammes de produit de PCR, ce qui est suffisant pour jusqu'à six réactions de réarrangement, selon le nombre de gènes cap à inclure dans la bibliothèque. Commencez par cinq minutes à 95 degrés Celsius, puis effectuez 40 cycles de 15 secondes à 94 degrés Celsius, 30 secondes à 57 degrés Celsius et trois minutes à 68 degrés Celsius, suivis d'une étape finale de 10 minutes à 72 degrés Celsius.

Après purification des produits de PCR, une digestion contrôlée de l'ADN est utilisée pour créer des fragments du gène cap destinés à être réassemblés dans Kyra. L'un des aspects les plus délicats de cette procédure consiste à obtenir une gamme utile de fragments d'ADN du gène cap, obtenus par digestion, pour le réassemblage dans des kyras. À cette fin, nous préparons des quantités PLE de gènes cap purifiés dès le départ, puis mettons en place plusieurs réactions parallèles avec des conditions variables. Pour préparer la digestion de manière uniforme, mélangez les différents produits de PCR du gène cap jusqu'à une quantité totale de quatre microgrammes dans 54 microlitres d'eau, puis ajoutez soigneusement six microlitres de tampon de réaction DS et 0,5 microlitre de DNAsé I. Vortexez brièvement le tube trois fois, puis placez-le immédiatement sur un bloc chauffant à 25 degrés Celsius.

Incuber cette première réaction pendant une minute. Ensuite, préparer une deuxième réaction de digestion, mais incuber à 25 degrés Celsius pendant une minute et 15 secondes. De cette manière, mettre en place plusieurs réactions parallèles avec des durées d'incubation comprises entre une et deux minutes, en faisant varier le temps d'incubation par incréments de 15 secondes.

Arrêter chaque réaction en ajoutant six microlitres de EDTA à 25 millimolaire. Vortexer brièvement le tube et incuber 10 minutes à 75 degrés Celsius. Les réactions parallèles multiples produiront cinq échantillons de cap digérés avec des ADN, un pour des durées d'incubation variables, purifier les fragments de cap sur un gel AROS standard à 1 %.

Idéalement, une traînée doit être visible entre 100 et 500 paires de bases, comme illustré dans cet exemple avec des durées d'incubation initiales d'une minute, de 45 secondes ou de deux minutes. Lors du brassage génique, les fragments cap sont d'abord réassemblés en séquences complètes par une PCR au cours de laquelle ils s'amorcent eux-mêmes en fonction de leurs homologies partielles. Préparez une réaction de 50 microlitres contenant 500 nanogrammes de fragments purifiés, 10 microlitres de tampon fusion 10 x, un microlitre de dNTPs 10 millimolaire, 1,5 microlitre de DMSO et 0,5 microlitre de fusion.

Deux polymérases sont incubées pendant 30 secondes à 98 degrés Celsius, puis 40 cycles sont effectués : 10 secondes à 98 degrés Celsius, 30 secondes à 42 degrés Celsius et 45 secondes à 72 degrés Celsius, suivis d'une étape finale de 10 minutes à 72 degrés Celsius. Ensuite, amplifier les gènes du cap réassemblés pour un clonage ultérieur par une deuxième PCR en utilisant des amorces se liant aux séquences flanquantes conservées. Par exemple, SAF et SAR ou CUF et CUR permettent de préparer une réaction de 50 microlitres contenant deux microlitres de la première PCR, chaque amorce à une concentration finale de deux micromolaire, 0,5 microlitre de chlorure de magnésium, 10 microlitres de tampon cinq x high-FI et un microlitre de polymérase high-FI.

Il est recommandé d'effectuer de 16 à 24 PCR afin d'assurer des rendements suffisamment élevés pour le clonage ultérieur. Après avoir regroupé les PCR et purifié la bande complète du gène cap, l'étape suivante consiste à digérer le pool purifié du gène cap avec PAC I et SC I pour le cloner dans un plasmide AAV compétent pour la réplication. Le plasmide receveur porte des répétitions terminales inversées AAV encadrant le gène rep AAV2 sous le contrôle du promoteur P5 d'AAV, ainsi que les sites PAC I et ASC I.

