Flux de travail d'étiquetage protéase et catalysée par un acide Embauche

Cette présentation démontre des protocoles pour le marquage isotopique stable de digestats protéiques et de peptides synthétiques en utilisant de l'eau enrichie en oxygène 18, dans un premier temps lors d'une expérience cinétique catalysée par une protéase dans des conditions de type paléontologique, en incubant le substrat et la protéase en présence d'eau enrichie à 50 % en oxygène 18 afin d'incorporer des atomes d'oxygène 18. Ensuite, lorsque la protéase est capable d'un double marquage, répéter l'incubation des produits de clivage post-digestion avec la protéase d'intérêt en présence d'eau enrichie à 50 % en oxygène 18.

Le protocole EO effectue l'incorporation catalysée par un acide d'atomes d'oxygène 18 dans des groupes fonctionnels à des intervalles de temps définis. Des aliquotes prélevées à différents moments sont déposées sur des plaques cibles recouvertes de matrice, puis analysées par spectrométrie de masse, ce qui permet d'obtenir des profils spectraux en fonction du temps pour les réactions de clivage des peptides, ainsi que des courbes d'incorporation de l'oxygène 18 pour chaque espèce peptidique. Les produits de clivage marqués sont ensuite sélectionnés pour une identification de séquence par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). En définitive, ces protocoles constituent des outils polyvalents pour des études protéomiques qualitatives et quantitatives.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les protéases, telles que l'identification de la vitesse, des étapes limitantes et des intermédiaires réactionnels dans des voies protéolytiques complexes. Les signatures protéolytiques identifiées par le suivi temporel paléo fournissent des informations importantes concernant la spécificité du substrat. En outre, les minuteries des données utilisent également des informations cinétiques.

Un postdoctorant de mon laboratoire va maintenant démontrer la procédure. Le protocole chronologique paléo permet de surveiller la dynamique des réactions de clivage protéolytique basées sur l'incorporation d'oxygène 18 catalysée par une protéase. Pour la réaction de 20 µL, ajoutez les peptides échantillons au tampon de réaction de protéase contenant de l'eau enrichie en oxygène 18. Mélangez 0,5 µL du mélange réactionnel avec 0,5 µL de matrice sur une plaque cible Maldi 384 spots Opti, puis laissez sécher les gouttelettes de solvant à température ambiante. Pendant ce temps, divisez le mélange réactionnel en deux tubes.

Témoin et échantillon pour le tube d'échantillon. Ajouter la protéase d'intérêt et incuber à la température recommandée pour la réaction enzymatique. Ajouter aux points temporels spécifiés.

Prélève un aliquot de 0,5 microlitre pour le mélanger à 0,5 microlitre de matrice, puis dépose-le sur la plaque à cibles multiples. Poursuis l’analyse de la dynamique de la réaction par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS, comme décrit plus loin dans ce protocole de marquage post-digestion. Les produits comme la trypsine catalysent la réaction d’échange d’oxygène carboxyle afin d’incorporer l’oxygène-18. Après avoir réalisé une digestion protéique sans marquage à l’oxygène-18, fais passer les produits de clivage à travers une colonne centrifuge pep clean C18 afin d’éliminer les activités protéasiques résiduelles.

Ensuite, resuspendre les échantillons dans 20 microlitres de tampon de réaction de la trypsine contenant de l'eau enrichie en oxygène 18. Prélever une aliquote de 0,5 microlitre et mélanger avec un volume égal de matrice. Puis déposer sur une plaque cible MALDI Opti-Off 384 et laisser sécher à l'air.

Ensuite, diviser la solution de réaction entre des tubes témoins et des tubes d'échantillon pour le tube d'échantillon. Ajouter la trypsine et incuber à 37 degrés Celsius. Pour suivre la réaction, prélever un aliquot de 0,5 microlitre.

Mélanger avec 0,5 microlitre de matrice et déposer sur une plaque de maltar. Analyser la dynamique de cette réaction d'échange d'oxygène carboxyle par analyse Maldi Toof MSM S. Le protocole cinétique IEO repose sur les réactions d'échange d'oxygène carboxyle catalysées par un acide, concernant les groupes latéraux et terminaux acides des peptides.

Incubez d'abord 50 nanomolaires de peptides individuels avec de l'eau enrichie en oxygène 18 en rapport un-à-un, en présence ou en absence d'acide trichloroacétique à 0,1 %, en prélevant des aliquotes de 0,5 microlitre du mélange réactionnel chaque jour pendant 48 jours, puis déposez-les directement par co-dépôt avec la matrice sur une plaque cible MALDI. Soumettez régulièrement la plaque cible MALDI à une analyse des produits par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS. Cette section est décrite en détail dans le manuscrit accompagnant.

Tout d'abord, acquérez des spectres MS en mode ion positif en triple exemplaire. Après avoir étalonné le multipl et configuré l'acquisition MS, enregistrez des tirs simples pour les sous-spectres. Ensuite, exportez les fichiers de données MS à partir du logiciel d'acquisition de données Explorer de la série 4 000.

