Name: Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de lovaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Découvrez un test in vitro utilisant des sphéroïdes de cancer de l'ovaire fluorescents et des monocouches mésothéliales pour modéliser les métastases précoces. La microscopie vidéo en time-lapse permet de quantifier l'invasion cellulaire.

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Nous tenons à remercier le Nikon Imaging Center à Harvard Medical School, en particulier des eaux Jennifer, Lara Petrak et Salmon Wendy, de formation et de l&#39;utilisation de leurs microscopes timelapse. Nous aimerions également remercier Rosa Ng et Achim Besser pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH 5695837 (à M. Iwanicki) et GM064346 à ACC; par une subvention de la Dre Miriam et Sheldon Adelson G. Medical Research Foundation (pour ACC).

1. Cancer de l&#39;ovaire Sphéroïde cellule Formation <ol><li> DP-exprimant les cellules cancéreuses de l&#39;ovaire sont cultivées dans un milieu de base de 10% (un milieu de culture de cellule personnalisé contenant un mélange 50:50 de 199 et MCDB105, inactivé à 10% sérum de veau fœtal et 1% stylo-streptococcique). Pour exprimer la demande de propositions non étiquetés cellules cancéreuses de l&#39;ovaire, transfecter les cellules avec un plasmide contenant DP et sélectionnez des cellules exprimant RFP. Alternativement, les vecteurs viraux peuvent être utilisés pour exprimer transitoirement protéines fluorescentes, ou des cellules peuvent être pré-incuber avec un rouge fluorescent cellule traqueur colorant (Invitrogen). </li><li> Avant de former des sphéroïdes cancer de l&#39;ovaire, il est nécessaire de préparer à faible adhérence 96 puits ronds plats culture sur le fond. Pour produire les plaques de culture à faible adhérence, 30μl poly-HEMA (6mg polyhydroxyéthylméthacrylate dans 1 ml à 95% EtOH) solution est ajoutée à chaque puits de 96 puits plat Corning culture cellulaire. Les plaques à 96 puits sont incubés dans une 37 ° C non humidifié incubateur pour évaporer l&#39;éthanol, le fait de laisser un film de poly-HEMA sur chaque puits. Ce film de poly-HEMA empêche les cellules de se fixer à la partie inférieure du puits, forçant les cellules à croître en suspension 18. [Sinon, Ultra-Low des plaques de culture de fixation (Corning) peut être utilisé à la place de la poly-HEMA plats revêtus.] </li><li> Après les plaques à faible adhérence des culture sont préparés, trypsiniser une plaque de cellules cancéreuses de l&#39;ovaire, les cellules à granules dans une centrifugeuse de paillasse (Heraeus) à 900 RCF pendant 3 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de base 10%. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Ajuster la concentration de ces cellules qu&#39;il ya 100 cellules par 50 pi de milieu de base de 10%. </li><li> Ajouter 50 pi de la suspension cellulaire diluée suspension uniforme dans chaque puits de la boîte de culture et 96 poly-HEMA couché. </li><li> Incuber la plaque à 96 puits dans une étuve à 37 ° C de culture cellulaire pendant 16 heures (cette quantité de temps doit être augmenté ou diminué en fonction de la quantité de temps nécessaire pour queune lignée cellulaire particulière pour former sphéroïdes multicellulaires ou souhaités conditions expérimentales) pour permettre aux cellules cancéreuses de l&#39;ovaire à se regrouper, former un sphéroïde multicellulaire unique dans chaque puits. Certaines cellules tumorales peuvent subir l&#39;apoptose au cours de cette période, il est donc important de choisir un moment avant l&#39;induction de l&#39;apoptose. </li></ol> 2. Mésothéliales Formation monocouche de cellules <ol><li> Dans une hotte de culture cellulaire, pré-enduire les puits d&#39;une à 6 puits à fond de verre plat MatTek avec de la fibronectine en ajoutant 2 ml d&#39;une fibronectine 5 pg / ml solution de PBS dans chaque puits de la parabole et l&#39;incubation à température ambiante pendant 30 minutes. La qualité optique du verre-fonds dans les plats MatTek permettre l&#39;imagerie haute résolution microscopique. </li><li> GFP-exprimant