La culture et les applications de rotation bioréacteur de la paroi vasculaire dérivé de modèles 3D de cellules épithéliales

Ce protocole non conventionnel présente un système simple et robuste pour la culture de cellules épithéliales humaines en modèles tridimensionnels organotypiques, qui recréent le tissu humain in vivo. Premièrement, les cellules épithéliales sont cultivées jusqu'à confluence en monocouche dans un flacon de culture, récoltées, puis combinées à des billes porteuses microscopiques dans le bioréacteur STLV. Le STLV est mis en rotation sur la plateforme afin de créer un environnement de chute libre constant avec un faible cisaillement fluide, permettant aux cellules de s'attacher et de croître sur les billes, formant des agrégats cellulaires après 96 heures et environ chaque jour suivant.

Renouvelez le milieu dans le SDLV pour compenser le métabolisme cellulaire après la formation des agrégats ; effectuez un prélèvement hebdomadaire pour imagerie par microscopie optique afin de surveiller l'évolution du développement, une fois la formation complète des agrégats et la différenciation cellulaire achevées. Ensemencez les agrégats pour des analyses expérimentales ultérieures et des tests. En définitive, ce système peut générer des modèles organotypiques semblables à ceux in vivo pour une multitude d'investigations scientifiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la culture cellulaire conventionnelle, est que les cellules épithéliales se différencient et se polarisent en agrégats de type tissulaire, se comportant ainsi morphologiquement et fonctionnellement de manière similaire au tissu humain authentique. Ce système de modèle 3D offre une meilleure compréhension de la biologie des cellules épithéliales, des interactions hôte-pathogène, ainsi que des interactions complexes entre les types cellulaires pouvant être introduits dans le système. Dr. Andrea Radkey.

Un postdoctorant de mon laboratoire va maintenant démontrer cette procédure pour détoxifier le bioréacteur latéral à rotation lente. Couvrez les orifices ouverts avec des bouchons filetés. Remplissez le STLV avec de l'éthanol à 95 % et équilibrez pendant 24 heures.

Éliminer l'éthanol, puis remplir avec de l'eau distillée stérilisée et incuber pendant 24 heures à l'aide des outils fournis par le fabricant, desserrer toutes les vis et retirer le bouchon central du STLV. Placer les éléments dans un sachet de stérilisation et stériliser au autoclave à 110 degrés Celsius pendant 20 minutes. Réassembler le STLV et répéter la détoxification afin de garantir la stérilité.

Ensuite, serrez les vis du STLV. Fixez un robinet unidirectionnel pré-stérilisé à chaque orifice. Retirez maintenant les pistons d'une seringue de 10 millilitres et d'une seringue de cinq millilitres à verrouillage par emboîtement, et remettez les pistons dans leurs emballages.

Pour maintenir la stérilité, vissez les seringues sur le robinet-stop. Ajoutez ensuite du DPBS dans la seringue de 10 millilitres jusqu'à ce que le STLV soit plein et que la seringue de cinq millilitres commence à se remplir. Remplacez alors les pistons stériles dans chaque seringue et éliminez les bulles résiduelles dans le bioréacteur en alternant l'action sur les pistons des seringues.

Fermez les robinets et fixez le STLV sur la plateforme verticale rotative. Faites tourner pendant au moins 24 heures pour surveiller les fuites dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez 15 millilitres de DPBS à 250 milligrammes de billes microcar de cytodex et stérilisez à l’autoclave après refroidissement.

Éliminer le DPBS en effectuant trois lavages avec le milieu de culture destiné aux cellules épithéliales. Agiter doucement le tube pour resuspendre les billes. Ensuite, resuspendre les billes dans 15 millilitres de milieu de culture.

Primo-cultivez un fois dix puissance sept cellules épithéliales en monocouche dans des flacons de culture tissulaire. Récoltez les cellules et effectuez le dénombrement ainsi que la détermination de la viabilité cellulaire par exclusion du bleu de trypan. Après coloration, ajoutez les cellules aux billes préparées.

Rincez le tube conique pour vous assurer que toutes les cellules sont transférées. Ensuite, retirez le DPBS et les seringues du STLV. Retirez également le bouchon du port central à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres.

Chargez la suspension de billes avec les cellules épithéliales dans le STLV. Rincez une fois le tube conique afin de transférer toutes les cellules et billes. Remplacez ensuite le bouchon du port central.

Ensuite, retirez les pistons d'une seringue de cinq millilitres et d'une seringue de 10 millilitres, puis remettez les pistons dans leurs emballages. Pour maintenir l'asepsie, vissez les embouts en pouces des seringues avec des robinets en position ouverte. Remplissez le STLV de milieu.

Remplacez les pistons et fermez le robinet. Équilibrez maintenant la nouvelle culture de STLV dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sans rotation. Après avoir retiré le STLV de l'incubateur, ouvrez le robinet.