Les sites de restriction en aval de rep permettent le clonage en phase du pool de cap échangé. Les sites de fixation des amorces LSE indiqués par des flèches sont utiles pour le séquençage du gène cap ; mélangez les fragments de cap et le squelette plasmidique récepteur correctement coupé selon un rapport molaire de trois à un. Préparez un mélange maître d'un volume total de 40 microlitres, suffisant pour 20 transformations, avec une concentration finale d'ADN de 15 nanogrammes par microlitre.

Incuber toute la nuit à 16 degrés Celsius le jour suivant, puis transformer la réaction de ligation dans des cellules de E. coli. Mélanger deux microlitres de la réaction de ligation avec 30 microlitres de E. coli électrocompétents et transférer dans des cuvettes d'électroporation prérefroidies sur de la glace. Électroporer à 1,8 kilovolt, 200 ohms et 25 microfarads. La constante de temps doit être proche de cinq millisecondes. Ajouter immédiatement un millilitre de milieu SOC préchauffé et transférer dans un flacon de 250 millilitres.

20 électroporations de ce type produiront une bibliothèque présentant une diversité d'environ un fois dix puissance six clones différents. Ajouter un volume de milieu SOC préchauffé aux transformations regroupées et incuber à 37 degrés Celsius et 180 tr/min pendant une heure. Puis ajouter 40 millilitres des transformations regroupées à 800 millilitres de milieu LB contenant de l'ampicilline et incuber pendant 16 heures supplémentaires dans les mêmes conditions. L'ADN plasmidique de la bibliothèque est ensuite purifié à l'aide d'un kit disponible commercialement.

La production de la banque virale commence par la transfection de cellules HEC 2 9 3 T avec la banque a a v. Pour commencer cette procédure, ensemencez des boîtes carrées de 10 à 15 centimètres de cellules HEC 2 9 3 T et faites-les croître pendant 48 heures à 37 degrés Celsius. Pour chaque transfection, préparez les deux mélanges de réactifs suivants dans deux tubes séparés. Les quantités suivantes sont indiquées par 10 plaques dans le premier tube.

Mélanger 7,9 millilitres de chlorure de sodium et d'ADN, puis ajouter de l'eau jusqu'à un volume total de 15,8 millilitres. Dans le deuxième tube, ajouter 3,52 millilitres de polyéthylèneamine, 7,9 millilitres de chlorure de sodium et 4,38 millilitres d'eau. Combiner les mélanges, vortexer et incuber 10 minutes à température ambiante, puis répartir la solution uniformément dans chaque boîte de cellules HEK 293T. Incuber à 37 degrés Celsius.

Après 48 heures, la bibliothèque virale peut être récoltée. Détacher les cellules dans le milieu, rassembler les cellules provenant de toutes les boîtes dans un seul tube et centrifuger à 1200 tr/min pendant 15 minutes. Resuspendre le culot cellulaire dans six millilitres de tampon de lyse, puis soumettre à cinq cycles de congélation-décongélation ; après ces cinq cycles, incuber avec la Ben Nase pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, centrifuger les débris cellulaires à 3 750 tr/min pendant 20 minutes. Préparer un gradient pour une purification par gradient de densité en utilisant une pipette Pasteur pour ajouter cinq millilitres de suspension virale dans un tube Beckman Quick-Seal pour centrifugeuse, suivis de 1,5 millilitre chacun de solution d'iodure de sodium à 15 %, 25 % et 40 %. Compléter le gradient avec du tampon de lyse et ultracentrifuger à 50 000 × g pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

À l’issue de l’ultracentrifugation, retirez le tube du rotor et nettoyez l’extérieur du tube avec de l’éthanol à 70 %. Percez le haut du tube avec une aiguille pour assurer la ventilation, puis utilisez une autre aiguille pour prélever 1,2 millilitre de la fraction IOL à 40 %. Veillez à ne pas prélever dans la fraction à 25 %, car elle contient des particules vides.

