Name: Flux de travail détiquetage protéase et catalysée par un acide Embauche 18 O enrichi en eau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Découvrez les flux de travail d'étiquetage isotopique stable des peptides par l'eau enrichie en 18O, incluant les méthodes assistées par protéase et catalysées par acide pour la spectrométrie de masse.

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Les présentées Léo-workflows permettent l&#39;étiquetage des isotopes stables de protéines et de peptides synthétiques digère. Ces expériences suivies dans le temps (figure 1) sont applicables aux études comparatives et quantitatives protéomique ainsi que la recherche de protéase. Chaque flux de travail se compose de deux étapes expérimentales (figure 2): A) Le temps d&#39;échantillonnage résolu de l&#39;respectif 18 O-isotope stable codé réaction (protéase catalysée par clivage du peptide; protéase réaction catalysée par l&#39;échange d&#39;oxygène carboxyle; catalyse acide échange d&#39;oxygène carboxyle réaction) et B) l&#39;analyse par spectrométrie de masse et la représentation graphique de 18 O à la constitution cinétique. Les expériences TimeCourse A. I. paléo-TimeCourse: Protéase catalysée par l&#39;étiquetage des clivages protéolytiques <ol><li> (Facultatif) liaisons disulfure des protéines (10 uM) et des peptides (250 uM) sont réduites avec la TNT (concentration finale 2,5 mM)dans 25 mM de NH 4 HCO 3 (tous deux fraîchement préparé) par incubation pendant 30 min à 50 ° C. </li><li> (Facultatif) cystéines libres sont alkylés avec iodoacétamide (concentration finale 10 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 par incubation pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Selon la protéase d&#39;intérêt, protéines / peptides solutions doivent être nettoyés pour éliminer le tampon résiduel et l&#39;agent d&#39;alkylation. Utilisez PepClean colonnes C-18 spin (Thermo) pour le nettoyage des peptides et Vivaspin concentrateurs centrifuges (Sartorius) pour échanger les tampons pour les échantillons de protéines. </li><li> Redissoudre / peptides / protéines change dans 20 pl de tampon réactionnel protéase (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; trypsine: 25 mM de NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenant 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Prélever un échantillon au temps zéro point avant l&#39;ajout de la protéase: Mélanger 0,5 ul du mélange réactionnel et 0,5 ul alpha cyano-4-hydroxycinnamiqueacide matrice (10 mg / ml dans l&#39;acétonitrile 50%, TFA 0,1%). Place sur un échantillon Opti-TOF plaque 384 cible MALDI (AB SCIEX) et de laisser les gouttelettes de solvant à température ambiante jusqu&#39;à sec (environ 5 min). </li><li> Diviser la solution de réaction en deux parties aliquotes. La première partie aliquote va être mis à incuber avec la protéase d&#39;intérêt (ECE-1: 75 nM; trypsine: 0,04 nM) à la température ambiante ou la température recommandée pour l&#39;enzyme particulière. La seconde partie aliquote seront incubés sans protéase et servira d&#39;échantillon témoin. La première aliquote représente un échantillon standard pour la protéase catalysée par 18 O-étiquetage et peut être utilisé pour l&#39;identification des peptides et des protéines, la détection des activités protéolytique et le suivi des réactions de clivage protéolytique. La seconde aliquote est utilisée pour montrer que 18 O-incorporation est induite par la protéase, par conséquent, ni étiquetage ni clivage est prévu pour cet échantillon. </li><li> Suivez la réaction en retirant des aliquotes de réaction et de les repérer comme described à l&#39;étape 5 à intervalles de temps qui lui semble approprie. Les conditions de réaction décrites ci-dessus sont utilisés pour surveiller une réaction protéolytique pour un maximum de quatre jours (environ 24 places). Commencer l&#39;échantillonnage toutes les 5 min jusqu&#39;à 30 min, puis repérer toutes les 30 minutes jusqu&#39;à 2 heures, puis toutes les heures jusqu&#39;à 8 heures et 8 heures, jusqu&#39;à ce que tous les 4 jours. Produits de clivage doit apparaître dans les premières 12 heures et le substrat doit être complètement hydrolysé après 24 heures. De longues périodes d&#39;incubation de réaction permettent de définir les produits de réaction stables qui sont discrets à partir d&#39;intermédiaires de réaction, qui sont ensuite transformés. Selon question de recherche et de données enzyme-substrat paires, les temps de repérage et de la température d&#39;incubation doivent être modulée pour assurer l&#39;échantillonnage de réaction optimale. </li><li> Après le point final de réaction est repéré temps ou entre les intervalles prolongés de repérage, la