Un système de neurones primaires de la culture pour l'étude de l'herpès simplex virus de latence et de réactivation

L'objectif de cette expérience est de montrer comment un système de culture primaire de cellules neuronales peut être utilisé pour étudier la latence et la réactivation du virus de l'herpès simplex. Ceci est réalisé en isolant d'abord les neurones des ganglions cervicaux supérieurs d'embryons RA, puis en cultivant les neurones issus des ganglions dissociés après élimination des cellules non neuronales. Une infection latente par HSV est établie à l'aide d'un virus EGFP pour infecter les neurones en présence d'un inhibiteur de la réplication lytique.

L'étape suivante consiste à induire la réactivation des cultures infectées latentes. Enfin, l'efficacité de la réactivation est évaluée en surveillant l'expression de EGFP au fil du temps. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent comment différentes voies de signalisation neuronale régulent la latence et la réactivation du virus de l'herpès simplex à l'aide d'inhibiteurs chimiques, d'interférence ARN et de transfert de gènes.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle permet des études détaillées des interactions régulant la latence du virus de l'herpès simplex dans le neurone hôte au niveau moléculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la latence du virus de l'herpès simplex, telles que quelles sont les signaux qui agissent pour réprimer le génome latent et comment la réactivation est-elle déclenchée au niveau moléculaire ? Dans les neurones, bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la latence du VHS-1.

Il peut également être appliqué à d'autres virus herpétiques alpha neurotrophes. La procédure sera démontrée par Marigo, Kochi et Julian Kim, tous deux étudiants diplômés dans nos laboratoires. Les ganglions cervicaux supérieurs, ou neurones SCG, utilisés pour ce protocole, sont isolés de ratons E 21 prélevés de l'utérus d'une rate gravide. En travaillant sous une hotte de dissection, sacrifiez chaque raton en orientant les ciseaux vers la base du cou, juste au-dessus des épaules, et en sectionnant la tête du tronc. Pour exposer les ganglions, utilisez des aiguilles de calibre 23 pour fixer la tête, côté du cou vers le haut, en trois endroits.

Fixez d'abord la moelle épinière. Ensuite, tirez la peau antérieure par-dessus le nez et fixez-la avec une épingle, puis fixez en troisième lieu l'œsophage et la trachée loin de l'arrière du cou. Recherchez le ganglion cervical supérieur (SCG) en localisant la bifurcation de l'artère carotide.

L'artère carotide est une structure appariée. Il existe deux bifurcations de chaque côté du cou, donc deux CGS s. par population. Le CGS se situe juste en dessous de la branche.

Séparez le GCS des artères en écartant la bifurcation à l'aide de ses deux extrémités. Le GCS est translucide et incolore, contrairement au tissu adipeux opaque et jaunâtre qui entoure la bifurcation. Placez les ganglions dans 12 millilitres de L 15.

Milieu supplémenté avec du glucose dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace. Après avoir récolté tous les gCS à partir des embryons et les avoir doucement aspirés, centrifuger les ganglions pendant une minute. À 600 tr/min, éliminer le milieu excédentaire Reese.

Suspendre les ganglions dans un millilitre de milieu L 15 contenant de la trypsine et du collagénase. Incuber 24 minutes à 37 degrés Celsius.

Agiter toutes les huit minutes. Ensuite, ajouter 10 millilitres de milieu marin pour inactiver la centrifugation de la trypsine pendant une minute. À 600 tr/min, éliminer autant que possible le milieu de collagénase tryine et laver les ganglions avec 10 millilitres de milieu C centrifugé pendant une minute à 600 tr/min.

Répétez ce lavage une fois. Éliminez le milieu de lavage et resuspendez les ganglions dans un millilitre de milieu C pour la trituration, à l’aide d’une aiguille de 21 gauge fixée à une seringue de cinq millilitres, pendant un maximum de 15 cycles montants et descendants. Terminez la trituration avec une aiguille de 23 gauge jusqu’à ce que la majorité des agrégats soient dissociés.

Éliminer tous les agrégats cellulaires résiduels en filtrant les neurones dissociés à travers un filtre en nylon de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Prélever un aliquot de 10 microlitres de la suspension cellulaire filtrée, mélanger avec du bleu de trypan pour déterminer le nombre de cellules viables. Compter le nombre de cellules qui excluent activement le colorant en utilisant un hémocytomètre.

Ensuite, distribuer de 5 000 à 6 000 cellules vivantes au total dans 100 microlitres de milieu C dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 96 puits pré-enrobée de collagène et de laminine, en incluant 50 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance nerveux dans le milieu C. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius ; le jour suivant, soit le jour un in vitro ou DIV un, vérifier l'attachement adéquat des neurones et la croissance de certaines projections axonales.

Remplacez le milieu C dans les puits par 50 microlitres de milieu neurobasal ou NBM contenant le NGF Acho et la fluorodeoxyuridine cinq-fluoro-deux. Remplacez le milieu une rangée à la fois afin de garantir que les cellules ne s'assèchent pas. Incubez les cultures à 37 degrés Celsius pendant cinq jours.

Surveillez la culture quotidiennement afin de confirmer la mort des cellules non neuronales et la croissance des neurones. Pour commencer cette étape du protocole au sixième jour in vitro, vérifiez que la majorité des cellules de soutien non neuronales ont été éliminées. Il est extrêmement important de minimiser toute manipulation physique inutile du neurone à tout moment.

