Name: Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF laide dun TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Découvrez la précipitation par affinité des GEFs de RhoA activés à l'aide d'une protéine GST-RhoA mutante. Cette méthode permet de suivre l'activation des facteurs d'échange dans les cellules épithéliales.

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Ce travail a été financé par l&#39;Institut canadien de recherche en santé (IRSC) (RdP-97 774) et en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG, subvention n °: 480619). KS est un bénéficiaire d&#39;une bourse de nouveau chercheur KRESCENT (un prix conjoint de la Fondation canadienne du rein, du Canada Société de néphrologie et l&#39;Institut canadien de recherche en santé) et une bourse de nouveau chercheur du ministère ontarien de la recherche et l&#39;innovation. FW est soutenu par une bourse Li Ka Shing.

1. Transformation de E. coli avec le pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Préparer LB-agar en dissolvant 2,5 g et 1,5 LB gélose g dans 100 ml dH 2 O. Autoclave et laisser refroidir à environ 50-55 ° C, ce qui en règle générale, c&#39;est quand le ballon peut être tenu confortablement. </li><li> Préparer l&#39;ampicilline (Amp) de bouillon de par dissolution de 50 mg / ml dans dH 2 O. Seringue filtre et de geler les aliquotes inutilisées. Ajouter 100 ul de stock Amp (concentration finale 50 pg / ml) à la LB-Agar, passant de 1,1. Agiter pour mélanger et verser dans des plats de 10 cm bactériennes (15-20 ml / boîte). Laisser se solidifier (15-30 min.) Et de stocker les plaques inutilisées inversés à 4 ° C pendant 2-3 semaines. </li><li> Pour transformer E. Coli, rapidement dégeler une partie aliquote de cellules compétentes DH5a dans un bain de glace. Ajouter 1 ul de pGEXRhoA (G17A) d&#39;ADN dilué à 25-50 ng / ul. Flick le tube pour mélanger et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Le choc thermique à 42 ° C pendant 45 secondes et le lieu de retour sur la glace pendant 2 minutes. Ajouter 900 &amp; mu; L milieu SOC et de grandir pendant une heure à 37 ° C avec agitation. </li><li> Fais 50-100 ul des bactéries transformées sur une plaque LB-Agar-Amp en utilisant un penchant pipette Pasteur stérile. Incuber la plaque latérale droite dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 minutes, puis retourner et se développer du jour au lendemain. </li><li> Un colonie unique sera choisi à partir de la plaque pour la préparation de la protéine TPS-marqué (étape 2.1). Pour une utilisation future, plaques enveloppement et un magasin inversé à 4 ° C pendant environ 3 semaines. En outre, les stocks bactériennes peuvent être préparées pour le stockage de plus longue durée par la croissance des colonies individuelles dans 2 ml de LB-Amp stérile nuit à 37 ° C avec agitation. Mélanger une partie aliquote avec le glycérol 80% stérile dans un rapport de 1:1 et congeler à -80 ° C. </li></ol> 2. Préparation de la TPS-RhoA (G17A) Perles <ol><li> Préparer LB en ajoutant 25 g à 1 LB L dH 2 0 et l&#39;autoclavage. Une fois refroidi, ajouter 50 Amp ul du stock à 50 ml de LB (50 pg / ml de concentration finale). Inoculer avec un col bien isoléony de bactéries transformées et faire croître pendant une nuit à 37 ° C sous agitation. Quand la densité totale (OD 600&gt; 1,0) diluer avec 450 ml de LB-Amp et de croître pendant encore 30 minutes à 37 ° C. </li><li> Préparer une solution 100 mM stock de isopropylique BD-thiogalactopyranoside (IPTG) en dissolvant 0,238 g dans 10 ml dH O. 2 Magasin en aliquots à -20 ° C. Induire une bactérie pour produire une protéine Rho par adjonction 