plaque cible MALDI est soumis à MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous (section B). </li></ol> II. Paléo-TimeCourse: Postdigétiquetage estion des terminaisons protéolytiques <ol><li> (Facultatif) liaisons disulfure des protéines (10 uM) et des peptides (250 uM) sont réduites avec la TNT (concentration finale 2,5 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 (tous deux fraîchement préparé) par incubation pendant 30 min à 50 ° C. </li><li> (Facultatif) cystéines libres sont alkylés avec iodoacétamide (concentration finale 10 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 par incubation pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> En fonction de la protéase d&#39;intérêt, protéines / peptides solutions doivent être nettoyés pour éliminer le tampon résiduel et l&#39;agent d&#39;alkylation. Utilisez les colonnes PepClean C-18 de spin pour le nettoyage des peptides et Vivaspin concentrateurs centrifuges pour l&#39;échange de tampon protéique. </li><li> Redissoudre / échanger les produits nettoyé jusqu&#39;à peptides / protéines dans 20 ul de tampon de réaction de protéase (par exemple la trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) et digérer avec une protéase d&#39;intérêt à terme (par exemple la trypsine: 0,04 nM, 37 ° C, 12 h). </li><li> Produits de clivage de nettoyage avec des colonnes PepClean C-18 spin. Cette étape mettra fin aux activités de protéases résiduelles. </li><li> Redissoudre / échanger les produits peptidiques nettoyé dans 20 pl de tampon réactionnel protéase (trypsine: 25 mM de NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenant 1:1 (v / v) final H 2 18 O. </li><li> Prélever un échantillon au temps zéro point avant l&#39;addition d&#39;enzyme: Mélanger 0,5 ul du mélange réactionnel et 0,5 ul matrice de l&#39;acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (10 mg / ml dans 50% d&#39;acétonitrile, TFA à 0,1%). Tache d&#39;échantillon sur une plaque cible MALDI et laisser les gouttelettes de solvant à température ambiante jusqu&#39;à sec (environ 5 min). </li><li> Diviser la solution de réaction en deux parties aliquotes. La première partie aliquote seront incubées avec la protéase d&#39;intérêt (par exemple la trypsine: 0,04 nM) à la température ambiante ou la température recommandée pour l&#39;enzyme particulière. La seconde partie aliquote seront incubés sans protéase et servira de contrôle. La premièrealiquote représente un échantillon standard pour la protéase catalysée par 18 O-postdigestion étiquetage et peuvent être utilisées pour la quantification de protéines et peptides. La seconde aliquote est utilisée pour montrer que 18 O-incorporation est catalysée par la protéase, par conséquent, aucun étiquetage n&#39;est prévu pour cet échantillon. </li><li> Suivez la réaction en retirant des aliquotes de réaction et de repérer les comme décrit dans l&#39;étape 7.) À des intervalles de temps qui lui semble approprie. Par exemple, nous avons repéré un premier temps toutes les 5 min jusqu&#39;à 30 min toutes les 15 min et ensuite pour surveiller la réaction de l&#39;oxygène carboxyle échange catalysée par la trypsine. </li><li> Après le point final de réaction est repéré temps ou entre les intervalles prolongés de repérage de la plaque cible MALDI est soumis à MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous (section B). </li></ol> III. Aleo-TimeCourse: acide catalysée par l&#39;étiquetage des groupes carboxyle <ol><li> Incuber peptides individuels (50 nm) avec 1:1 (v / v) 18 O-eau enrichie en til présence ou l&#39;absence (témoin) de 0,1% (v / v) d&#39;acide trifluoroacétique finale (volume total 30 pi). </li><li> Les produits de réaction d&#39;échantillon par jour pendant 48 jours par co-spotting une aliquote de 0,5 ul du mélange avec 0.5μl de matrice d&#39;acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique (10 mg / ml dans l&#39;acétonitrile 50%, TFA 0,1%) directement sur une cible MALDI plaque. </li><li> Entre les intervalles de repérage et après avoir repéré le point de temps de réaction finale soumettre plaque cible MALDI pour MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous à la section B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Acquisition et analyse des données <ol><li> Les spectres de masse sont acquis sur une 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Avant l&#39;analyse, l&#39;instrument est étalonné avec un mélange de normes peptidiques (Mass Kit normes pour l&#39;étalonnage d&#39;AB SCIEX TOF / TOF instruments) avec une tolérance d&#39;erreur maximale de mesure de masse de ± 50 ppm et un nombre minimal de six sommets de match. </li><li> Spectres SM (gamme de masse400 - 4.000 m / z) sont acquises en triple