Name: Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Apprenez la synthèse combinatoire de films et nanoparticules polyanhydres biodégradables avec détection à haut débit de libération protéique. Cette méthode accélère le développement de biomatériaux pour l'ingénierie tissulaire.

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Les auteurs remercient le prix ONR-MURI (NN00014-06-1-1176) et le US Army Medical Research et du matériel de commande (Grant No. W81XWH-10-1-0806) pour le soutien financier. Ce matériel est basé sur des travaux appuyés par le National Science Foundation Grant n ° 0552584 et 0851519 CEE.

1. Combinatoire Polymer Bibliothèque de synthèse (variant en chimie des polymères) - voir Figure 1 pour l&#39;installation robotisée <ol><li> Dissoudre chaque monomère dans le solvant approprié (concentration = 25 mg / ml) et charger chaque gaz dans une seringue étanche à 10cc. </li><li> Fixer les tubes de verrouillage résistant aux solvants leurres capillaires à la fin de chaque seringue. </li><li> Placez les seringues sur les pompes à seringues (New Era Pompes seringues programmables) et la verrouiller en position. </li><li> Définir les actionneurs linéaires (Zaber) à la position de départ. </li><li> Grâce aux pinces support universel, positionner l&#39;extrémité des deux tubes capillaires dans le flacon de départ / puits pour le dépôt de monomère. </li><li> Lancer le programme LabVIEW, qui pompe des volumes variables de chaque monomère dans chaque puits en fonction de la composition copolymère désirée. Ce résultat est obtenu en chargeant le programme de l&#39;actionneur de l&#39;axe Z pour abaisser les tubes capillaires dans le flacon / puits, puis chaque pompe pour distribuer le volume désiré. Next, le programme ordonne la Z-actionneur pour revenir à sa position d&#39;origine et les X et Y actionneurs pour déplacer la position de la fiole suivante / puits. Ceci est effectué jusqu&#39;à ce que chacun d&#39;eux a bien le volume souhaité de monomère qui y sont déposées. </li><li> Après le dépôt de monomère, la bibliothèque monomère multi-puits ou multi-flacon est transféré dans un four pré-chauffé sous vide et on incube sous vide pendant la durée de la réaction de polymérisation par condensation. Pour CPH: synthèse SA, la réaction est effectuée à 180 ° C, 0,3 torr, pendant 1,5 heures, mais ces conditions de réaction varient entre différents systèmes polymères. </li></ol> 2. Blank combinatoire et en protéines chargé de nanoparticules de polymère et de fabrication Cinémathèque - voir Figure 1 pour l&#39;installation robotisée <ol><li> La seringue dans la pompe à seringue programmable première est rempli avec un solvant (bibliothèque vide) ou avec un solvant protéine dispersée dans celui-ci (protéine chargée en bibliothèque), tandis que la seringue dans la seconde seringuepompe reste vide. Des tubes pour la fabrication de nanoparticules dans le porte-échantillon adjacent sont remplies avec le non-solvant (rapport du solvant au non-solvant est de 1 à 100). Pour la fabrication de film d&#39;un vide plaque multi-puits est utilisée à la place des tubes dans le porte-échantillon adjacent. </li><li> En utilisant le programme LabVIEW, le solvant est déposé dans tous les flacons polymère / puits de la bibliothèque (= concentration de 20 mg / ml) et incubé pendant 1-5 min. Une étape de sonication en option (30 s à 40 Hz) peut être introduit pour assurer la dissolution complète de polymère. </li><li> Ensuite, en lançant un programme distinct LabVIEW, l&#39;échantillon est retiré dans la seringue vide, et déposé dans son tube correspondant de puits non-solvant (nanoparticules) ou vide (films) dans le porte-échantillon adjacent. </li><li> Ce procédé est effectué pour chaque composition de polymère discrète de la bibliothèque. </li><li> La nanoparticule ou de la bibliothèque de film est alors placé dans une chambre à vide pour l&#39;élimination du solvant et de non-solvant (la balance des nanoparticulesry peut aussi être récupéré par filtration sous vide). </li></ol> 3. À haut débit cinétique de libération de protéines <ol><li> Pour étudier haut débit cinétique de libération de protéines à partir d&#39;une bibliothèque polymère, un 96 profond jailli (2 ml / puits), plaque de polypropylène est modifiée de sorte que le 1/3 supérieur de la paroi du puits dans les colonnes voisines (ex: A et B, C et D, E et F, G et H) a été retirée pour se raccordent les puits. Les films de protéines chargées doivent être fabriqués dans des nanoparticules ou transférés dans cette