Capsides de AAV. Des clones individuels provenant de la bibliothèque plasmidique initiale sont analysés quant à leur fonctionnalité et leur diversité en étant utilisés pour produire des vecteurs recombinants. Des cellules cultivées ou des animaux exprimant un gène rapporteur sont ensuite infectés avec différentes quantités de virus purifié, et l'efficacité de transduction est déterminée.

Les résultats de microscopie de fluorescence présentés ici proviennent de trois lignées cellulaires humaines infectées par cinq vecteurs recombinants différents exprimant YFP avec des gènes cap réarrangés. Une méthode alternative d'analyse de l'efficacité de transduction consiste à mesurer de façon quantitative l'expression du gène rapporteur fluorescent. Cette figure illustre un résultat typique obtenu avec quatre types cellulaires : cellules humaines, rein humain, col de l'utérus humain, fibroblastes murins et lymphocytes T humains, infectés par 18 vecteurs recombinants différents exprimant YFP avec des gènes cap réarrangés, sélectionnés aléatoirement à partir d'une bibliothèque initiale.

L'expression de YFP a été codée par couleur pour faciliter la visualisation. Les pourcentages de cellules transduites représentés vont du noir, indiquant 0 %, au blanc, indiquant la valeur la plus élevée mesurée dans chaque clone de type cellulaire. Le clone B deux rouge illustre un clone présentant une efficacité globale faible, comme on peut s'y attendre avec des capsides non sélectionnés. La bibliothèque virale peut ensuite être criblée afin d'isoler des particules uniques présentant la plupart, voire la totalité, des propriétés souhaitées dans une lignée cellulaire donnée ou chez des animaux, pour la sélection.

Dans des cellules en culture, les cellules sont d'abord co-infectées avec divers aliquots de la banque et du virus ENO cinq pour favoriser une croissance de a a v, puis les cellules sont récoltées et le a a v amplifié est extrait et utilisé pour réinfecter de nouvelles cellules. La détermination des rapports optimaux entre a a v et adénovirus pour la co-infection des cellules est importante, et un bon indicateur d'une infection virale efficace est l'apparition d'effets cytopathiques trois jours après l'inoculation du virus, observés par l'arrondissement et le détachement des cellules. Dans cette figure, le panneau en haut à gauche montre des cellules non infectées, tandis que les autres panneaux montrent des cellules infectées avec les quantités indiquées, en particules par cellule, d'adénovirus. Un autre indicateur utile de l'infection et de l'amplification de a a v est la détection des protéines de capsides par immunotransfert (western blotting) à l'aide de l'anticorps B un qui reconnaît un épitope de capsides de a a v hautement conservé.

La membrane de gauche montre des cellules co-infectées avec différents volumes en microlitres d'une bibliothèque a a V et du virus auxiliaire ENO. Les deux premières pistes constituent de bons exemples de conditions produisant une expression de la protéine a a v à peine détectable, indiquant une infection et une amplification de a a v suffisantes mais non excessives, et par conséquent une liaison étroite génotype-phénotype souhaitée. Ainsi, 0,11 ou 10 microlitres de ces surnageants ont été utilisés pour réinfecter des cellules fraîches.

Les résultats du western blot sont présentés dans les cellules de droite. Les cellules LA c ont été infectées avec un a v seul comme témoin négatif. Il est également essentiel de surveiller la diversité de la bibliothèque au cours de plusieurs cycles d'infection par séquençage de l'ADN.