en utilisant le mode ions positifs, avec une intensité laser réglable (3.400 - 3.800; taille de pas de 50) avec une plage d&#39;intensité de crête de base acceptable de 2.000 - 45.000. Plans simples sont acquis pour les sous-spectres, avec 400 coups total / spectre, arrêtez conditions entreront en vigueur après 800 sous-spectres sont acquis (réussite ou échec) ou 400 sous-spectres critères d&#39;acceptation de passe. Dans le cas d&#39;échantillons à faible abondance ou en présence de complexes de milieux biologiques de l&#39;extrémité inférieure de la plage de détection MS doit être porté à 800 m / z. En outre, il peut être nécessaire d&#39;enlever le sel et d&#39;autres composés qui interfèrent avec une étape de nettoyage échantillon comme décrit plus haut ou par séparation LC. </li><li> MS fichiers de données (. T2D fichiers) sont exportés à partir du logiciel 4000 Series Explorateur d&#39;acquisition de données et importés dans notre propre système d&#39;information de laboratoire, qui utilise le logiciel Distiller MASCOT (Matrix Science) pour le traitement spectrale et la détection de pointe. Enveloppes isotopiquessont déconvolué et 18 O à la constitution des ratios déterminés automatiquement par un algorithme similaire à celle décrite par Mason et al. 12 et adapté par notre groupe 9. Alternativement, des outils logiciels tels que ZoomQuant 13 et Viper 14, ainsi que logiciels commerciaux tels comme BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) et Mascot Distiller quantification Boîte à outils (Matrix Science) peut déconvoluer 18 O des données de type 15,16. 18 O à la constitution ratios sont exprimés en des contributions relatives des différentes espèces isotopiques peptidiques (par exemple, des peptides, contenant 16 O, 18 O 18 O ou 1 2) à l&#39;ensemble de l&#39;enveloppe isotopique. </li><li> Pour chaque expérience TimeCourse, les masses moléculaires ([M + H] +) pour toutes les espèces de peptides détectés sont extraites à partir des fichiers de données associés MS et les valeurs mis en cellule à une largeur de 100 ppm en masse. </li><li> Au moins trois [M + H] + sont configurés pour être tenus de remplir un bac. Dans le cas de substrats connus, la liste bin filtré est comparé à une liste de produits de clivage protéolytique prédite à partir de la séquence du peptide substrat en utilisant l&#39;outil ExPASy FindPept 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) et un 200 ppm en masse acceptation tolérance aux erreurs. </li><li> Spectres MS / MS sont acquis pour toutes les valeurs de masse de produits de coupure par l&#39;outil prédites et des valeurs FindPept bin qui ont 18 O-incorporations qui leur sont associés. MS / MS sont acquises sur le 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer dans le réflecteur d&#39;ions 1kV mode positif, avec une intensité laser fixe de 4200 et CID-gaz en mode hors tension. 50 tirs sont acquis selon un schéma randomisé par sous-spectres pour un total de 40 sous-spectres par endroit (ce qui donne un total de 2.000 coups / place). </li><li> MS / MS des fichiers de données (. T2D fichiers) sont exportés à partir de l&#39;Explo 4000 Seriesrer le logiciel d&#39;acquisition de données et importés dans notre propre système d&#39;information de laboratoire, les pics sont détectés et MS / MS listes de pics sont associés avec les données correspondantes MS regroupées par casiers. </li><li> Pour l&#39;identification des peptides, MS / MS listes de pointe lancer une recherche dans la base de données SwissProt en utilisant le moteur de recherche MASCOT avec les paramètres de recherche suivants: pas de spécificité de l&#39;enzyme, 150 ppm ion précurseur et 0,2 Da tolérances de fragments d&#39;ions de masse. </li><li> Identifications peptidiques peuvent en outre être validée à l&#39;aide du logiciel Data Explorer (AB SCIEX) en confirmant les 18 caractéristiques O-incorporation tendances entre ions fragments série Y telle que décrite par Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Préparation du Temps spectrale et 18 O à la constitution Parcelles Parcelles de temps spectrales: MS fichiers de données (. T2D fichiers) pour chaque point de temps de réaction sont exportés à partir du logiciel Data Explorer en mode ASCII des fichiers en utilisant unmacro importés dans une analyse de données et un logiciel graphique (par exemple, en OriginLab origine) et affichés sous forme de tracés cascade (figure 3). 18 O à la constitution des parcelles: Pour chaque produit clivage du peptide mis en cellule, les contributions relatives des différentes espèces isotopiques (16 O peptidiques, 18 ou 18 O 1 O 2) sont extraits dans tous les points dans le temps de réaction et en fonction du temps (figure 4).