plaque pour effectuer à haut débit libération études cinétiques. Échantillons de protéines chargé de nanoparticules ou de film ne doit être placé dans un puits des colonnes adjacentes (ex: A, C, E et G). Voir la figure 4 pour plus de détails. </li><li> Après le transfert des nanoparticules à la plaque à 96 libération profonde jailli, les particules peuvent se déposer. Tampon PBS (0,1 mM, pH 7,4) est ajouté lentement à chaque puits d&#39;échantillon (colonnes A, C, E et G), puis à chaque puits voisin (colonnes B, D, F et H) jusqu&#39;à ce que les puits sont pleins et le tampon est à écoulement libre entre les puits adjacents. Pour les nanoparticules, ce processus doit être effectué avec prudence pour s&#39;assurer que les particules restent au bas de l&#39;échantillon et colonnes (A, C, E et G) et non transférées dans la version attenante bien (colonnes B, D, F et H). Dans certains cas, la centrifugation est nécessaire pour localiser des échantillons de nanoparticules au fond du puits d&#39;échantillon (colonnes A, C, E et G). </li><li> Ensuite, la plaque de séparation est fermée par un couvercle et placé à la température souhaitée (par exemple 37 ° C) sous agitation pendant la durée de l&#39;expérience. </li><li> À certains moments supplémentaires (soit 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 et 30 jours) le montant des libérés conjugué à un fluorochrome protéine est quantifié à l&#39;aide d&#39;un Typhoon 9400 Scanner à plat fluorescent ( GE Healthcare). La plaque de libération est placé sur la surface du scanner, numériser à l&#39;aide du laser d&#39;excitation et d&#39;émission appropriés filters, et l&#39;intensité de la fluorescence de la protéine libérée dans le puits de sortie (colonnes B, D, F et H) est quantifiée (Quant image). Il est suggéré que les normes de protéines de concentrations connues être inclus dans la plaque et pour le calcul de la quantité de protéines et de comptabilité pour la trempe fluorochrome. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Lors de la fabrication de la bibliothèque de polymère, la caractérisation a été réalisée avec 1 H RMN, GPC, et FTIR pour valider cette méthode combinatoire 1,7,8,11. Moléculaire gamme de poids 10,000-20,000 g / mol, gammes indice de polydispersité de 1,5 à 3,0, et la composition chimique a été montré pour être précis et en accord avec les méthodes conventionnelles de 12-15 synthèse polyanhydride. De même, les images MEB des bibliothèques nanoparticules a montré une morphologie de surface similaire, la taille et distribution de taille que celle des nanoparticules fabriquées traditionnellement 2. Protéines communiqué kinetics à partir de nanoparticules de polyanhydride ou de films est effectué dans une plaque de puits à jour comme décrit précédemment 1. Les résultats ont révélé une libération d&#39;ordre zéro approximative avec ou sans une rafale dépend de la charge en protéines et chimie des polymères (figures 2 et 3) 1,12,14,16. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> Figure 1. Combinatoire film polymère et un appareil de fabrication de nanoparticules. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> Figure 2 haut-débit libération de Texas Red sérum albumine bovine (TRBSA) à partir d&#39;un CPH:. Bibliothèque SA nanoparticules de polymère. SA riches en chimies de polymère encapsulé TRBSA libérer le plus rapidement, alors que CPH-riches chimies de polymère libérer le plus lent. Les barres d&#39;erreur représentent écart typetion et n = 4. Reproduit avec la permission de Petersen et al. al. 1. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> Figure 3 à haut débit libération de Texas Red sérum albumine bovine (TRBSA) à partir d&#39;un CPTEG:. Bibliothèque CPH film polymère. CPTEG riches en chimies de polymère encapsulé TRBSA libérer le plus rapidement, alors que CPH-riches chimies de polymère libérer le plus lent. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart type et n = 3. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> Figure 4. Image montrant deux puits voisins &quot;avant&quot; et &quot;après&quot; modification de la plaque 96 en polypropylène profonde jailli. L&#39;image &quot;après&quot; modification de droite représente également l&#39;addition d&#39;un film polymère (en bas à gauche du puits) avec une molécule fluorescente encapsuléed&#39;être libéré entre les deux puits dans une solution tampon. La molécule libérée fluorescente est ensuite détectée dans le droit bien.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial%2Fhigh-throughput+methods+for+the+determination+of+polyanhydride+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior.</a> J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).</li>