les cellules mésothéliales sont cultivées dans un milieu de base de 10%. Trypsiniser une plaque de cellules mésothéliales, ralentit dans une centrifugeuse de table (Heraeus) à 900rpm pendant 3 minutes, aspirer le surnageant, et remettre en suspension dans un milieu de base 10%. Lacellules mésothéliales utilisés ici ont été déjà exprimant la GFP quand ils ont été obtenus, mais non marqués cellules mésothéliales peut être produite par transfection avec un plasmide contenant la GFP ADNc, ou pré-incubation des cellules dans une cellule à fluorescence verte suiveur de colorant (Invitrogen). </li><li> Après l&#39;incubation fibronectine de 30 minutes (à l&#39;étape 2.1), laver les puits de la boîte de MatTek avec 2 ml de PBS. </li><li> Aspirer le PBS et la plaque 6 x10 5 cellules mésothéliales par puits dans chaque puits de la boîte de 6 puits MatTek. Incuber le plat MatTek dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit de culture cellulaire pour permettre aux cellules mésothéliales de joindre à l&#39;antenne et de former une monocouche. </li></ol> 3. Mésothéliales Assay élimination des cellules <ol><li> Utiliser une pipette pour recueillir les sphéroïdes cancer de l&#39;ovaire de la 96 puits poly-HEMA plaque revêtue. </li><li> Aspirer le milieu d&#39;un puits de la boîte de 6 puits contenant MatTek une monocouche de cellules mésothéliales. Laver une fois avec 2 ml de PBS. Ajouter tous les sphéroïdes de la 96 puits ptard pour un puits de la vaisselle MatTek (~ 3x le nombre de sphéroïdes qui vont être imagée pour tenir compte de l&#39;atterrissage sphéroïdes de la part de l&#39;antenne qui ne peuvent pas être imagée). </li><li> Placer le plat MatTek sur la scène d&#39;un microscope inversé à fluorescence à champ large capable d&#39;effectuer imagerie time-lapse pour la durée d&#39;au moins 8 heures. Utilisez une platine motorisée à des postes d&#39;images multiples dans le plat, avec de multiples événements intercalation sphéroïde, en une seule expérience. Nous utilisons un Nikon Ti-E inversé motorisé Widefield fluorescence time-lapse microscope avec système de mise au point parfaite et intégrée à faible [20x-0.75 ouverture numérique (NA)] agrandissement / NA différentiels de contraste d&#39;interférence (DIC) optique, un transilluminateur halogène Nikon à 0,52 NA longue distance de travail (GDL) condenseur, Nikon rapide (&lt;100 millisecondes le temps de commutation) filtres d&#39;excitation et d&#39;émission (GFP Ex 480/40, Em 525/50, DP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter rapide transmissibles question à deux volets à épifluorescence trajet de la lumière intelligentetres, un Nikon linéaire codé platine motorisée, un Hamamatsu ORCA-AG refroidi charge-coupled device (CCD), une chambre sur mesure microscope d&#39;incubation avec la température et le CO 2 de contrôle, Nikon NIS-Elements AR logiciel version 3, et un Table TMC isolation contre les vibrations. </li><li> Les sphéroïdes cellulaires de cancer ovarien se déposent au fond du plat et le joindre à la monocouche de cellules mésothéliales. Recueillir la GFP, RFP et les images de phase de 20 + sphéroïde / monocouche interactions, toutes les 10 minutes, pendant 8 heures. </li><li> Les sphéroïdes DP-exprimant cellulaires de cancer ovarien envahira dans la monocouche GFP cellule exprimant mésothéliale créant un trou dans la monocouche. Au bout de 8 heures, de mesurer la dimension des trous en traçant les trous noirs dans les images en utilisant un logiciel GFP éléments (ou un autre logiciel approprié tel que l&#39;image J). Normaliser la taille du trou de la taille initiale sphéroïde en divisant la dimension du trou à 8 heures par la taille de l&#39;ellipsoïde de l&#39;image correspondant au temps zéro DP. Dans cet exexemple, la taille du trou a été mesurée seulement une fois, mais elle peut être mesurée à plusieurs reprises tout au long de l&#39;expérience huit heures afin de mieux comprendre la dynamique de l&#39;intercalation. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Dans cet exemple, nous avons comparé la capacité de clairance mésothéliales OVCA433 sphéroïdes cellulaires de cancer ovarien qui ont atténué l&#39;expression de la taline-1 pour contrôler OVCA433 sphéroïdes. OVCA433 sphéroïdes de chaque groupe ont été ajoutées à un plat contenant MatTek ZT monocouches de cellules mésothéliales. Six sphéroïdes de chaque groupe ont été imagées toutes les 10 minutes pour huit heures (Figure 4, Film 3, Film 4). Les trous réalisés dans la monocouche par les sphéroïdes d&#39;épandage ont été mesurés et six positions de chaque groupe ont été en moyenne. La figure 4 montre que la zone de dégagement moyenne créée par sphéroïdes Tallinn knockdown 1 était significativement plus petite que la superficie moyenne créée par sphéroïdes de contrôle, ce qui suggère que taline est nécessaire pour le dédouanement mésothéliales par OVCA433 sphéroïdes cancer de l&#39;ovaire. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" /> Figure 1. Métastases du cancer de l&#39;ovaire. Tumeurs ovariennes primaires se développent soit à partir de l&#39;épithélium de surface de l&#39;ovaire ou des trompes de Fallope. Les cellules tumorales ou groupes se détachent de la tumeur primaire et de recueillir dans la cavité péritonéale. Les cellules tumorales peuvent alors se regroupent pour former des sphéroïdes multicellulaires. Sphéroïdes puis fixez les monocouches de cellules mésothéliales qui tapissent la cavité péritonéale. Les cellules mésothéliales sont exclus de dessous le sphéroïde cancer de l&#39;ovaire joint, permettant les sphéroïdes pour accéder à la membrane sous-sol sous-jacent. Film 1. Métastases du cancer de l&#39;ovaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">Cliquez ici pour voir le film</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" /> Figure 2. </strong&gt; ligne mésothéliales cellules de la surface de tissu péritonéal humaine et sont exclus de la sous implants cellulaires de cancer ovarien. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" /> Figure 3. Essai Dégagement mésothéliales. Cancer de l&#39;ovaire sphéroïdes sont formés par incubation 100 DP-exprimant cellules de cancer ovarien par puits dans une poly-HEMA revêtu 96 coupelle inférieure puits de culture ronde à 37 ° C pendant 16 heures. Poly-HEMA empêche les cellules de se fixer à la boîte de culture, les cellules permettant de rester en suspension et d&#39;adhérer les uns aux autres pour former une grappe unique par puits. Monocouches de cellules mésothéliales sont préparés en étalant 6x10 5 cellules mésothéliales par puits dans une fibronectine revêtu 6 puits plat MatTek et l&#39;incubation de la plaque à 37 ° C pendant 16 heures. Les sphéroïdes sont ensuite transférés à la boîte de MatTek avec la monocouche mésothéliales et les deux populations cellulaires sont imagées toutes les 10 minutes pour 8 heures en utilisant un Nikon Ti-E Inverted motorisé Widefield fluorescence time-lapse microscope et logiciels Elements. Movie 2. Essai Dégagement mésothéliales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">Cliquez ici pour voir le film</a> . <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" /> Atténuation Figure 4. De Talin une expression dans OVCA433 sphéroïdes diminue la capacité de clairance mésothéliales. OVCA433 sphéroïdes (rouge) avec et sans expression atténuée de taline 1 ont été autorisés à se fixer et envahir une monocouche ZT mésothéliales (vert). Les deux populations de cellules ont été imagées toutes les 10 minutes pour 8 heures en utilisant un Nikon Ti-E inversé motorisé Widefield fluorescence time-lapse microscope et un logiciel éléments. Le graphique montre que taline une atténuationdiminue significativement la clairance des cellules mésothéliales (parcelle quantile avec des barres vertes au moyen). Movie 3. Contrôle OVCA433 sphéroïdes (rouge) qui envahissent en une monocouche mésothéliales (vert). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">Cliquez ici pour voir le film</a> . Atténuation Movie 4. De Talin une expression dans OVCA433 sphéroïdes (rouge) diminue mésothéliales (vert) la capacité de clairance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">Cliquez ici pour voir le film</a> .

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le &quot;test Dégagement mésothéliales&quot; présentée ici utilise la microscopie time-lapse pour surveiller les interactions de sphéroïdes multicellulaires cancer de l&#39;ovaire et les monocouches de cellules mésothéliales, dans le détail spatial et temporel grande. Auparavant, plusieurs groupes ont utilisé des dosages 8-14 points de terminaison pour montrer que les cellules cancéreuses de l&#39;ovaire et de joindre à envahir des monocouches de cellules mésothéliales. Ce test est unique en ce qu&#39;elle ut...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> OVCA433 cellules ovariennes cancéreuses </td><td></td><td></td><td> Don de Dr. Dennis Slamon </td></tr><tr><td> ZT cellules mésothéliales </td><td></td><td></td><td> Cadeau du Dr Tan Ince </td></tr><tr><td> Milieu 199 </td><td> Gibco </td><td> 19950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> Cellule Applications Inc </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> FBS-inactivé par la chaleur </td><td> Gibco </td><td> 10082 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques à 96 puits </td><td> Corning Costar </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Polyhydroxyéthylméthacrylate (poly-HEMA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 192066-25G </td><td> Pour poly-HEMA solution dissoudre 6mg poly-HEMA poudre dans 1 ml de EtOH 95% </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111ACS200 </td><td> Diluer à 95% en 2 0 dH </td></tr><tr><td> Hotte de culture cellulaire </td><td> Nuaire </td><td> NU-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> De culture de tissu incubateur </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> incubateur pour le poly-HEMA plaques </td><td> Instruments Labline </td><td> Imperial III 305 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse de table </td><td> Heraeus </td><td> 75003429/01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 puits à fond de verre plat </td><td> MatTek Corp. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> Sigma </td><td> F1141-1MG </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Microscope Timelapse: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Nikon </td><td></td><td> Ti-E inversé motorisé fluorescence time-lapse microscope avec système de mise au point intégré Parfait </td></tr><tr><td> Lentille </td><td> Nikon </td><td></td><td> 20X-0.75 apeture numérique </td></tr><tr><td> Transilluminateur halogène </td><td> Nikon </td><td></td><td> 0,52 NA condenseur longue distance de travail </td></tr><tr><td> Filtres d&#39;excitation et d&#39;émission </td><td> Chroma filtres passe uniques dans le logement Nikon </td><td></td><td> GFP Ex 480/40, Em 525/50 DP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 </td></tr><tr><td> Transmissibles et Epifluoresce trajet de la lumière </td><td> Sutter </td&gt; <td></td><td> Volets Smart </td></tr><tr><td> Linéaire codé platine motorisée </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Refroidi caméra à dispositif à couplage de charge </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA-AG </td><td></td></tr><tr><td> Microscope chambre d&#39;incubation avec la température et le CO 2 de commande </td><td> custom-built </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tableau isolation des vibrations </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements </td><td> Nikon </td><td></td><td> Version 3 </td></tr></tbody></table>

test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Cancer de l&#39;ovaire est le cinquième cause de décès liés au cancer aux États-Unis 1. Malgré une réponse positive initiale à des thérapies, de 70 à 90 pour cent des femmes atteintes d&#39;un cancer de l&#39;ovaire développent des métastases nouvelles, et la récidive est souvent mortelle 2. Il est donc nécessaire de comprendre comment des métastases secondaires surviennent dans le but de développer de meilleurs traitements pour le cancer de l&#39;ovaire stade intermédiaire et tardive. Métastases cancer de l&#39;ovaire se produit lorsque les cellules malignes se détacher de la tumeur primaire et de diffuser dans toute la cavité péritonéale. Les cellules disséminées peuvent former des amas multicellulaires, ou sphéroïdes, qui soit rester seules, ou d&#39;implants sur les organes dans la cavité péritonéale 3 (Figure 1, Film 1). Tous les organes à l&#39;intérieur de la cavité péritonéale sont revêtues d&#39;un unique, continue, la couche de cellules mésothéliales 4-6 (figure 2). Cependant, les cellules mésothéliales sont absents de dessousmasses tumorales péritonéales, tels que révélés par les études d&#39;un microscope électronique excisées de l&#39;homme des coupes de tissus tumoraux 3,5-7 (Figure 2). Ceci suggère que les cellules mésothéliales sont exclus du dessous de la masse tumorale par un processus inconnu. Précédent dans des expériences in vitro ont démontré que des cellules primaires de cancer de l&#39;ovaire joindre plus efficacement à la matrice extracellulaire que de cellules mésothéliales 8, et des études plus récentes ont montré que les cellules mésothéliales péritonéales primaires fournissent effectivement un obstacle à l&#39;adhésion cellulaire et l&#39;invasion de l&#39;ovaire (par rapport à l&#39;adhérence et l&#39;invasion sur des substrats qui n&#39;ont pas été couverts avec des cellules mésothéliales) 9,10. Cela suggère que les cellules mésothéliales agir comme une barrière contre les métastases du cancer de l&#39;ovaire. Les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les cellules cancéreuses de l&#39;ovaire abus de cette barrière, et d&#39;exclure le mésothélium ont, jusqu&#39;à récemment, est resté inconnu. Nous décrivons ici ela méthodologie e pour un test in vitro que les modèles de l&#39;interaction entre les sphéroïdes cellulaires de cancer ovarien et les cellules mésothéliales in vivo (figure 3, Film 2). Notre protocole a été adapté à partir des méthodes décrites précédemment pour l&#39;analyse des interactions de cellules tumorales ovariennes avec des monocouches mésothéliales 8-16, et a d&#39;abord été décrite dans un rapport montrant que les cellules tumorales ovariennes d&#39;utiliser une activation de l&#39;intégrine-dépendante de la myosine et la force de traction afin de promouvoir l&#39;exclusion de la à partir de cellules mésothéliales en vertu d&#39;une tumeur 17 sphéroïde. Ce modèle tire parti de time-lapse microscopie à fluorescence pour surveiller les populations de cellules deux en temps réel, fournissant des informations spatiales et temporelles de l&#39;interaction. Les cellules cancéreuses ovariennes exprimer protéine fluorescente rouge (RFP), tandis que les cellules mésothéliales exprimer la protéine fluorescente verte (GFP). DP-exprimant sphéroïdes cellulaires de cancer ovarien joindre à la monocouche GFP-exprimer mésothéliales. La propagation sphéroïdes, envahir, etforcer les cellules mésothéliales côté créant un trou dans la monocouche. Ce trou est visualisée comme l&#39;espace négatif (noir) dans l&#39;image GFP. La superficie du trou peut alors être mesurée pour l&#39;analyse quantitative des différences dans l&#39;activité de contrôle et de jeu entre les populations expérimentales de cancer de l&#39;ovaire et / ou des cellules mésothéliales. Ce test ne nécessite qu&#39;un petit nombre de cellules cancéreuses de l&#39;ovaire (100 cellules par sphéroïdes X 20-30 sphéroïdes par condition), il est donc possible d&#39;effectuer ce test en utilisant des échantillons précieux primaires de cellules tumorales. En outre, ce test peut être facilement adapté pour le criblage haut débit.