Le retrait et le remplacement du milieu doivent être effectués très doucement et lentement, sinon les contraintes mécaniques résultantes peuvent affecter la viabilité des neurones. Ajouter de l'aciclovir ou un CV au milieu existant dans chaque puits pour obtenir une concentration finale de 100 micromolaire. Ajouter un CV lentement et délicatement afin de s'assurer que la force mécanique n'affecte pas négativement les cellules le jour suivant.

À JIV sept, infecter les cultures de GSM avec un HSV recombinant un exprimant un rapporteur EGF fusionné à la protéine lytique virale US 11 à une multiplicité d'infection comprise entre un et deux. Ajouter le virus dilué directement dans le milieu existant dans le puits. Inclure un témoin mock infecté et une infection lytique.

Contrôle positif dans un milieu dépourvu de CV. Laisser l'infection se dérouler pendant deux à trois heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, remplacer le milieu d'infection par du NBM frais contenant du NGF et un CV. Il est essentiel d'être extrêmement prudent lors du changement du milieu d'infection. Incliner la plaque vers vous et retirer lentement le milieu à partir du fond du puits.

Ensuite, diriger l'extrémité de la pipette vers la paroi du puits plutôt que vers le fond du puits et laisser doucement le milieu glisser sur les cellules. Remplacer une rangée de milieu à la fois afin d'éviter que les cellules ne s'assèchent. Replacer les cultures dans l'incubateur en les manipulant le plus délicatement possible pour ne pas compromettre leur capacité à maintenir la latence du VHS-1.

Entretenir les cultures pendant six jours à 37 degrés Celsius, période durant laquelle le virus établira une latence. Pendant cette période, utiliser un microscope à fluorescence pour surveiller l'expression de us11-EGFP comme indicateur de la réplication lytique.

Comme prévu, aucune expression de la GFP ne devrait être observée dans le témoin mock infecté. La protéine S 11 EGFP devrait être détectée uniquement dans le cas de l'infection. Les puits du témoin positif, non traités au CV, indiquent une infection primaire réussie et une réplication lytique productive.

Pour évaluer la réactivation au 14e jour in vitro (DIV), remplacez soigneusement le milieu contenant un CV par du milieu frais ne contenant pas de CV, comme précédemment. Orientez la pointe de la pipette vers la paroi du puits plutôt que vers le fond du puits, et laissez le milieu glisser doucement sur les cellules si approprié. Incluez des variables pharmacologiques ou biologiques telles que le LY 2 9 0 0 4 à 20 micromolaire.

Aucune expression de GFP ne devrait être détectée dans les cultures infectées de manière latente traitées avec l'A CV. Remettre les cellules à 37 degrés Celsius pendant une période de cinq à six jours. Surveiller les cultures vivantes à l’aide d’un microscope à fluorescence pour détecter les neurones en cours de réactivation.

La fréquence de réactivation est calculée en comptant le nombre de puits contenant des neurones positifs pour EGFP et en l'exprimant comme une proportion du nombre total de puits d'échantillon. Cette figure illustre un exemple où le statine déclencheur, un inducteur connu de la réactivation, est appliqué à des cultures de ganglions cervicaux supérieurs infectés en phase tardive. La réactivation a été surveillée et évaluée quotidiennement par microscopie à fluorescence pendant une période de cinq jours après le traitement médicamenteux.

Avec la réactivation TSA, on atteint 50 % du maximum en deux jours ; au bout de cinq jours, la réactivation atteint 60 % de la ligne de base ou de la réactivation spontanée représentée par le DMSO. Les cultures contrôles traitées sont d'environ 10 % dans cet experiment, et varient généralement entre 5 et 20 % en utilisant ce système in vitro. Plus tard, les cultures de ganglions cervicaux supérieurs infectés ont également été traitées avec LY 2 9 0 0 4.

Des cultures de réactivation induites par LY ont été comparées à celles traitées avec l'inhibiteur de la synthèse de l'ADN viral, l'acide phosphonoacétique (PAA), ainsi qu'aux deux composés combinés, comme illustré ici. L'expression de US 11 EGFP est altérée par le PAA dans les cultures induites à réactiver avec LY 2 9 4 0 0 2, indiquant que l'expression de US 11 EGFP dépend de la réplication de l'ADN viral. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de respecter scrupuleusement les techniques stériles et de manipuler les cultures de GC avec la plus grande délicatesse afin d'éviter une réactivation spontanée accrue induite par le stress ou des mouvements mécaniques. Après avoir suivi cette procédure pour établir des infections latentes par HSV-1 dans des neurones en culture, d'autres méthodes telles que l'ARNi-S-H-R, l'extinction et l'expression ectopique de gènes sauvages ou mutés peuvent être réalisées afin de caractériser les fonctions neuronales régulant la latence et la réactivation d'HSV-1.

N'oubliez pas que le VHS de type 1 est un agent pathogène humain qui nécessite des précautions de sécurité de niveau PSL 2. Vous devez être familiarisé avec le travail en conditions PSL 2 avant d'effectuer cette procédure. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'établir des cultures de ganglions cervicaux supérieurs afin de mettre en place des infections latentes par le VHS de type 1, et de déclencher efficacement la réactivation dans les neurones.