500 pl 100 mM IPTG à 500 ml de culture (une concentration finale de 100 pM). Réduire la température à 22-24 ° C et se développer pendant des heures de ~ h 16. </li><li> Spin culture à 3600 g pendant 10 minutes à 4 ° C. Si nécessaire, la culture de 500 ml peut être divisé en tubes de 50 ml pour la centrifugation. Gel culot (s) pendant au moins 1 heure (ou, de préférence pendant la nuit) à -80 ° C. </li><li> Préparer 200 ml de tampon de lyse contenant 20 mM d&#39;HEPES (0,95 g) / pH 7,5, 150 mM de NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl 2 (0,203 g); 1% TX-100 (2 ml). Préparer les solutions mères de 1M TNT (1,542 g dans 10 ml dH O 2) Et 100 mM de PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Pour préparer + tampon de lyse, supplément 10 ml avec 1 mM DTT (10 pl de stock) et 1 mM de PMSF (100 pl de stock) et un comprimé complet inhibiteur de protéase Mini. </li><li> De travail sur la glace, ajouter 10 ml de tampon de lyse + pour les pastilles de l&#39;étape 2.3. Resuspendre soigneusement au vortex douce et de pipetage. Éviter de faire mousser. Soniquer sur la glace pendant 1 minute à la position 4 avec un pouls de 50%. Faites tourner la lysat soniqué à 15.000-20.000 g pendant 15 minutes à 4 ° C, et retirez le sonicat clarifié (surnageant) à un stérile plafonné tube de 15 ml. </li><li> Préparer le glutathion sépharose par mélangeant doucement le tube original contenant une suspension de 75% et 335 ul de transfert dans un tube de 15 ml. Utiliser un embout large alésage à pipeter perles. Ajouter 10 ml PBS froid, et faire tourner 500 g pendant 5 minutes à 4 ° C. Jeter le surnageant, ajouter 1 ml de tampon de lyse + aux perles et de spin que pour le lavage précédent. Jeter le + lyse surnageant et ajouter un tampon pour faire une suspension de 50%. </li><li> Ajouter 250 pi de EQUILibrated suspension bourrelet au surnageant de l&#39;étape 2.5. Tourner à 4 ° C pendant 45 minutes. </li><li> Préparer 500 ml contenant 20 HBS (HEPES 2,38 g) / pH 7,5 et 150 mM de NaCl (4,38 g) dans dH 2 O. Préparer les solutions mères de 1M MgCl 2 (0,952 g dans 10 ml dH O 2) et 1M TNT (1,542 g dans 10 ml dH 2 O). Pour préparer HBS +, 100 ml de compléter juste avant l&#39;utilisation avec 5 mM MgCl 2 (50 pi de stock) et 1 mM (100 pi de stock) TNT. </li><li> Faites tourner les perles de l&#39;étape 2.7 à 500 g pendant 5 minutes à 4 ° C. Jeter des perles surnageant et lavage 2x avec 10 ml de tampon de lyse +, et 2x avec 10 ml HBS +. Après le lavage final, faire une bouillie de 50% par remise en suspension des billes dans HBS + de supplémentés avec BD BaculoGold inhibiteur de la protéase (20 pi de 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Diluer 10 ul de la préparation finale des billes avec un tampon échantillon de Laemmli 2x contenant β-mercaptoéthanol. Assurez-Sérum Albumine Bovine (BSA) des normes. Utiliser un dose de 2 mg / ml de bouillon (0,02 g de BSA dans 10 ml dH 2 O). Mélanger 10 ul de stock avec 10 pi Laemmli (20 pg final); 5 pi de stock avec 5 pi de dH 2 O et 10 pi de Laemmli (10 ug final) et 2,5 stock de pi avec 7,5 ul dH 2 O et 10 pi de Laemmli (5 ug final). Faire bouillir tous les échantillons (5 min). Spin de l&#39;échantillon de perles et de fonctionner avec les normes surnageant BSA et des marqueurs de poids moléculaire sur un 10% SDS-gel de polyacrylamide. </li><li> Préparer le bleu Comassie tache (0,1 g dans 10 ml d&#39;acide acétique, 40 ml de méthanol et 50 ml dH 2 O) et la solution Destain (500 ml dH 2 O, 400 ml de méthanol et 100 ml d&#39;acide acétique). Stocker à température ambiante. Colorer le gel pendant 20-30 minutes, retirer le colorant (il