Éliminez toutes les bulles à l’aide des pistons et fermez le robinet. Ensuite, réglez le STLV sur une rotation continue à 20 tr/min dans l’incubateur. Après 96 à 120 heures, changez le milieu en retirant les seringues et en ouvrant les deux robinets en inclinant le STLV pour permettre aux billes et aux cellules de se déposer.

Une fois les cellules déposées, retirez environ 75 % du milieu par le port latéral à l’aide de seringues pour effectuer le protocole d’alimentation. Renouvelez à nouveau le milieu selon les besoins en fonction du métabolisme cellulaire. Surveillez également la croissance et la viabilité des agrégats tous les cinq à sept jours.

Pour éviter la cisaillement des agrégats, utilisez une pipette de 1000 microlitres dont l'embout a été coupé à environ deux centimètres de l'extrémité et stérilisé. Retirez soigneusement 200 microlitres d'agrégats du port central et répartissez-les en deux aliquotes dans des tubes de 1,5 millilitre. Utilisez une des aliquotes pour surveiller la viabilité cellulaire. Après avoir détaché les cellules des billes, évaluez la viabilité par exclusion au bleu de trypan.

Coloration pour l'imagerie des agrégats cellulaires. Ajouter de 0,5 à un millilitre de milieu à l'aliquote d'agrégat de 1,5 millilitre et transférer dans une petite boîte de Pétri à l'aide d'une pipette dont la pointe de 1000 microlitres a été coupée. Imager les agrégats.

À l'aide d'un microscope optique inversé pour certains modèles de cellules épithéliales, il est nécessaire de transférer les agrégats dans un demi-récipient jetable afin d'augmenter l'aération de la culture environ une semaine avant la récolte des agrégats. Pour l'analyse, retirez les seringues du STLV et versez environ 50 % du milieu par le port latéral. Retirez le bouchon central et versez soigneusement l'ensemble du contenu dans un tube conique de 50 millilitres par le port central.

Rincez deux fois le STLV avec cinq millilitres de milieu et combinez les rinçages avec les agrégats récoltés. Ensuite, transférez les agrégats du tube conique de 50 millilitres vers le Harv. Après une semaine, récoltez soigneusement les agrégats pour des formats d'essai potentiels ; des agrégats épithéliaux humains différenciés ont été cultivés dans le système de bioréacteur STLV.

Les images de MEV et de MET sont obtenues à partir de cellules vaginales humaines cultivées dans le STLV pendant 39 jours. Remarquez que les agrégats tridimensionnels présentent des caractéristiques ultrastructurales semblables à celles des tissus, telles que les micros sillons, les invaginations, les vésicules sécrétoires intracellulaires et les microvillosités présentes sur la surface apicale. Les images de microscopie immunofluorescente en coupe confocale de cellules vaginales tridimensionnelles indiquent une expression de la mucine ainsi que de marqueurs spécifiques aux cellules épithéliales et à la différenciation terminale. Des phénotypes physiologiquement pertinents constituent également une excellente plateforme pour évaluer la toxicité de composés.

Le test au MTT, un dosage couramment utilisé pour mesurer la viabilité cellulaire, le métabolisme ou la prolifération, peut servir à évaluer la toxicité de divers produits chimiques et composés. En alternative, mesurer la toxicité après traitement avec des composés testés par exclusion du bleu de trypan. Dans cet exemple, après traitement avec le NONOXINOL neuf, les agrégats vaginaux ont montré une réponse toxique similaire à celle des modèles explants cervicaux X, mais un profil différent par rapport aux monocouches.

Les agrégats tridimensionnels sont fonctionnellement réactifs, par exemple lorsqu'ils sont stimulés par des molécules dérivées de micro-organismes reconnues par les récepteurs de type Toll. Les agrégats réagissent en sécrétant des cytokines pro-inflammatoires, notamment la protéine IL-6 ainsi que l'expression transcriptionnelle du récepteur de la progestérone. Un récepteur capable de répondre à une stimulation hormonale peut également être observé dans les cellules vaginales.

Les agrégats tridimensionnels ont non seulement la capacité de répondre à des molécules de pathogènes et d'hormones, mais sont également capables de soutenir fonctionnellement une infection par le virus de l'herpès simplex de type deux. Une image de microscopie confocale d'agrégats vaginaux tridimensionnels infectés par le VHS-2 illustre cette infection. Les propriétés physiques et fonctionnelles des cellules individuelles au sein des agrégats peuvent également être quantifiées par cytométrie en flux, par exemple à l'aide d'un test de cytométrie en flux destiné à mesurer l'expression membranaire de muc1 sur des cellules vaginales individuelles.

Les agrégats vaginaux tridimensionnels exprimaient un pourcentage plus faible de muck un sur leur surface par rapport aux monocouches après leur développement. Cette technique a permis aux chercheurs dans les domaines de la biologie des tissus et des maladies infectieuses d'étudier la structure et les réponses physiologiques aux stimuli. Grâce à ces modèles organotypiques, nous reproduisons mieux la biologie humaine.