Ensuite, importer dans un système d'information interne qui utilise le logiciel Mascot Distiller pour le traitement des spectres et la détection des pics. Déconvoluer les enveloppes isotopiques et déterminer automatiquement les rapports d'incorporation de l'oxygène 18 ; noter les rapports d'incorporation de l'oxygène 18 comme les contributions relatives des espèces isotopiques individuelles du peptide à l'enveloppe isotopique complète. Filtrer la liste des bins et regrouper au moins trois valeurs à une largeur de masse de 100 ppm pour chaque expérience cinétique.

Extraire les masses moléculaires de toutes les espèces peptidiques détectées à partir des fichiers de données de spectrométrie de masse associés. Utiliser maintenant X pacey pour définir un ensemble de peptides avec une tolérance d'erreur de masse de 200 PPM. Comparer la liste des masses obtenues aux données des produits de clivage protéolytique prédits à partir de la séquence peptidique du substrat.

Procédez à l'acquisition de spectres msms pour toutes les valeurs de masse des produits de clivage prédits par l'outil find pep et pour les valeurs de bin ayant une incorporation d'oxygène 18 associée. Collectez les données MSM S de 50 tirs selon un motif aléatoire par sous-spectre, avec jusqu'à 40 sous-spectres par spot, puis exportez les fichiers msms. Ensuite, exportez les fichiers de données MSM S vers le système d'analyse pour la détection des pics et les listes de pics MSM S associés aux données de spectrométrie de masse correspondantes afin de l'identification des peptides.

Définissez ces paramètres de recherche dans le moteur de recherche Mascot : aucune spécificité enzymatique, tolérances de masse de 150 PPM pour l'ion précurseur et de 0,2 Dalton pour les ions fragments. Recherchez les listes M-S-M-S-P dans la base de données Swiss-Prot. Les identifications des peptides peuvent être en outre validées à l'aide d'un logiciel d'exploration de données en confirmant les profils caractéristiques d'incorporation d'oxygène 18 sur l'ensemble des ions fragments pour les tracés temporels du spectre.

Exporter les fichiers de données de spectrométrie de masse pour chaque point temporel de réaction à partir du logiciel d'exploration de données vers des fichiers ASCI à l'aide d'une macro. Importer ensuite les fichiers dans un logiciel d'analyse et de représentation graphique, puis les afficher sous forme de diagrammes en cascade afin de créer des courbes d'incorporation de l'oxygène 18 pour chaque courbure. Pour le produit de clivage du peptide, extraire les contributions relatives des différentes espèces isotopiques du peptide à tous les points temporels de la réaction, puis les représenter en fonction du temps.

Les graphiques spectraux en fonction du temps, comme celui-ci, affichent la dynamique des réactions de clivage protéolytique. Cette expérience analyse le clivage du peptide bioactif endo et C par l'enzyme de conversion endothéliale 1. Une disposition en cascade représente les spectres de masse des expériences cinétiques afin de surveiller simultanément la dégradation du substrat et l'apparition des produits intermédiaires et finaux.

Les produits de clivage sont identifiés par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) et par les signatures caractéristiques de l'incorporation d'oxygène 18 dans leurs profils isotopiques. Ce mécanisme réactionnel de la trypsine indique que les protéases sérine catalysent l'incorporation d'au plus deux atomes d'oxygène 18 dans les produits de clivage peptidique. Dans le protocole de marquage fondé sur les protéases, la réaction de clivage de la liaison peptidique entraîne un taux d'incorporation de 50 % d'un seul atome d'oxygène 18 pour les produits de clivage peptidique fraîchement générés ; les protéases comme la trypsine, qui se lient à nouveau aux produits de la réaction, catalysent davantage l'incorporation d'un second atome d'oxygène 18 par l'intermédiaire de la réaction d'échange des oxygènes carboxyles.

À l'équilibre, le marqueur oxygène 18 est réparti selon un ratio de un sur deux sur un entre les produits non marqués, simplement marqués et doublement marqués. Dans le protocole de marquage préalable des extrémités protéolytiques, aucune clivure de liaison peptidique n'intervient. Au lieu de cela, l'incorporation d'au maximum deux atomes d'oxygène 18 repose exclusivement sur la réaction d'échange des oxygènes carboxyles.

Par conséquent, l'incorporation de l'oxygène 18 ne se produit que chez les protéases qui se lient à nouveau à leurs produits de clivage peptidiques. Le marquage à l'oxygène 18 catalysé par l'acide conduit à l'incorporation de deux atomes d'oxygène 18 par groupe carboxyle. Au cours de cette expérience, les décalages de masse multiples de deux Daltons de l'enveloppe isotopique de l'angiotensine I peuvent être cartographiés par l'absorption d'atomes d'oxygène 18.

En combinant le marquage par OPE et la spectrométrie de masse à haute résolution de manière chronorésolue, la méthode de suivi temporel paléo permet une analyse dynamique de la formation des produits peptidiques. Ce test peut être utilisé pour produire des peptides marqués topiquement stabilisés destinés à des études protéomiques qualitatives et quantitatives, ainsi que pour évaluer la cinétique de formation des peptides Protopic.

Le suivi temporel paléo est conçu pour évaluer les voies protéolytiques dans des conditions physiologiquement pertinentes. Cette technique a ouvert la voie à notre récente étude des processus lytiques dans les microenvironnements tumoraux humains.