peut être réutilisé plusieurs fois) et rincer avec une solution Destain deux fois. Continuer à décolorer en agitant doucement pendant plusieurs heures jusqu&#39;à ce que les bandes sont clairement visibles. </li><li> Estimer la concentration de la TPS-RhoA (G17A) couplé à des billes en utilisant les normes BSA comme une référence (figure 2). Aliquot un volume égal de billes contenant des protéines ~ pg 10-15 dans des tubes de 1,5 ml à centrifuger micro. Perles Conserver à 4 ° C à utiliser dans une journée. Congeler à -80 ° C dans HBS + / glycérol dans un rapport de 3:1 à utiliser dans quelques jours. </li></ol> 3. FEM test déroulant avec Nucleotide-libres RhoA (G17A) Perles <ol><li> Cultiver les cellules dans des boîtes de 10 cm à la confluence. Sérum priver pendant au moins 3 heures et traiter si nécessaire. </li><li> Préparer un tampon de lyse + comme dans l&#39;étape 2.4. Préparez suffisamment de tampon de lyse pour 700 pl / plat, plus un certain montant supplémentaire pour permettre erreurs de pipetage. Ajouter les inhibiteurs de la protéase, juste avant utilisation. </li><li> De travail sur la glace, enlever milieu de culture de la vaisselle et laver avec de la glace froide HBS. Retirez tout le HBS et ajouter 700 + pl de tampon de lyse à chaque plat. Plaques de remous pour couvrir tous les domaines, gratter et de recueillir dans des tubes numérotés lysats de 1,5 ml. Centrifuger à 15000 g pendant 1 min à 4 ° C. Le surnageant est utilisé pour le dosage. </li><li> Si votre numéro de cellulaire est équivalente dans tous lesplats mis à l&#39;essai, vous pouvez omettre de faire un dosage de protéines, et passer à l&#39;étape 3.5. Sinon mesurer la concentration en protéine de chaque surnageant à l&#39;aide de Bio-Rad protein assay rapide et égaliser le surnageant pour le volume et la concentration. La quantité de protéine totale dépend des types cellulaires utilisés (typiquement de 1 à 1,5 mg de protéine pour LLC-PK1 cellules). </li><li> Retirer 30 pi de chaque surnageant et mélanger avec 30 pl 2x réduire l&#39;échantillon du tampon de Laemmli, portez à ébullition et mettre de côté pour l&#39;étape 3.7. Ajouter surnageants restant à des aliquotes des TPS-RhoA (G17A) perles de l&#39;étape 2.12. Tourner pendant 45 minutes à 4 ° C. </li><li> Spin perles à 6800 g pendant 10 secondes à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver les billes 3x avec un tampon de lyse, la filature de la même manière entre les lavages. Enlever complètement le lavage final à l&#39;aide d&#39;une seringue de 1 cc munie d&#39;une aiguille 30 G et ajouter 20 ul 2x réduire tampon échantillon de Laemmli. Faire bouillir pendant 5 min. Spin à des billes de granulés et soit exécuter immédiatement le surnageant (préférable) ou enregistrer unt -80 ° C pour une analyse ultérieure. </li><li> Exécuter 20 pi lysats cellulaires totaux et tous les échantillons de protéines précipitées sur le pourcentage de SDS-polyacrylamide gel approprié pour la taille du FEM que vous étudiez. Détecter votre FEM de choix par Western blot en utilisant un anticorps spécifique. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Partie 1 et 2 du protocole décrit la préparation de la TPS-RhoA (G17A) couplé à la GSH-sépharose perles et de son test par SDS-PAGE (voir le plan du protocole sur la figure 1). Un gel coloré au bleu de Coomassie typique est montré sur la figure 2. L&#39;échantillon avec la protéine éluée devrait contenir une seule bande à environ 50 kDa (Fig. 2, piste 6). La concentration de la protéine peut être estimée en utilisant des échantillons de référence de BSA. Dans l&#39;exemple sur la figure 2, la