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

En combinant l&#39;étiquetage des isotopes stables et la spectrométrie de masse à haute résolution dans un temps résolu manière, la méthode paléo-TimeCourse permet une analyse dynamique de la production de produits peptidiques. Le test peut être utilisé pour générer des peptides marqués par des isotopes stables pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives pour évaluer la cinétique de peptides qui protéotypiques sont générés. En outre, le Paléo-TimeCourse est conçu pour évaluer voies protéolytiques dans des...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du matériau </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Colonnes PepClean C-18 Spin </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF plaque 384 cible MALDI </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Matériaux <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Alpha cyano-4-hydroxycinnamique </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Dithiothréitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacétamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> L&#39;endothéline-1 converting enzyme (CEE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Or la trypsine </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Eau-18 O, 97% atomique 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Kit de masse pour l&#39;étalonnage des normes AB SCIEX TOF / TOF instruments </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs

flux de travail d&#39;étiquetage protéase et catalysée par un acide embauche<sup&gt; 18</sup&gt; o enrichi en eau

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Les isotopes stables sont des outils essentiels pour la spectrométrie de masse biologique. Historiquement, 18 O-isotopes stables ont été largement utilisées pour étudier les mécanismes catalytiques des enzymes protéolytiques 1-3. Avec l&#39;avènement de la spectrométrie de masse à base de protéomique, l&#39;incorporation enzymatique catalysée de 18 atomes d&#39;oxygène de l&#39;eau isotopiquement enrichi stable est devenue une méthode populaire de comparer quantitativement les niveaux d&#39;expression de protéines (revue par Fenselau et Yao 4, Miyagi et Rao 5 et Ye et al. 6). 18 O-étiquetage constitue une alternative simple et peu coûteuse aux produits chimiques (par exemple iTRAQ, ICAT) et métaboliques (par exemple les techniques de marquage SILAC) 7. En fonction de la protéase utilisée, 18 O-étiquetage peut conduire à la prise en compte d&#39;un maximum de deux atomes d&#39;oxygène 18 dans le groupe carboxyle C-terminal du produit de clivage 3 </sup&gt;. La réaction de marquage peut être subdivisé en deux processus indépendants, le clivage liaison peptidique et la réaction de l&#39;oxygène carboxyle échange 8. Dans notre Paléo (p-rotease un e ssisted l Abeling mploying 18 O de l&#39;eau enrichie) l&#39;adaptation des enzymatique 18 O-étiquetage, nous avons utilisé 50% 18 O de l&#39;eau enrichie pour produire des signatures isotopiques distinctes. En combinaison avec haute résolution assistée par matrice ionisation par désorption laser à temps de vol tandem spectrométrie de masse (MALDI-TOF/TOF MS / MS), les enveloppes des isotopes caractéristiques peuvent être utilisées pour identifier des produits de clivage avec un degré élevé de spécificité. Nous avons précédemment ont utilisé le paléo-méthodologie pour détecter et caractériser les protéases endogènes 9 et surveiller les réactions protéolytiques 10-11. Depuis Paléo code l&#39;essence même de la réaction de clivage protéolytique, le dispositif expérimental est enri simple et biochimiqueétapes chment de produits de clivage peut être contournée. Le paléo-méthode peut facilement être étendue à (i) des expériences suivies dans le temps qui surveillent la dynamique des réactions de clivage protéolytique et (ii) l&#39;analyse de la protéolyse dans des échantillons biologiques complexes qui représentent des conditions physiologiques. Paléo-TimeCourse expériences permettent d&#39;identifier les étapes de traitement de limitation de vitesse et les intermédiaires de réaction à complexes réactions protéolytiques voie. En outre, la paléo-réaction nous permet d&#39;identifier des enzymes protéolytiques telles que la trypsine sérine-protéase qui est capable de relier ses produits de clivage et de catalyser l&#39;incorporation d&#39;un 18 second joint atome. Ces «double étiquetage&quot; enzymes peuvent être utilisées pour postdigestion 18 O-étiquetage, dans laquelle les peptides sont exclusivement marqués par la réaction d&#39;échange d&#39;oxygène carboxyle. Notre troisième stratégie s&#39;étend étiquetage employant 18 O de l&#39;eau enrichie au-delà des enzymes et utilise conditions de pH acide à introduire 18 Signe isotope O-stablepératures en peptides.

