Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF l'aide d'un TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales

L'objectif général de cette procédure est de suivre l'activation de RO par des facteurs spécifiques d'échange G-D-P-G-T-P, ou GAF, dans des cellules en culture, en utilisant une protéine de fusion mutante RO A GST ayant une forte affinité pour les protéines gs activées. Cette approche consiste d'abord à produire la protéine mutante RO marquée par GST dans des bactéries. Ensuite, la protéine RO A GST liée aux billes est purifiée.

Ensuite, la pureté et la concentration de la protéine GST RO A sont évaluées par électrophorèse SDS-PAGE. Enfin, des lysats cellulaires sont préparés et un essai de précipitation GEF est réalisé à l'aide de la protéine GST RO A. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant une augmentation de la précipitation de la GS activée dans les cellules traitées, grâce à l'analyse par immunotransfert des protéines précipitées à l'aide d'un anticorps spécifique anti-GF et à la quantification par cytométrie en densitométrie.

Cette méthode peut aider à répondre à un certain nombre de questions passionnantes dans le domaine des protéines G brutes, telles que la manière dont les nombreux facteurs d'échange G-D-P-G-T-P sont régulés de façon spécifique au signal et comment leur activité est coordonnée. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront initialement des difficultés, car la protéine GST RO G 17 A est relativement instable et peut se dégrader pendant la préparation. Il est également important de se rappeler d'effectuer rapidement et de manière reproductible le dosage de précipitation par GF. Cette procédure sera démontrée par Pfizer Vahid, étudiant en master de mon laboratoire, pour transformer des e coli.

Placer rapidement un quart de cellules compétentes DH5α dans un bain de glace, puis ajouter un microlitre d'ADN PX row A G 17 A à une concentration de 25 à 50 nanogrammes par microlitre. Agiter doucement le tube pour mélanger et incuber sur glace pendant 30 minutes. Effectuer un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes, puis replacer le tube sur glace pendant deux minutes.

Ajoutez 900 microlitres de milieu de chaussette et faites croître pendant une heure à 37 degrés Celsius sous agitation. À l’aide d’une pipette stérile courbée en forme de spaghettis, répartissez de 50 à 100 microlitres des bactéries transformées sur une plaque de gélose LB préparée au préalable contenant de la persine. Incubez la plaque à l’endroit dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis retournez-la et faites-la croître toute la nuit.

Prélevez une colonie bien isolée de bactéries transformées et utilisez-la pour ensemencer 50 millilitres de milieu LB contenant de l'ampicilline. Incubez toute la nuit à 37 degrés SIU avec agitation. Lorsque la culture a atteint une densité maximale, diluez-la avec 450 millilitres de milieu LB contenant de l'ampicilline et poursuivez l'incubation pendant 30 minutes supplémentaires. À 37 degrés Celsius, induisez la production de la protéine recombinante par les bactéries en ajoutant 500 microlitres de IPTG à 100 millimolaire à une culture de 500 millilitres.

Réduisez la température à 22 à 24 degrés Celsius et laissez croître pendant environ 16 heures. Centrifugez la culture à 3 600 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Congelez les culots pendant au moins une heure, ou de préférence toute la nuit, à moins 80 degrés Celsius.

Après avoir préparé 200 millilitres de tampon de lyse comme indiqué dans le protocole écrit, préparez le tampon de lyse plus en complétant 10 millilitres avec du DTT à un millimolaire, du PMSF à un millimolaire et un comprimé d'inhibiteur de protéase, en travaillant sur de la glace. Ajoutez 10 millilitres de tampon de lyse plus aux culots de Thor et homogénéisez soigneusement par pipetage et vortexage. Soniquez la suspension sur glace pendant une minute au réglage quatre avec une impulsion de 50 %.

Faire centrifuger le lysat soniqué à 15 000-20 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant clarifié dans un tube stérile de 15 millilitres fermé par un bouchon. Préparer les billes de glutathion sphéro en mélangeant doucement la suspension à 75 % et en utilisant une pipette à embout large pour transférer 335 microlitres dans un tube de 15 millilitres. Ajouter 10 millilitres de PBS froid et centrifuger à 500 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse plus aux billes et centrifugez à nouveau. Jetez de nouveau le surnageant et ajoutez du tampon de lyse.