Ce diagramme montre les comparaisons des séquences protéiques de clones d'AAV provenant d'une bibliothèque basée sur les AAV deux, huit et neuf, avant et après sélection. Les séquences situées au-dessus de la ligne rouge représentent les AAV parentaux. Les flèches violettes indiquent des événements de recombinaison homologue. La flèche rouge marque un croisement entre l'AAV deux et l'AAV neuf, observé dans tous les clones sélectionnés. Pour la sélection chez les animaux, la bibliothèque d'AAV est infusée dans les animaux, puis récupérée à partir des cellules ou tissus cibles par PCR, puis reclonée et reconditionnée pour un nouveau cycle d'infection.

Illustré ici est un exemple de sauvetage de clones de virus a infectés avec succès des foies de souris une semaine après l'infusion périphérique d'une bibliothèque. La piste un montre la bande attendue de 2,2 kilobases, tandis que la piste deux correspond à un témoin sans matrice. Les tailles des bandes du marqueur d'ADN dans la piste M sont indiquées en kilobases. Quelle que soit la procédure de sélection, les variants d'encapsidation enrichis doivent finalement être validés dans des systèmes appropriés.

Un exemple de performance supérieure d'un a a V kymera enrichi dans des cellules en culture est présenté ici. Des couleurs plus foncées indiquent une infectiosité plus élevée par nombre de particules, donc par clone. L'a a V kymera A-A-V-D-J surpasse un ensemble de huit souches sauvages naturelles de a a V dans un large éventail de lignées cellulaires.

Enfin, une analyse d'un clone AAV KYMERA sélectionné dans le foie de souris est présentée. Un ADN AAV a été sélectionné pour cibler spécifiquement les cellules d'hépatome, puis utilisé pour produire des vecteurs recombinants exprimant une protéine luciférase. Nos souris représentatives, réparties en groupes de trois, ont été analysées une semaine après l'infusion périphérique de doses équivalentes de ce vecteur ou d'un vecteur contrôle dérivé de l'AAV sauvage de sérotype 8, l'un des isolats naturels les plus puissants connus dans le foie de souris. Notez que, bien que le clone AAV DN produise une expression globale légèrement inférieure dans le foie, il est plus spécifique pour cet organe, car il présente une moindre distribution en dehors du foie dans les tissus non hépatiques, une fois les niveaux d'expression hépatique ajustés à l'aide du logiciel d'imagerie.

Cette technique peut être réalisée en une semaine, en commençant par l'amplification des gènes de la capside a a V et en se terminant par la bibliothèque virale, à condition qu'elle soit correctement exécutée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le protocole fourni ici découle de notre expérience avec la sélection de sérotypes AV naturels, et qu'il est tout à fait possible que certaines conditions doivent être adaptées et optimisées lorsque d'autres utilisateurs créent leurs propres bibliothèques personnalisées. Outre cette méthode, d'autres approches, telles que l'affichage de peptides par mutagenèse dirigée avec AGENESIS ou la randomisation basée sur la PCR, peuvent être réalisées afin de générer également des bibliothèques très diversifiées ou d'essayer d'améliorer davantage les propriétés des capside déjà créées et enrichies par recombinaison familiale de l'ADN après leur développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la livraison génique virale pour explorer des stratégies thérapeutiques destinées à des maladies et à des cellules cibles associées pour lesquelles les types conventionnels de VCA offraient des résultats insatisfaisants, comme l'infection par le VIH et les cellules T, ainsi que pour étudier le transfert génique vectorisé dans les cellules souches humaines et d'autres cellules cardiaques afin d'infecter des cellules en culture. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de concevoir et de faire évoluer des bibliothèques très diversifiées de vecteurs viraux adéno-associés synthétiques en utilisant une combinaison de fragmentation génique et de réassemblage, ainsi que de la manière de sélectionner principalement ces bibliothèques dans des cellules en culture ou chez des animaux afin d'enrichir des capsides individuelles possédant des propriétés spécifiques souhaitées pour des utilisations en tant que vecteurs de transfert génique. N'oubliez pas que le travail avec l'adénovirus peut être dangereux et que de nombreuses précautions doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure.