L'isolement et l'analyse du génome des virions unique en utilisant la génomique du virus unique »

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des virions individuels à partir d'une communauté mixte et de séquencer le matériel génomique obtenu afin d'identifier des virus provenant de divers environnements, sans avoir besoin de les cultiver. Cela est réalisé en isolant d'abord les virions individuels par tri cytométrique en flux sur des billes d'agarose. La capture de virions uniques est ensuite validée par microscopie confocale.

Ensuite, le matériel génomique est isolé à partir des virions et amplifié par amplification par déplacement multiple, ou MDA, afin de produire la quantité d'ADN nécessaire au séquençage. Enfin, l'ADN viral est séquencé à l'aide de technologies à haut débit, générant une couverture excédentaire du génome des virions, ce qui facilite considérablement l'assemblage et l'annotation du génome. En définitive, des techniques bioinformatiques basées sur des approches de sous-échantillonnage des séquences permettent d'augmenter la taille des contigs et autorisent l'analyse de virions isolés.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'écologie virale en fournissant un contexte génomique au vaste ensemble de gènes de virioplancton non annotés, tout en permettant la découverte de nouveaux génomes provenant d'écosystèmes variés. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car l'amplification et l'isolement de virions uniques repoussent les limites des technologies actuelles. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous évaluions l'utilisation de l'AMM (amplification multiple par déplacement) sur des communautés de virioplancton et avons réalisé qu'il était possible de trier une particule virale unique, puis de la séquencer et ainsi d'assembler un génome viral complet à partir de ces communautés complexes. Pour trier les virus à l'aide d'un cytomètre en flux équipé de photomultiplicateurs personnalisés pour la diffusion avant, ou FSCPMT. Commencez par diluer les particules virales dans du tampon Tris-EDTA filtré sur 0,1 micron. Pour un assemblage mixte contenant des particules de phages T4 et lambda, réglez le FSCPMT à 1000 et le SSC à 200 afin de maximiser le rapport signal sur bruit.

Après avoir analysé les échantillons témoins, injectez environ 100 microlitres de la suspension virale marquée jusqu'à un total de 5 000 événements. Utilisez ensuite les histogrammes SYBR Green One et FSCPMT pour placer une fenêtre étroite au centre des particules virales. Ajoutez ensuite cinq microlitres d'agarose à bas point de fusion à 1 % dans un tampon TBE refroidi à 37 degrés Celsius dans chaque puits d'une lame de microscope en P-T-F-E, puis insérez la lame dans le cytomètre de flux afin de capturer les particules virales triées.

Commencez le tri, en capturant 10 événements ou plus de particules virales dans certaines puits afin de faciliter la détection de la profondeur des virus lors de la microscopie à balayage laser confocale. Une fois le tri terminé, retirez la lame du cytomètre en flux et ajoutez cinq microlitres supplémentaires d'agarose à bas point de fusion refroidie à 37 degrés Celsius dans chaque puits afin d'encapsuler les particules virales. Pour les virions uniques, réglez le microscope à balayage laser confocal sur une excitation de 488 nanomètres. Ensuite, imagez les particules encapsulées à l’aide d’un objectif à longue distance de travail de 63 x afin de vérifier qu’une seule particule est présente et qu’aucun empilement de plusieurs virus n’a lieu. Une fois les puits contenant des virus uniques identifiés, utilisez une lame de rasoir pour retirer les billes d’agarose souhaitées de la lame et placez-les dans un tube PCR stérile.

Placer le tube dans le bloc chauffant d'un thermocycleur réglé à 94 degrés Celsius pendant trois minutes afin de lyser la particule virale in situ. Ensuite, après avoir effectué une MDA modifiée, transférer l'ADN génomique dans des tubes Eppendorf de 1,7 millilitre et ajouter un dixième du volume d'acétate de sodium à 3 M dans un tampon TBE pour purifier le matériel génomique amplifié. Placer les échantillons à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes afin de dissoudre l'agarose, puis transférer les tubes à 42 degrés Celsius pour réduire la température avant d'ajouter l'enzyme. Ajouter maintenant deux unités de bêta-agarase dans chaque tube et incuber les tubes pendant deux heures.

Ensuite, ajoutez un volume de solution tamponnée de phénol saturé à chaque tube. Mélangez vigoureusement et centrifugez les tubes pendant 15 minutes à 3 500 ×g à température ambiante. Transférez les surnageants contenant l'ADN dans un nouveau tube Eppendorf de 1,7 millilitre. Ajoutez ensuite un volume d'isopropanol à 100 % et un microlitre de glyco-blue aux tubes, puis retournez-les pour homogénéiser. Après avoir centrifugé à nouveau les tubes, cette fois pendant 60 minutes à 28 000 ×g et à 4 degrés Celsius, décantez l'isopropanol en veillant à ne pas perturber le culot, puis ajoutez 150 microlitres d'éthanol à 70 % à chaque tube. Faites tourner les tubes pendant 10 minutes à 28 000 ×g à température ambiante. Décantez l'éthanol, laissez sécher à l'air le culot d'ADN, puis remettez l'ADN en suspension dans un volume approprié de tampon tris-EDTA. Cette reconstruction tridimensionnelle d'une particule virale marquée au SYBR Green I à l'intérieur d'une pastille d'agarose illustre comment la microscopie confocale à laser peut être utilisée pour visualiser et confirmer qu'un seul virion est obtenu dans chaque puits après capture et inclusion dans l'agarose ; l'encart montre un agrandissement de la particule virale isolée.

Ici, un tracé de profil de la fluorescence relative de la particule virale unique marquée à l'intérieur d'une perle d'agarose est présenté. Cette dernière série de figures montre que presque tout le génome de Lambda, à l'exception des cinq premières paires de bases, a été récupéré pour ce virus représentatif. Voici le tracé de la teneur en GC pour le génome viral unique identifié. Cette figure montre la carte du génome de lambda. Enfin, le cartographiage d'un génome viral unique est montré pour le bactériophage lambda isolé et amplifié représentatif. L'axe des X indique la position sur le génome. L'axe des Y indique le pourcentage de couverture.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'utiliser une technique stérile et de prendre le temps nécessaire pour éviter toute contamination. Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être utilisées afin d'évaluer la taxonomie des virions isolés avant le séquençage complet du génome. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'isoler des virions uniques à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescence, de la microscopie confocale et de l'amplification complète du génome.