En outre, pour préparer une suspension à 50 %, mélanger deux prélèvements de 50 microlitres de suspension de billes équilibrée avec le surnageant préparé. Agiter à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Préparer le tampon HBS plus en complétant 100 millilitres de tampon HBS avec du chlorure de magnésium à cinq millimolaire et du DTT à un millimolaire. Centrifuger le surnageant et les billes à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et lavez les billes deux fois avec 10 millilitres de tampon de lyse plus et deux fois avec 10 millilitres de HBS plus. Après le dernier lavage, préparez une suspension à 50 % en resuspendant les billes dans du HBS plus supplémenté par un inhibiteur de protéase. Diluez 10 microlitres de la préparation finale de billes avec deux fois le tampon d'échantillonnage lam ly contenant beamr cap deux éthanol.

Préparez ensuite trois échantillons standards de BSA en mélangeant respectivement 10 microlitres, 5 microlitres, puis 2,5 microlitres d'une solution mère de BSA à deux milligrammes par millilitre avec 10 microlitres de tampon lammy.

Faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes, puis effectuez une courte centrifugation et faites-les migrer tous avec un marqueur de poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide SDS à 10 % ; après coloration et décoloration du gel, estimez la protéine GST row A G 17 A en utilisant les standards de BSA comme référence. Répartissez dans des tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre un volume égal de billes contenant environ 10 à 15 microgrammes de protéine. Pour préparer le test de précipitation par GF, faites croître les cellules à utiliser jusqu'à confluence dans des boîtes de 10 centimètres et privez-les de sérum pendant au moins trois heures avant le test.

Juste avant le début du test, préparez le tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéases et travaillez sur glace. Retirez le milieu de culture des boîtes et rincez avec du HBS glacé.

Retirer tout le HBS et ajouter 700 microlitres de lyse. Ajouter le tampon plus à chaque boîte. Faire gonfler les boîtes pour recouvrir toutes les zones.

Ensuite, racler et recueillir les lysats dans des tubes numérotés de 1,5 millilitre. Centrifuger à 15 000 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Conserver le supranatant pour le dosage ; si le nombre de cellules était équivalent dans chaque plaque, prélever 30 microlitres de chaque supranatant et les mélanger avec 30 microlitres de tampon d'échantillonnage réducteur deux fois concentré.

Ensuite, faire bouillir et mettre de côté sur de la glace. Ajouter les surnageants restants à des aliquotes de billes GST Row a G 17 A et incuber en rotation pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Centrifuger les billes à 6 800 ×g pendant 10 secondes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et lavez les billes trois fois avec du tampon de lyse. À l’aide d’une seringue de 1 cm³ munie d’une aiguille de calibre 30, retirez complètement le dernier lavage et ajoutez 20 microlitres de tampon d’échantillonnage réducteur 2×. Portez les échantillons à ébullition pendant cinq minutes, centrifugez-les pour faire tomber les billes en culot, puis déposez les lysats cellulaires totaux et les échantillons de protéines précipitées sur un gel SDS-PAGE du pourcentage approprié en fonction de la taille de la GF étudiée.

Enfin, réalisez un immunotransfert pour détecter le facteur GFA pertinent dans un dosage GF réussi. La détection de l'activation du facteur d'échange GFH1 est illustrée ici. La protéine A G 17 A de la rangée A capte une partie du GFH1 à partir des lysats cellulaires témoins, ce qui suggère que le GFH1 possède une activité basale.

La quantité précipitée a toutefois augmenté dans les cellules traitées avec la cytokine inflammatoire facteur de nécrose tumorale alpha, ce qui est conforme à l'idée que le TNF alpha active la G FH une. Importamment, le lysat total de cellules montre des quantités similaires de gfh une dans l'échantillon témoin et dans l'échantillon traité, suggérant que le traitement n'a pas modifié les niveaux de G FH une et que la quantité utilisée en entrée dans le test était équivalente. Lors de l'adaptation de cette procédure, il est important de maintenir la protéine GSE RO G 17 A et les CELLIS huit sur glace.

Réalisez le test GF rapidement et de manière reproductible, et utilisez des contrôles positifs adéquats qui permettront l'invalidation et le dépannage.