Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Cette vidéo décrit la synthèse combinatoire de films polyanhydrides biodégradables et de banques de nanoparticules, ainsi que la détection à haut débit de la libération de protéines à partir de ces bibliothèques. Tout d’abord, un appareil de dépôt automatisé à haut débit utilisé pour déposer un éventail de monomères de composition variée dans des cuvettes en verre. Une réaction de polycondensation est effectuée à 180 degrés Celsius et 0,3 tor pendant 1,5 heure.

Ces conditions de réaction sont spécifiques à la synthèse des polymères polyanhydrides C-P-H-S-A. À l’aide de l’appareil de dépôt automatisé, le solvant et tous les composants d’encapsulation sont déposés dans les cuvettes contenant la bibliothèque de polymères. La sonication peut être administrée pour assurer la dissolution complète du polymère et la dispersion uniforme des composants supplémentaires.

Ensuite, le polymère dissous est transféré dans un tube de non-solvant pour fabriquer la bibliothèque de nanoparticules par nanoprécipitation. Les nanoparticules sont récupérées par séchage sous vide ou filtration, puis transférées sur une plaque modifiée de 96 bien libérées. Enfin, la banque chargée de protéines est incubée dans des conditions physiologiques et la cinétique de libération des protéines est évaluée à l’aide d’une méthode de détection spatiale fluorescente.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la cinétique de libération des protéines en fonction des propriétés du polymère ou des conditions environnementales de libération. Le principal avantage de cette approche par rapport aux autres techniques conventionnelles d’un échantillon à la fois est que nous sommes en mesure de synthétiser plusieurs échantillons simultanément. Ces échantillons peuvent ensuite être criblés à haut débit pour détecter les interactions protéine-polymère, cellule-polymère ou hôte-polymère.

Cela accélère ensuite la conception et le développement rationnels de ces biomatériaux pour l’administration de médicaments et l’ingénierie tissulaire. La démonstration de la procédure sera faite par La Tricia Peterson, une post-opératoire de mon laboratoire. Dans cette section de la vidéo, un appareil de dépôt en débit Hyatt est utilisé pour déposer une bibliothèque de monomères variant en termes de composition après synthèse de polymères.

Cet appareil est utilisé pour fabriquer une bibliothèque combinatoire de films polymères ou de nanoparticules à blanc ou chargés de protéines. La plate-forme automatisée se compose de deux pousse-seringues programmables et de trois actionneurs linéaires connectés en série à un ordinateur sur l’ordinateur. Le logiciel LabVIEW est utilisé pour diriger les commandes vers les pousse-seringues et les actionneurs.

Des seringues étanches au gaz de 10 cc sont chargées dans les pousse-seringues avec des tubes capillaires métalliques reliés par des raccords de verrouillage de leurre, qui distribuent les solutions polymères dans des cuvettes en verre. Dans cette démonstration, l’acide sérique ou SA sera utilisé avec un six Biss para oxy heane ou CPH pour fabriquer une bibliothèque de nanoparticules encapsulant l’albumine sérique Texas Red Boan. Les instructions de cette vidéo et les documents qui l’accompagnent peuvent être adaptés pour fabriquer et tester un large éventail de films polymères et de bibliothèques de nanoparticules.

Pour synthétiser les banques, commencez par dissoudre chaque monomère et chloroforme à une concentration finale de 25 milligrammes par millilitre dans un flacon en verre. Ensuite, chargez chaque solution dans une seringue étanche de 10 cc en aspirant la solution à travers l’extrémité du verrou de leurre de la seringue. Retirez toutes les bulles d’air.

Ensuite, fixez le tube capillaire en acier inoxydable résistant aux solvants à l’extrémité de la seringue. Fixez les tubes capillaires dans des pinces, fixez-les à un support annulaire. Positionnez ensuite l’extrémité des deux tubes capillaires dans le vétérinaire de départ.

Pour le dépôt de monomères. Placez les seringues sur les pousse-seringues programmables et verrouillez-les en position dans le logiciel de vue de laboratoire. Réglez les actionneurs linéaires sur la position de départ dans le logiciel.

Lancez le dépôt automatisé des monomères SA et CPH dans les cuvettes en verre sur les axes x, y et z. Les actionneurs positionneront correctement les tubes capillaires dans chaque Q, vérifieront et pomperont les volumes programmés de chaque monomère dans ceux-ci, créant ainsi une bibliothèque de monomères variant en termes de composition. Après dépôt de monomères.

Transférez la bibliothèque de monomères dans un four à vide préchauffé et incubez à 180 degrés Celsius et 0,3 pendant 1,5 heure pour permettre la polymérisation par condensation. Suite à l’incubation, la fabrication de la bibliothèque de polymères est terminée. Ensuite, des nanoparticules de polymère chargées en protéines sont générées.

Voir le protocole d’accompagnement pour la fabrication d’une bibliothèque de films polymères chargés de protéines pour la fabrication d’une bibliothèque de nanoparticules chargées de protéines. Ajoutez la protéine, dans ce cas, l’albumine sérique de bovin rouge du Texas, au solvant approprié, qui devrait être capable de dissoudre la bibliothèque de polymères. Ici, le chlorure de méthylène est utilisé à une concentration de deux milligrammes par millilitre.