<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Connaissance des conditions de synthèse nécessaires et les températures de transition vitreuse (Tg) des polymères étant synthétisés sont indispensables pour la fabrication de la bibliothèque. Si la Tg est inférieure à la température ambiante, l&#39;étape de fabrication de nanoparticules peuvent avoir besoin d&#39;être effectuée dans un environnement à température contrôlée en dessous de la T g des polymères. En outre, des précautions doivent être prises pour s&#39;assurer que tout le mat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Motorisée XYZ étape: 3x T-LSM050A, course 50 mm par axe </td><td> Technologies Zaber </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 Pompe à seringue unique </td><td> Nouveaux systèmes de pompage Era </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Rimless réutilisables Tubes de culture en verre </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> Cuves en verre </td><td> Stratégies scientifiques </td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> Seringues étanches aux gaz SGE, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96 DeepWell plaques 1,3 ml et 2,0 ml </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 278743 </td></tr><tr><td> Tapis de capitalisation ainsi </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 276000 </td></tr><tr><td> Typhoon 9400 </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td> Whatman Grade 50 cercles de 90 mm </td><td> Whatman </td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides sont une classe de biomatériaux avec une excellente biocompatibilité et les capacités d&#39;administration de médicaments. Même si elles ont été largement étudiés avec conventionnelle d&#39;un échantillon-à-la-fois des techniques de synthèse, une étude plus récente à haut débit approche a été développée permettant la synthèse et le test des grandes bibliothèques de polyanhydrides 1. Cela facilitera l&#39;optimisation plus efficace et processus de conception de ces biomatériaux pour la délivrance de médicaments et de vaccins. La méthode présentée dans ce travail décrit la synthèse combinatoire du film polyanhydride biodégradable et bibliothèques nanoparticules et la détection à haut débit de la libération de protéines à partir de ces bibliothèques. Dans ce procédé robot actionné (figure 1), des actionneurs linéaires et les pompes à seringue sont commandés par LabVIEW, qui permet à un protocole automatisé mains libres, ce qui élimine une erreur d&#39;utilisateur. De plus, cette méthode permet la fabrication rapide de bibliothèques polymères micro-échelle, rougepremière utilisation de la taille du lot tout en conduisant à la création de systèmes de polymères multivariée. Cette approche combinatoire pour la synthèse de polymères facilite la synthèse de jusqu&#39;à 15 différents polymères en une quantité équivalente de temps il faudrait pour synthétiser un polymère classique. En outre, la banque combinatoire de polymère peut être fabriqué dans des géométries vides ou protéine-chargé notamment des films ou des nanoparticules lors de la dissolution de la bibliothèque de polymère dans un solvant et précipitation dans un non-solvant (nanoparticules) ou par séchage sous vide (pour les films). Lors du chargement d&#39;une protéine conjugué à un fluorochrome dans les bibliothèques de polymères, cinétique de libération de protéines peut être évalué à haut débit en utilisant une méthode de détection basée sur la fluorescence (figures 2 et 3) comme décrit précédemment 1. Cette plate-forme combinatoire a été validé avec des méthodes conventionnelles 2 et le film polyanhydride et les bibliothèques des nanoparticules ont été caractérisées par <sup&gt; 1 H RMN et FTIR. Les bibliothèques ont été sélectionnés pour la cinétique de libération de protéines, de stabilité et d&#39;antigénicité, la toxicité cellulaire in vitro, la production de cytokines, marqueurs expression à la surface, l&#39;adhérence, la prolifération et de la différenciation et de biodistribution in vivo et mucoadhésion 1-11. La méthode combinatoire développée ici permet la synthèse de polymères à haut débit et la fabrication de protéines chargé de nanoparticules et de cinémathèques, qui peut, à son tour, être examinés in vitro et in vivo pour l&#39;optimisation de la performance biomatériau.