concentration de RhoA (G17A) est estimée à 15 μg/10 ul. Ainsi, des aliquotes de 10 pl / tube ont été préparés. Le rendement typique<html> dans notre main est de 15-20 g de protéine de 10 ml lyse bactérienne. Partie 3 du protocole décrit l&#39;essai de précipitation par affinité (voir vue d&#39;ensemble sur la figure 1). Un test réussi du FEM détecter l&#39;activation du facteur d&#39;échange du FEM-H1 est représenté sur la figure 3. La RhoA (G17A) protéine capturé certains FEM-H1 de la commande (non traitée) lysats cellulaires, suggérant que le FEM-H1 possède une activité basale. Le montant précipité mais augmente dans les cellules traitées avec le Tumor Necrosis Factor-cytokine inflammatoire α (TNF α-), compatibles avec la notion que le TNF-α active FEM-H1 5,7. Surtout, les lysats cellulaires totaux montrent des quantités similaires de FEM-H1 dans le contrôle et l&#39;échantillon traité, ce qui suggère que le traitement n&#39;a pas modifié le FEM-H1 les niveaux et l&#39;entrée utilisée dans le dosage est égale. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble du protocole. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figure 2. Résultat Représentant du protocole de préparation de perles. Un gel coloré au bleu de Coomassie avec succès la TPS-RhoA (G17A) préparation des billes est montré. Échantillon de billes et les normes de protéines BSA ont été séparées par SDS-PAGE en utilisant un gel d&#39;acrylamide 10%. Pour tester les perles, 10 pi de la suspension finale contenant cordon TPS-RhoA (G17A) est dilué à 1:1 avec la réduction de tampon d&#39;échantillon Laemmli et bouilli pendant 5 minutes. Les perles ont été filés brièvement et le surnageant chargé sur le gel. Les exemples suivants ont été chargés: Piste 1: marqueur de poids moléculaire (MW) (FroggaBio BluEye précolorés échelle des protéines); Lanes 2-4: pg 5, 10 et 20 Bovine Serum Albumin (BSA); piste 5 est vide; Lane 6: 10 ul des fraîchement préparés RhoA (G17A) perles. Après la séparation est terminée, le gel est coloré à l&#39;aide du bleu de Coomassie et par la suite décolorés pour révéler les protéines. Le poids moléculaire de la TPS-RhoA (G17A) protéine est d&#39;environ 50<html> kDa et fonctionne près du niveau du marqueur 48 kDa. La concentration de la protéine GST-Rho dans cet échantillon particulier est estimé à environ 15 μg/10 suspension ul. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figure 3. Test Représentant activation du FEM montrant TNF-α induite par l&#39;activation du FEM-H1. Confluent LLC-PK1 cellules ont été traitées avec 10 ng / ml de TNF-α pendant 5 minutes. Après le traitement des cellules ont été lysées et GEFs actifs ont été capturées à l&#39;aide TPS-RhoA (G17A) perles liés. La présence du FEM-H1 dans les protéines précipitées (Blot en haut) et le total des échantillons lysat cellulaire (blot en bas) a été détecté en utilisant Western blot avec un anticorps anti-FEM-H1 (Signalisation cellulaire). S&#39;il vous plaît noter la quantité accrue de précipité FEM-H1 de TNF-α-traités par rapport à cellules non traitées par rapport aux entrées équivalentes, indiquant un résultat positif. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. Un &quot;mauvais résultat&quot;. Bien que le dosage déroulant FEM quels entraîné dans une FEM-H1 capturé par les billes, les montants précipité à partir de commande et de TNF-α-cellules traitées sont les mêmes. Ainsi le TNF-α, un activateur de savoir de FEM-H1 dans ce cas n&#39;a pas induire l&#39;activation. Dans ce dépannage expérience particulière subséquente a suggéré que le TNF-α utilisé n&#39;était pas assez fraîche et probablement dégradée.