Nous avons utilisé le flux de travail paléo-TimeCourse de surveiller dynamiquement l&#39;incorporation de 18 S-isotopes stables dans les produits de clivage de peptides générés par des enzymes protéolytiques. L&#39;approche présentée est un outil polyvalent pour étudier les voies relativement traitement protéolytique de substrat différent et les combinaisons de protéase. En échantillonnant les réactions protéolytiques à plusieurs reprises au cours de la réaction, l&#39;expérience paléo-TimeCourse fournit des ...

Stable workflows marquage isotopique qui emploient<sup&gt; 18</sup&gt; O-eau enrichie (Leo-workflows) sont des outils polyvalents pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives. En workflows protéase assistée (paléo),<sup&gt; 18</sup&gt; Atomes d&#39;oxygène sont introduits par clivage protéolytique et carboxyle réactions d&#39;échange d&#39;oxygène médiée par les protéases. Dans la catalyse acide (Aleo) flux de travail,<sup&gt; 18</sup&gt; Atomes d&#39;oxygène sont introduits par échange d&#39;oxygène carboxyle à faible pH.

Flux de travail d&#39;étiquetage protéase et catalysée par un acide Embauche<sup&gt; 18</sup&gt; O enrichi en eau

Les isotopes stables sont des outils essentiels en spectrométrie de masse biologique. Historiquement, les isotopes stables du 18O ont été largement utilisés pour étudier la catalyse...

Cette présentation démontre des protocoles pour le marquage isotopique stable de digestats protéiques et de peptides synthétiques en utilisant de l'eau enrichie en oxygène 18, dans un premier temps lors d'une expérience cinétique catalysée par une protéase dans des conditions de type paléontologique, en incubant le substrat et la protéase en présence d'eau enrichie à 50 % en oxygène 18 afin d'incorporer des atomes d'oxygène 18. Ensuite, lorsque la protéase est capable d'un double marquage, répéter l'incubation des produits de clivage post-digestion avec la protéase d'intérêt en présence d'eau enrichie à 50 % en oxygène 18.Le protocole EO effectue l'incorporation catalysée par un acide d'atomes d'oxygène 18 dans des groupes fonctionnels à des intervalles de temps définis. Des aliquotes prélevées à différents moments sont déposées sur des plaques cibles recouvertes de matrice, puis analysées par spectrométrie de masse, ce qui permet d'obtenir des profils spectraux en fonction du temps pour les réactions de clivage des peptides, ainsi que des courbes d'incorporation de l'oxygène 18 pour chaque espèce peptidique. Les produits de clivage marqués sont ensuite sélectionnés pour une identification de séquence par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). En définitive, ces protocoles constituent des outils polyvalents pour des études protéomiques qualitatives et quantitatives.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les protéases, telles que l'identification de la vitesse, des étapes limitantes et des intermédiaires réactionnels dans des voies protéolytiques complexes. Les signatures protéolytiques identifiées par le suivi temporel paléo fournissent des informations importantes concernant la spécificité du substrat. En outre, les minuteries des données utilisent également des informations cinétiques.Un postdoctorant de mon laboratoire va maintenant démontrer la procédure. Le protocole chronologique paléo permet de surveiller la dynamique des réactions de clivage protéolytique basées sur l'incorporation d'oxygène 18 catalysée par une protéase. Pour la réaction de 20 µL, ajoutez les peptides échantillons au tampon de réaction de protéase contenant de l'eau enrichie en oxygène 18. Mélangez 0,5 µL du mélange réactionnel avec 0,5 µL de matrice sur une plaque cible Maldi 384 spots Opti, puis laissez sécher les gouttelettes de solvant à température ambiante. Pendant ce temps, divisez le mélange réactionnel en deux tubes.Témoin et échantillon pour le tube d'échantillon. Ajouter la protéase d'intérêt et incuber à la température recommandée pour la réaction enzymatique. Ajouter aux points temporels spécifiés.Prélève un aliquot de 