Le dosage jeu mésothéliales décrite ici prend avantage des cellules marquées par fluorescence et la microscopie vidéo time-lapse de visualiser et de mesurer quantitativement les interactions de sphéroïdes multicellulaires cancer de l&#39;ovaire et les monocouches de cellules mésothéliales. Ce test modélise les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire.

Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire

Le cancer de l'ovaire est la cinquième cause principale de décès liés au cancer aux États-Unis1. Malgré une réponse initiale positive aux thérapies, 70 à 90...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la capacité des stéroïdes multicellulaires de cancer de l'ovaire à envahir une monocouche de cellules mésothéliales. Cela est réalisé en incubant d'abord des cellules de cancer de l'ovaire exprimant une protéine fluorescente rouge dans des plaques de culture à faible adhérence afin de former des stéroïdes multicellulaires. L'étape suivante consiste à ensemencer des cellules mésothéliales exprimant une protéine fluorescente verte dans des boîtes de culture à fond en verre revêtu de fibronectine afin de former des monocouches.La dernière étape consiste à transférer les sphéroïdes de cancer ovarien des plaques à faible adhérence vers les plaques contenant les monocouches de cellules mésothéliales. Enfin, une microscopie vidéo en fluorescence en enregistrement temporel est utilisée pour quantifier la capacité relative des sphéroïdes de cancer ovarien contrôles et expérimentaux à former un trou dans la monocouche mésothéliale.L'avantage principal de cette technique par rapport aux dosages classiques en point final est qu'une combinaison de cellules marquées par fluorescence et de microscopie vidéo enregistrée par intervalles est utilisée pour suivre en continu la dynamique de l'élimination mésothéliale. Avant la formation de phe de cancer ovarien, il est nécessaire de préparer des boîtes de culture rondes à 96 puits à faible adhérence. Pour fabriquer ces boîtes de culture, ajouter 30 microlitres de solution de poly-hema dans chaque puits d'une boîte de culture cellulaire à 96 puits.Incuber les plaques 96 puits dans une enceinte à 37 degrés Celsius non humidifiée pendant 24 à 48 heures afin d'évaporer l'éthanol, laissant un film de poly-héma sur chacun. Ce film de poly-héma empêche les cellules de s'attacher au fond du puits, forçant les cellules à croître en suspension. Les cellules de cancer de l'ovaire exprimant la protéine fluorescente rouge dans cette expérience sont cultivées dans un milieu basique à 10 %, un milieu de culture cellulaire personnalisé, lorsque les plaques de culture à faible adhérence sont prêtes.Le trypsine est une plaque de cellules cancéreuses ovariennes en commençant par laver la plaque avec du PBS, puis en ajoutant un millilitre de trypsine et en incubant la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir ajouté du milieu basique à 10 % pour inhiber la trypsine, transférer la suspension cellulaire dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres. Faire précipiter les cellules dans une centrifugeuse de table à 900 RCF pendant trois minutes, aspirer le surnageant et resuspendre les cellules dans du milieu basique à 10 %.Après avoir dénombré les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, ajustez la concentration des cellules à 100 cellules par 50 microlitres de milieu 10 % Base. Ajoutez 50 microlitres de la suspension cellulaire diluée et uniformément resuspendue dans chaque puits de la plaque de culture de 96 puits revêtue de poly-héma. Incubez la plaque de 96 puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 16 heures afin de permettre aux cellules de cancer de l’ovaire de s’agréger, formant un unique stéroïde multicellulaire par puits. Pour commencer cette procédure, prérecouvrez les puits d’une plaque MatTech à six puits avec fond en verre de fibronectine. Ajoutez deux millilitres de solution de fibronectine dans du PBS dans chaque puits de la plaque et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.Les cellules mésothéliales exprimant la protéine fluorescente verte servant à former une monocouche de cellules mésothéliales sont cultivées dans le milieu de base à 10 %. Traitez les cellules mésothéliales en plaques avec de la trypsine, puis centrifugez-les dans une centrifugeuse de table à 900 tr/min pendant trois minutes. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu de base à 10 %, puis ajustez la concentration souhaitée avec le milieu de base à 10 %. Une fois l'incubation de 30 minutes avec la fibronectine dans la boîte Mat Tech terminée, lavez les puits avec deux millilitres de PBS, aspirez le PBS, puis ensemencez six fois 10 à la puissance 5 cellules mésothéliales par puits dans chaque puits de la boîte Mat Tech à six puits.Incuber la boîte Mat Tech dans une étuve de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant la nuit afin de permettre aux cellules mésothéliales de s'attacher à la boîte et de former une monocouche. Pour commencer ce test, utiliser une pipette pour prélever le surnageant de cancer ovarien (PHE) à partir de la plaque poly-héma revêtue de 96 puits ; aspirer le milieu d'un puits de la boîte Mat Tech de six puits contenant une monocouche de cellules mésothéliales ; rincer une fois avec deux millilitres de PBS ; ajouter tout le PHE provenant de la plaque de 96 puits à un puits de la boîte Mat Tech. Cela représente environ trois fois le nombre de cellules stéroïdes qui seront observées, afin de tenir compte du fait que le PHE peut se déposer sur une partie de la boîte qui ne peut pas être visualisée.Étant donné que nous souhaitons visualiser un seul stéroïde par champ d'observation, il est essentiel d'éviter l'agrégation des stéroïdes. Secouez doucement la boîte de côté afin de répartir uniformément les stéroïdes sur la monocouche avant qu'ils ne s'attachent. Placez la boîte Mat Tech sur la platine d'un microscope à fluorescence inversé à champ large.Capable d'effectuer une imagerie en lapse de temps pendant une durée d'au moins huit heures. Utiliser une platine motorisée pour acquérir des images à plusieurs positions dans la boîte, avec plusieurs événements d'intercollation OID. Dans une même expérience, la cellule cancéreuse ovarienne PHE va sédimenter au fond de la boîte et s'attacher à la cellule mésothéliale.Le monolayer recueille toutes les 10 minutes pendant huit heures des images de G-F-P-R-F-P et de phases des interactions de plus de 20 sphéroïdes avec le monolayer. Dans le test d'élimination des cellules mésothéliales, la cellule cancéreuse ovarienne PHE exprimant le RFP envahit le monolayer de cellules mésothéliales exprimant la GFP, créant ainsi des trous dans le monolayer. La taille des trous est mesurée en délimitant les zones noires sur les images GFP à l’aide du logiciel Element ou d’un autre logiciel approprié tel qu’ImageJ. La taille du trou est ensuite normalisée par rapport à la taille initiale du sphéroïde, en divisant la taille du trou après huit heures par la taille du sphéroïde sur l’image RFP correspondante au temps zéro. Ce test d’élimination des cellules mésothéliales peut être utilisé pour comparer la capacité d’envahissement de sphéroïdes de cellules cancéreuses ovariennes ayant subi une modification génétique, afin d’élucider les mécanismes moléculaires par lesquels les sphéroïdes de cellules cancéreuses ovariennes éliminent les cellules mésothéliales.La monocouche mésothéliale dans cet exemple illustre la capacité d'élimination mésothéliale des cellules de cancer ovarien O VCA 4 33. Les PHE présentant une expression atténuée de Talon un ont été comparées à celles des O VCA 4 33 témoins. Les trous formés dans la monocouche par l'expansion des PHE ont été mesurés, et six positions de chaque groupe ont été moyennées.Comme le montre ce graphique, la surface moyenne de clairance créée par les stéroïdes avec abolition de Talon était significativement plus petite que la surface moyenne créée par les stéroïdes témoins, suggérant que Talon est nécessaire à la clairance mésothéliale par les cellules cancéreuses ovariennes OVCA 4 33. Ce film en accéléré montre un stéroïde rouge OVCA 4 33 témoin envahissant une monocouche mésothéliale verte. Ce prochain film en accéléré montre un stéroïde rouge OVCA 4 33 présentant une expression atténuée de Talon un, envahissant une monocouche mésothéliale verte.Par comparaison avec le film précédent, il est évident que l'atténuation de l'expression de Talon un dans les stéroïdes diminue la capacité d'élimination mésothéliale. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de suivre l'interaction entre les cellules cancéreuses ovariennes, les stéroïdes multicellulaires et les monocouches de cellules mésothéliales au fil du temps à l'aide de la microscopie vidéo en temps réel.