Cette méthode décrit la synthèse combinatoire du film polyanhydride biodégradable et bibliothèques nanoparticules et la détection à haut débit de la libération de protéines à partir de ces bibliothèques.

Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Les polyanhydrides sont une classe de biomatériaux présentant une excellente biocompatibilité et des capacités de libération de médicaments. Bien qu'ils aient fait l'objet d'études approfondies avec...

Ce vidéodécrit la synthèse combinatoire de bibliothèques de films et de nanoparticules en polyanhydride biodégradable, ainsi que la détection à haut débit de la libération de protéines à partir de ces bibliothèques. Premièrement, un dispositif automatisé de dépôt à haut débit est utilisé pour déposer un ensemble de monomères aux compositions variées dans des cuvettes en verre. Une réaction de polycondensation est réalisée à 180 degrés Celsius et 0,3 torr pendant 1,5 heure.Ces conditions de réaction sont spécifiques à la synthèse du polymère d'anhydride poly C-P-H-S-A. À l'aide de l'appareil de dépôt automatisé, le solvant et tous les composants destinés à l'encapsulation sont déposés dans les cuvettes contenant la bibliothèque de polymères. Une sonication peut être effectuée pour garantir la dissolution complète du polymère et une dispersion uniforme des composants supplémentaires.Ensuite, le polymère dissous est transféré dans un tube contenant un solvant non miscible afin de fabriquer la bibliothèque de nanoparticules par nanoprécipitation. Les nanoparticules sont récupérées par séchage sous vide ou par filtration, puis transférées dans une plaque modifiée de 96 puits libérée. Enfin, la bibliothèque chargée en protéine est incubée dans des conditions physiologiques et la cinétique de libération de la protéine est évaluée à l’aide d’une méthode de détection fluorescente par espace. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant la cinétique de libération des protéines en fonction des propriétés du polymère ou des conditions du milieu de libération. Le principal avantage de cette approche par rapport aux autres techniques conventionnelles analysant un échantillon à la fois réside dans la capacité à synthétiser simultanément plusieurs échantillons. Ces échantillons peuvent ensuite être criblés à haut débit afin d'étudier les interactions entre protéines, polymères, cellules et polymères hôtes.Cela accélère alors la conception et le développement rationnels de ces biomatériaux pour la délivrance de médicaments et le génie tissulaire. La Tricia Peterson, une post-doctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure. Dans cette section de la vidéo, un appareil de dépôt à haut débit Hyatt est utilisé pour déposer une bibliothèque de monomères à composition variable après la synthèse du polymère.Cet appareil est utilisé pour fabriquer une bibliothèque combinatoire de films polymères ou de nanoparticules vides ou chargés de protéines. La plateforme automatisée comprend deux pompes à seringue programmables et trois actionneurs linéaires connectés en série à un ordinateur. Un logiciel LabVIEW est utilisé pour envoyer des commandes aux pompes à seringue et aux actionneurs.Des seringues gast tight de 10 cc sont chargées dans les pompes à seringue avec des tubes capillaires en métal reliés par des raccords filetés, qui dispensent les solutions polymériques dans des cuvettes en verre. Dans cette démonstration, de l'acide seic ou SA sera utilisé avec un six Biss para oxy heane ou CPH pour créer une bibliothèque de nanoparticules encapsulant l'albumine sérique de bovin marquée Texas Red. Les instructions fournies dans cette vidéo et les documents accompagnants peuvent être adaptées pour fabriquer et tester une grande variété de bibliothèques de films polymériques et de