0,5 microlitre pour le mélanger à 0,5 microlitre de matrice, puis dépose-le sur la plaque à cibles multiples. Poursuis l’analyse de la dynamique de la réaction par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS, comme décrit plus loin dans ce protocole de marquage post-digestion. Les produits comme la trypsine catalysent la réaction d’échange d’oxygène carboxyle afin d’incorporer l’oxygène-18. Après avoir réalisé une digestion protéique sans marquage à l’oxygène-18, fais passer les produits de clivage à travers une colonne centrifuge pep clean C18 afin d’éliminer les activités protéasiques résiduelles.Ensuite, resuspendre les échantillons dans 20 microlitres de tampon de réaction de la trypsine contenant de l'eau enrichie en oxygène 18. Prélever une aliquote de 0,5 microlitre et mélanger avec un volume égal de matrice. Puis déposer sur une plaque cible MALDI Opti-Off 384 et laisser sécher à l'air.Ensuite, diviser la solution de réaction entre des tubes témoins et des tubes d'échantillon pour le tube d'échantillon. Ajouter la trypsine et incuber à 37 degrés Celsius. Pour suivre la réaction, prélever un aliquot de 0,5 microlitre.Mélanger avec 0,5 microlitre de matrice et déposer sur une plaque de maltar. Analyser la dynamique de cette réaction d'échange d'oxygène carboxyle par analyse Maldi Toof MSM S. Le protocole cinétique IEO repose sur les réactions d'échange d'oxygène carboxyle catalysées par un acide, concernant les groupes latéraux et terminaux acides des peptides.Incubez d'abord 50 nanomolaires de peptides individuels avec de l'eau enrichie en oxygène 18 en rapport un-à-un, en présence ou en absence d'acide trichloroacétique à 0,1 %, en prélevant des aliquotes de 0,5 microlitre du mélange réactionnel chaque jour pendant 48 jours, puis déposez-les directement par co-dépôt avec la matrice sur une plaque cible MALDI. Soumettez régulièrement la plaque cible MALDI à une analyse des produits par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS. Cette section est décrite en détail dans le manuscrit accompagnant.Tout d'abord, acquérez des spectres MS en mode ion positif en triple exemplaire. Après avoir étalonné le multipl et configuré l'acquisition MS, enregistrez des tirs simples pour les sous-spectres. Ensuite, exportez les fichiers de données MS à partir du logiciel d'acquisition de données Explorer de la série 4 000.Ensuite, importer dans un système d'information interne qui utilise le logiciel Mascot Distiller pour le traitement des spectres et la détection des pics. Déconvoluer les enveloppes isotopiques et déterminer automatiquement les rapports d'incorporation de l'oxygène 18 ; noter les rapports d'incorporation de l'oxygène 18 comme les contributions relatives des espèces isotopiques individuelles du peptide à l'enveloppe isotopique complète. Filtrer la liste des bins et regrouper au moins trois valeurs à une largeur de masse de 100 ppm pour chaque expérience cinétique.Extraire les masses moléculaires de toutes les espèces peptidiques détectées à partir des fichiers de données de spectrométrie de masse associés. Utiliser maintenant X pacey pour définir un ensemble de peptides avec une tolérance d'erreur de masse de 200 PPM. Comparer la liste des masses obtenues aux données des produits de clivage protéolytique prédits à partir de la séquence peptidique du substrat.Procédez à l'acquisition de spectres msms pour toutes les valeurs de masse des produits de clivage prédits par l'outil find pep et pour les valeurs de bin ayant une incorporation d'oxygène 18 associée. Collectez les données MSM S de 50 tirs selon un motif aléatoire par sous-spectre, avec jusqu'à 40 sous-spectres par spot, puis exportez les fichiers msms. Ensuite, exportez les fichiers de données MSM S vers le système d'analyse pour la détection des pics et les listes de pics MSM S associés aux données de spectrométrie de masse correspondantes afin de l'identification des peptides.Définissez ces paramètres de recherche dans le moteur de recherche Mascot : aucune spécificité enzymatique, tolérances