L'isolement et l'analyse du génome des virions unique en utilisant la génomique du virus unique »

L’objectif général de cette procédure est d’isoler des varians uniques d’un consortium mixte et de séquencer le matériel génomique obtenu pour identifier des virus provenant d’une variété d’environnements sans qu’il soit nécessaire de les cultiver. Ceci est accompli en isolant d’abord les varians simples à l’aide du tri cytométrique de flow sur des billes aro. La capture d’ions uniques est ensuite validée par microscopie confocale.

Ensuite, le matériel génomique est isolé des ions et amplifié à l’aide de l’amplification à déplacement multiple ou MDA pour générer la quantité d’ADN nécessaire au séquençage. Enfin, l’ADN viral est séquencé à l’aide de technologies à haut débit pour générer une couverture excédentaire du génome du virion, ce qui contribue considérablement à l’assemblage et à l’annotation du génome. En fin de compte, les techniques bioinformatiques visant à utiliser des approches de sous-échantillonnage de séquences pour augmenter la taille des cellules permettent d’analyser des canaux isolés.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’écologie virale en donnant un contexte génomique au vaste pool de gènes annotés du plancton OC, ainsi qu’à la découverte de nouveaux génomes à partir d’écosystèmes variés. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car l’amplification et l’isolement des ions uniques repoussent les limites de la technologie actuelle. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous évaluions l’utilisation de la MDA sur les communautés de plancton Vero et que nous avons réalisé qu’il était possible de trier une seule particule virale et une seule séquence et donc d’assembler un génome viral complet à partir de ces communautés complexes. Pour trier les virus à l’aide d’un cytomètre en flux équipé de tubes photomultiplicateurs à diffusion directe personnalisés ou F-S-C-P-M-T, commencez par diluer les particules virales dans des tris filtrés de 0,1 micron, L’EDTA pour un assemblage mixte contenant des particules de phages T quatre et lambda a fixé le F-S-C-P-M-T à 1000 et le SSC à 200 pour maximiser le rapport signal/bruit.

Après avoir analysé des échantillons de contrôle, analysez environ 100 microlitres de la suspension virale soutenue jusqu’à un total de 5 000 événements. Utilisez ensuite le tracé cyber vert et les tracés F-S-C-P-M-T pour placer une porte étanche au centre des particules virales. Ajoutez maintenant cinq microlitres de 1 % de points de fusion bas dans un tampon TBE refroidi à 37 degrés Celsius à chaque puits sur une lame de microscope A-P-T-F-E, puis chargez la lame dans le cytomètre en flux pour capturer les particules virales triées.

Commencez le tri, en capturant 10 événements de particules virales ou plus dans certains des puits pour aider à la détection de la profondeur des virus lors de la microscopie confocale à balayage laser. Une fois le tri terminé, retirez la lame du cytomètre en flux et ajoutez cinq autres microlitres d’aros à bas point de fusion refroidis à 37 degrés Celsius dans chaque puits. Intégration des particules virales pour une seule variante.

Réglez le microscope confocal à balayage laser sur 488 nanomètres. L’excitation image, puis l’imagerie des particules intégrées à l’aide d’un objectif à longue distance de travail de 63 x pour vérifier qu’une seule particule est présente et que plusieurs virus ne sont pas empilés les uns sur les autres. Ensuite, une fois que les puits contenant des virus uniques ont été identifiés, utilisez une lame de rasoir pour retirer les billes agros souhaitées de la lame et placez-les dans un tube PCR stérile.

Placez le tube dans le bloc chauffant d’un thermocycleur réglé à 94 degrés Celsius pendant trois minutes pour éliminer la particule virale in situ. Ensuite, après avoir effectué une MDA modifiée, transférez l’ADN génomique dans des tubes einor de 1,7 millilitre et ajoutez un 10e volume d’acétate de sodium à trois molaires dans un tampon TBE Pour purifier le matériel génomique amplifié, placez les échantillons à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dissoudre les aros, puis déplacez les tubes à 42 degrés Celsius pour réduire la température avant d’ajouter l’enzyme. Ajoutez maintenant deux unités de bêta aase dans chaque tube et incubez les tubes pendant deux heures.

Ajoutez ensuite un volume d’une solution tampon de phénol saturé dans chaque tube. Mélangez vigoureusement et centrifugez les tubes pendant 15 minutes à 3 500 fois G.At température ambiante, transférez l’ADN contenant des SUPERNATANTS dans un nouveau tube einor de 1,7 millilitre. Ensuite, ajoutez un volume de 100 % d’isopropanol et un microlitre de glyco blue dans les tubes et retournez les tubes pour mélanger après avoir centrifugé à nouveau les tubes.

Cette fois pendant 60 minutes à 28 000 fois G et quatre degrés Celsius. Décantez l’isopropanol en veillant à ne pas déranger le granulé et ajoutez 150 microlitres d’éthanol à 70 % dans chaque tube. Faites tourner les tubes pendant 10 minutes à 28 000 fois.

G à température ambiante. Décantez l’éthanol, séchez à l’air, la pastille d’ADN et remettez l’ADN en suspension dans un volume approprié de tampon tris EDTA. Cette reconstruction tridimensionnelle d’un cyber-vert, d’une particule virale colorée au sein d’une vitesse agro démontre comment la microscopie laser confocale peut être utilisée pour visualiser et confirmer qu’un seul virion est obtenu dans chaque puits après avoir été capturé et intégré dans aros, l’encart montre un grossissement plus élevé de la particule virale isolée.

Ici, un graphique de profil de la fluorescence relative de la particule virale unique colorée dans une bille aros est montré. Cette dernière série de figures montre comment la quasi-totalité du génome de Lambda, à l’exception des cinq premières paires de bases, a été récupérée pour ce virus représentatif. Voici le graphique GC pour le virus unique.

Le génome identifié est montré. Cette figure montre la carte du génome de lambda. Enfin, la cartographie d’un seul génome viral est montrée pour le phage lambda de la bactérie représentative isolée et amplifiée.

L’axe des X montre la position du génome. L’axe des Y indique le pourcentage de couverture. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important d’utiliser une technique stérile et de prendre le temps de s’assurer que la contamination est évitée.

Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être utilisées afin d’évaluer la taxonomie des varians isolés avant le séquençage du génome entier. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’isoler des varians uniques à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence, de la microscopie confocale et de l’amplification du génome entier.