nanoparticules.Pour synthétiser les bibliothèques, commencez par dissoudre chaque monomère et le chloroforme à une concentration finale de 25 milligrammes par millilitre dans un flacon en verre. Ensuite, chargez chaque solution dans une seringue étanche de 10 cc en aspirant la solution par l'extrémité munie du système de verrouillage de l'aiguille. Éliminez toutes les bulles d'air.Ensuite, fixez le tube capillaire en acier inoxydable muni d'un bouchon verrou résistant au solvant à l'extrémité de la seringue. Maintenez les tubes capillaires en place à l'aide de pinces fixées sur un support en anneau. Puis placez l'extrémité des deux tubes capillaires dans le réservoir de départ.Pour le dépôt du monomère. Placer les seringues sur les pompes à seringue programmables et les verrouiller en position dans le logiciel de visualisation en laboratoire. Régler les actionneurs linéaires sur la position initiale dans le logiciel.Commencer le dépôt automatisé des monomères SA et CPH dans les cuvettes en verre selon les axes x, y et Z. Des actionneurs positionneront correctement les tubes capillaires dans chaque cuvette et pomperont des volumes programmés de chaque monomère, créant ainsi une bibliothèque de monomères présentant une variabilité compositionnelle. Après le dépôt des monomères.Transférez la bibliothèque de monomères dans une étuve à vide préchauffée et incubez à 180 degrés Celsius et 0,3 torr pendant 1,5 heure afin de permettre la polymérisation par condensation. Après l'incubation, la fabrication de la bibliothèque de polymères est terminée. Ensuite, des nanoparticules polymériques chargées en protéines sont générées.Voir le protocole accompagnant la fabrication d'une bibliothèque de films polymères chargés en protéine pour la préparation d'une bibliothèque de nanoparticules chargées en protéine. Ajouter la protéine, dans ce cas l'albumine sérique bovine marquée par le rouge Texas, au solvant approprié, qui doit être capable de dissoudre la bibliothèque de polymères. Ici, le chlorure de méthylène est utilisé à une concentration de deux milligrammes par millilitre.Remplissez la seringue de 10 cm³ avec le solvant contenant l'albumine de sérum bovin marquée par le Texas Red et placez-la dans la première pompe à seringue. Ensuite, placez une seringue propre et vide de 2 cm³ dans la seconde pompe à seringue, puis positionnez les tubes contenant 15 millilitres d’un non-solvant, dans ce cas du pentane, dans le support de tubes adjacent à la plateforme des vials. Ensuite, dans le logiciel LabView, démarrez le processus automatisé de dépôt du solvant en sélectionnant le programme.Après le démarrage du programme, le solvant est déposé dans les cuvettes contenant la bibliothèque de polymères, ce qui donne une concentration de polymère de 20 milligrammes par millilitre. Une fois que tout le solvant a été déposé, laissez-le dissoudre le polymère pendant une à cinq minutes. Procédez ensuite à une homogénéisation facultative afin d'assurer une dissolution complète du polymère et une dispersion uniforme des protéines.Ensuite, lancez le programme de transfert des échantillons dans LabVIEW. Chaque échantillon de polymère dissous dans la bibliothèque est alors aspiré dans la seringue vide et distribué dans le tube correspondant contenant le solvant non solvant du porte-échantillons. Une fois que chaque échantillon a été transféré, récupérez les nanoparticules chargées en protéine en plaçant la bibliothèque de nanoparticules dans une chambre sous vide à 10 millimètres de mercure, ou en utilisant une filtration sous vide jusqu'à élimination du solvant.Pour étudier la libération de l'albumine sérique bovine (BSA) encapsulée, commencez par une plaque polypropylène profonde de 96 puits, modifiée en retirant la moitié supérieure du bord de chaque