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Hétérotypique tridimensionnelle<em&gt; In Vitro</em&gt; Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de l&#39;initiation et la progression du cancer des ovaires

Dans cette vidéo, nous montrons le développement d’un modèle tridimensionnel in vitro de la muqueuse de la cavité péritonéale. Cette culture organotypique peut aider à étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des métastases du cancer de l’ovaire dans la muqueuse de la cavité péritonéale : une méthode pour établir un modèle 3D in vitro de la muqueuse péritonéale

Cette vidéo décrit une technique permettant de mesurer quantitativement l’interaction des sphéroïdes du cancer de l’ovaire avec les cellules mésothéliales, à l’aide de cellules marquées par fluorescence et d’une microscopie vidéo en accéléré. Cet essai in vitro modélise l’interaction entre les sphéroïdes des cellules cancéreuses de l’ovaire métastasantes et les cellules mésothéliales tapissant la cavité péritonéale in vivo.

Dosage de la clairance mésothéliale : une technique in vitro pour quantifier la capacité d’invasion des sphéroïdes du cancer de l’ovaire dans les monocouches de cellules mésothéliales

L'invasion des cellules de cancer ovarien dans la garniture de mésothéliales du péritoine est un processus dynamique dans le temps. Utilisant un véritable analyseur de temps, la capacité d'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire dans un modèle sphéroïde mésothélial co-culture de cellules peut être quantifié sur des périodes de temps prolongées, apportant des éclairages sur les facteurs régissant le processus métastatique.

Évaluation de Cancer de l&#39;ovaire Spheroid attachement et l&#39;invasion des cellules mésothéliales en temps réel

Nous décrivons un protocole qui met en œuvre des approches in vivo et ex vivo pour étudier la colonisation par le cancer de l’ovaire des tissus adipeux péritonéaux, en particulier de l’épiploon. De plus, nous présentons un protocole pour quantifier et analyser les structures cellulaires immunitaires de l’épiploon connues sous le nom de taches laiteuses, qui favorisent les métastases du tissu adipeux péritonéal.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

Les métastases du cancer de l’ovaire sont caractérisées par de nombreuses lésions intra-péritonéales diffuses, de sorte qu’il est difficile de quantifier visuellement avec précision la charge tumorale.  Nous décrivons ici une méthode de quantification in situ et ex vivo de la charge tumorale métastatique à l’aide de cellules tumorales marquées à la protéine fluorescente rouge (RFP) et de l’imagerie optique.

Quantification du commerce intra-péritonéale Cancer de l&#39;ovaire Métastase

Ici, nous présentons un protocole pour construire un modèle in vitro tridimensionnel de la muqueuse de la cavité péritonéale, composé de cellules mésothéliales humaines primaires et de fibroblastes superposés avec une matrice extracellulaire, comme outil pour étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des étapes précoces de cancer de l&#39;ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

Afin de clarifier le processus en plusieurs étapes de la dissémination peritoneale d'un carcinome de l'ovaire, l'étude actuelle présente un modèle expérimental murin du développement de la tumeur d'origine et métastases péritonéales par inoculation orthotopique avec ces cellules tumorales.

Murin modèle expérimental de tumeur de développement original et péritonéale Métastase<em&gt; via</em&gt; Orthotopique Inoculation avec des cellules de l&#39;ovaire Carcinome

Pour étudier la progression de la tumeur ovarienne dans un modèle physiologiquement pertinente, sphéroïdes multicellulaires ont été cultivées dans un microdispositif dans l'écoulement de fluide simulé. Ce modèle 3D dynamique émule l'environnement intrapéritonéale avec les composants cellulaires et mécaniques où les métastases du cancer de l'ovaire se produit.

Modélisation Comportement cancer de l&#39;ovaire multicellulaire Spheroid dans un Microdevice Dynamic 3D péritonéale

Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle tridimensionnel (3D) ex vivo de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. Le modèle fournit une plate-forme pour élucider les mécanismes pro-tumoraux dans la niche adipeuse et pour tester de nouvelles thérapies.

Un modèle ex vivo de métastases péritonéales du cancer de l’ovaire à l’aide d’un épiploon humain

Découvrez un test in vitro utilisant des sphéroïdes de cancer de l'ovaire fluorescents et des monocouches mésothéliales pour modéliser les métastases précoces. La microscopie vidéo en time-lapse permet de quantifier l'invasion cellulaire.

Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l'ovaire

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