de masse de 150 PPM pour l'ion précurseur et de 0,2 Dalton pour les ions fragments. Recherchez les listes M-S-M-S-P dans la base de données Swiss-Prot. Les identifications des peptides peuvent être en outre validées à l'aide d'un logiciel d'exploration de données en confirmant les profils caractéristiques d'incorporation d'oxygène 18 sur l'ensemble des ions fragments pour les tracés temporels du spectre.Exporter les fichiers de données de spectrométrie de masse pour chaque point temporel de réaction à partir du logiciel d'exploration de données vers des fichiers ASCI à l'aide d'une macro. Importer ensuite les fichiers dans un logiciel d'analyse et de représentation graphique, puis les afficher sous forme de diagrammes en cascade afin de créer des courbes d'incorporation de l'oxygène 18 pour chaque courbure. Pour le produit de clivage du peptide, extraire les contributions relatives des différentes espèces isotopiques du peptide à tous les points temporels de la réaction, puis les représenter en fonction du temps.Les graphiques spectraux en fonction du temps, comme celui-ci, affichent la dynamique des réactions de clivage protéolytique. Cette expérience analyse le clivage du peptide bioactif endo et C par l'enzyme de conversion endothéliale 1. Une disposition en cascade représente les spectres de masse des expériences cinétiques afin de surveiller simultanément la dégradation du substrat et l'apparition des produits intermédiaires et finaux.Les produits de clivage sont identifiés par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) et par les signatures caractéristiques de l'incorporation d'oxygène 18 dans leurs profils isotopiques. Ce mécanisme réactionnel de la trypsine indique que les protéases sérine catalysent l'incorporation d'au plus deux atomes d'oxygène 18 dans les produits de clivage peptidique. Dans le protocole de marquage fondé sur les protéases, la réaction de clivage de la liaison peptidique entraîne un taux d'incorporation de 50 % d'un seul atome d'oxygène 18 pour les produits de clivage peptidique fraîchement générés ; les protéases comme la trypsine, qui se lient à nouveau aux produits de la réaction, catalysent davantage l'incorporation d'un second atome d'oxygène 18 par l'intermédiaire de la réaction d'échange des oxygènes carboxyles.À l'équilibre, le marqueur oxygène 18 est réparti selon un ratio de un sur deux sur un entre les produits non marqués, simplement marqués et doublement marqués. Dans le protocole de marquage préalable des extrémités protéolytiques, aucune clivure de liaison peptidique n'intervient. Au lieu de cela, l'incorporation d'au maximum deux atomes d'oxygène 18 repose exclusivement sur la réaction d'échange des oxygènes carboxyles.Par conséquent, l'incorporation de l'oxygène 18 ne se produit que chez les protéases qui se lient à nouveau à leurs produits de clivage peptidiques. Le marquage à l'oxygène 18 catalysé par l'acide conduit à l'incorporation de deux atomes d'oxygène 18 par groupe carboxyle. Au cours de cette expérience, les décalages de masse multiples de deux Daltons de l'enveloppe isotopique de l'angiotensine I peuvent être cartographiés par l'absorption d'atomes d'oxygène 18.En combinant le marquage par OPE et la spectrométrie de masse à haute résolution de manière chronorésolue, la méthode de suivi temporel paléo permet une analyse dynamique de la formation des produits peptidiques. Ce test peut être utilisé pour produire des peptides marqués topiquement stabilisés destinés à des études protéomiques qualitatives et quantitatives, ainsi que pour évaluer la cinétique de formation des peptides Protopic.Le suivi temporel paléo est conçu pour évaluer les voies protéolytiques dans des conditions physiologiquement pertinentes. Cette technique a ouvert la voie à notre récente étude des processus lytiques dans les microenvironnements tumoraux humains.

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Flux de travail d'étiquetage protéase et catalysée par un acide Embauche

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