puits dans chaque colonne adjacente de la plaque. Le retrait de la partie supérieure de chaque puits entre les colonnes A et B, C et D, E et F, ainsi que G et H permet un écoulement de liquide entre chaque paire de puits adjacents lorsqu'ils sont remplis à pleine capacité. Ajoutez des étalons de BSA marquée au Texas Red, allant de 1000 à 10 microgrammes par millilitre, dans la plaque profonde de 96 puits.Ces éléments seront utilisés pour calculer la quantité de protéines et tiendront également compte de l'extinction du fluorochrome. Reconstituez la masse souhaitée de nanoparticules dans du tampon PBS, puis soumettez-les à une sonication afin de disperser uniformément les particules. Ensuite, transférez la bibliothèque de nanoparticules dans la plaque de 96 puits profonde et attendez que les échantillons se déposent au fond de la plaque. Puis, à l’aide d’une pipette, remplissez lentement tous les puits adjacents avec du tampon PBS jusqu’à un quart de pouce du bord supérieur du puits.Il doit y avoir suffisamment de tampon dans les puits adjacents pour permettre une circulation libre entre les puits. Ensuite, sceller la plaque de libération avec le couvercle et la placer à 37 degrés Celsius sous agitation. Pendant toute la durée de l'expérience, à des intervalles de temps réguliers, utiliser un scanner fluorescent plat Typhoon 9 400 pour numériser la plaque en utilisant les filtres d'excitation, de laser et d'émission appropriés.Après la numérisation, utilisez un logiciel de quantification d'images pour mesurer la quantité de protéine marquée au fluorochrome libérée dans chaque prélèvement. Dans cette étude, la BSA marquée au Texas Red a été encapsulée dans une bibliothèque de nanoparticules polymériques synthétisées à partir de monomères d'acide stéarique (SA) et de CPH, comme décrit dans cette vidéo, afin de déterminer la cinétique de libération des protéines en fonction de la chimie du polymère. Les nanoparticules chargées en protéine ont été incubées à 37 degrés Celsius pendant un mois, durant lequel des analyses fluorescentes ont été effectuées à des intervalles de temps réguliers afin de quantifier la libération de la protéine.Comme illustré ici, cette méthode à haut débit a été utilisée pour déterminer la cinétique de libération de la BSA marquée au Texas Red à partir d'une bibliothèque de nanoparticules en polyanhydride A-C-P-H-S-A. Des tendances dépendant de la chimie ont été observées, avec des taux de libération croissants pour les chimies de films de Sarin. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des dosages standards de quantification des protéines.Dans une expérience distincte, la libération de BSA Texas Red à partir de bibliothèques de films de polyanhydride CPH CPT a été évaluée ; comme indiqué ici, des cinétiques de libération proches d'un ordre zéro ont été observées, les films riches en cpeg libérant la protéine le plus rapidement, avec des applications potentielles dans le domaine médical en tant que dispositifs biodégradables de délivrance de médicaments. Ces résultats indiquent que le profil de libération souhaité d'un médicament thérapeutique ou d'un antigène vaccinal peut être contrôlé en modifiant la chimie du polymère. Suite à cette procédure, d'autres méthodes combinatoires ont été développées pour étudier des domaines tels que la stabilité des protéines, la toxicité cellulaire, l'activation cellulaire et la biodistribution InVivo.Ces aspects sont importants pour la conception rationnelle de biomatériaux destinés à la délivrance de médicaments et au génie tissulaire. N'oubliez pas de porter des équipements de protection individuelle adéquats et de respecter les procédures de laboratoire sécuritaires tout au long de ce protocole complet.

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