Remplissez la seringue de 10 cc avec du solvant Texas Red BSA et placez-la dans le premier pousse-seringue. Ensuite, placez une seringue propre et vide de deux cc dans le deuxième pousse-seringue, placez des tubes contenant 15 millilitres d’un solvant non solvant, dans ce cas, du pentane dans le porte-tube adjacent à la plate-forme du flacon. Ensuite, dans le laboratoire, visualisez le logiciel pour lancer le processus de dépôt automatisé de solvant en sélectionnant le programme.

Après le lancement du programme, le solvant est déposé dans les cuvettes contenant la bibliothèque de polymères, ce qui permet d’obtenir une concentration de polymère de 20 milligrammes par millilitre. Lorsque tout le solvant a été déposé, laissez-le dissoudre le polymère pendant une à cinq minutes. Poursuivez avec une syndication facultative pour assurer une dissolution complète du polymère et une dispersion uniforme des protéines.

Ensuite, lancez le programme de transfert d’échantillons en vue laboratoire. Chaque échantillon de polymère dissous de la bibliothèque est ensuite prélevé dans la seringue vide et distribué dans son tube correspondant de non-solvant dans le porte-échantillon. Une fois que chaque échantillon a été transféré, récupérez les nanoparticules chargées en protéines en plaçant la bibliothèque de nanoparticules dans une chambre à vide à 10 millimètres de vide de mercure, ou en utilisant la filtration sous vide jusqu’à ce que le solvant soit éliminé.

Pour étudier le rejet de BSA encapsulé, commencez par une plaque de polypropylène à soudure profonde de 96 qui a été modifiée en enlevant le demi-pouce supérieur de chaque paroi de puits de chaque autre colonne adjacente de la plaque. L’enlèvement du haut de chaque puits entre les colonnes A et B, C et DENF et GNH permet l’écoulement du liquide entre chaque paire de puits adjacents lorsqu’ils sont remplis jusqu’au transfert de volume complet. Normes BSA rouges du Texas allant de 1000 à 10 microgrammes par millilitre dans la plaque profonde de 96 puits.

Ceux-ci seront utilisés pour calculer la quantité de protéines et tiendront également compte de l’extinction du fluorochrome, reconstituent la masse souhaitée de nanoparticules dans le tampon PBS, puis sonicent pour disperser uniformément les particules. Ensuite, transférez la bibliothèque de nanoparticules dans la plaque de puits profonde de 96 et attendez que les échantillons se soient déposés au fond de la plaque de puits. Ensuite, à l’aide d’une pipette, remplissez lentement tous les puits adjacents avec un tampon PBS jusqu’à un quart de pouce du haut du puits.

Il doit y avoir suffisamment de zone tampon dans les puits adjacents pour qu’il puisse s’écouler librement entre les puits. Ensuite, scellez la plaque de déverrouillage avec le couvercle et placez-la à 37 degrés Celsius sous agitation. Pendant toute la durée de l’expérience, à des moments incrémentiels, utilisez un scanner fluorescent à plat Typhoon de 9 400 pour balayer la plaque à l’aide des filtres d’excitation, de laser et d’émission appropriés.

Après le balayage, utilisez un logiciel de quantification d’image pour quantifier la quantité de protéine conjuguée fluorochrome libérée dans chaque libération. Eh bien, Texas Red BSA a été encapsulé dans une bibliothèque de nanoparticules polymères synthétisées à partir de monomères SA et CPH, comme décrit dans cette vidéo, pour déterminer la cinétique de libération des protéines en fonction de la chimie des polymères. Les nanoparticules chargées de protéines ont été incubées à 37 degrés Celsius pendant un mois, au cours duquel des balayages fluorescents ont été obtenus à des points temporels incrémentiels pour la quantification de la libération de protéines.

Comme illustré ici, cette méthode d’hydro-débit a été utilisée pour déterminer la cinétique de libération de BSA Texas Red à partir de la bibliothèque de nanoparticules de poly-anhydride A-C-P-H-S-A. Des tendances dépendantes de la chimie ont été observées avec des taux de libération croissants des chimies de films de Sarich. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des tests standard de quantification des protéines.

Dans une expérience distincte, la libération de Texas Red BSA à partir des bibliothèques de films poly-anhydride CPT CPH a été évaluée, comme indiqué ici, une cinétique de libération d’ordre proche de zéro a été observée avec des films riches en cpeg libérant la protéine le plus rapidement avec des applications potentielles dans le domaine médical en tant que dispositifs d’administration de médicaments biodégradables. Ces résultats indiquent que le profil de libération souhaité d’un médicament thérapeutique ou d’un antigène vaccinal peut être contrôlé en modifiant la chimie du polymère. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes combinatoires ont été développées pour étudier des domaines tels que la stabilité des protéines, la toxicité cellulaire, l’activation cellulaire et la biodistribution InVivo.

Ces aspects sont importants pour la conception rationnelle de biomatériaux pour l’administration de médicaments et l’ingénierie tissulaire. N’oubliez pas de porter l’EPI approprié et de pratiquer des procédures de laboratoire sûres tout au long de ce protocole.