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

La méthode présentée ici est le dosage de l&#39;activation uniquement disponible pour les non-radioactifs GEFs qui peuvent suivre la piscine active de GEF dans les cellules. Le test est similaire à des tests de précipitation utilisés pour l&#39;activation suivante de petites GTPases ainsi que GEFs contre Rac et Cdc42. Ces tests utilisent différents TPS-protéines marquées et avoir de légères différences de celle décrite ici, mais les étapes de base sont les mêmes. Ainsi, ce protocole peut être facilement adapté pour d&#39;autres petite GTPase et des dosages d&#39;activation du FEM. Le test présenté FEM a été récemment modifié pour l&#39;application pour les fractions nucléaires 9,10. Avec d&#39;autres modifications, les tests d&#39;activation du FEM dans les autres compartiments subcellulaires pourrait également être possible. Nous utilisons la méthode présentée pour étudier l&#39;activation de GEF dans les lignées cellulaires épithéliales 5,6,7. Avec un peu d&#39;optimisation, ce test devrait être suffisante pour détecter GEFs de toute lignée cellulaire. Lorsque adapting à un type cellulaire spécifique, trouver le numéro de cellulaire optimale, le volume de tampon de lyse, et la méthode de détection pour le FEM à être testé (un anticorps bon pour Western blot est important). Pour la configuration initiale de l&#39;essai, il est conseillé d&#39;utiliser un stimulus qui est connu pour activer le FEM d&#39;intérêt. Lorsque vous utilisez un stimulus inconnu, toujours utiliser un contrôle positif afin de vérifier que votre dosage est de travailler. Ce test peut être utilisé pour détecter l&#39;activation de la GEF connues par Western blot. Cependant, il est également adéquate pour identifier GEFs inconnus. Pour cela, GEFs capturés de contrôle et des échantillons stimulés doivent être analysés sur un gel teinté au bleu de Coomassie. Les bandes qui apparaissent uniquement dans des échantillons stimulés pourrait contenir GEFs activées et peuvent être envoyées à l&#39;identification par spectrométrie de masse (par exemple 5). Enfin, une note d&#39;avertissement. Le test est basé sur l&#39;hypothèse que les modifications post-traductionnelles rendant GEFs actifs sont conservés après lyse cellulaire. En effet, c&#39;est clairement le casoi pour un certain nombre de GEF, et depuis ses établissements, ce test a été utilisé par divers groupes pour détecter l&#39;activation des différents GEFs, notamment le FEM-H1, p115RhoGEF et XPLN (par exemple 5,11,12,13). Préservation de l&#39;état actif mais pourrait ne pas arriver dans le cas de tous les GEF, et par conséquent il est concevable que ce test ne fonctionne pas pour tous les GEF. Il doit également être noté que de nombreux GEFs exercer une activité vers plus d&#39;un petites GTPases. Ainsi, quand un particulier FEM est étudié, il est recommandé de compléter ce test avec les tests de précipitation du FEM pour les autres petites GTPases, ainsi que des études fonctionnelles examen RhoA, Rac1 et Cdc42. Les étapes critiques dans le protocole: Les colonies de bactéries transformées doivent être ramassés à partir de plaques de frais, bien préparés pour assurer une sélection adéquate par Amp, l&#39;excroissance et de rendement. Conditions de transformation des cellules compétentes obtenus à partir d&#39;autres sources peut varier et doit être consulté. </p&gt; Toutes les étapes du protocole de préparation de protéines (de l&#39;étape 2.3) et le dosage (à partir de l&#39;étape 3.2) doit être effectuée à 4 ° C avec des solutions refroidies et les centrifugeuses. Lyse bactérienne (étape 2.5) devrait être approfondie et complète afin d&#39;obtenir une suspension homogène. Lorsque la lyse de la bactérie, de tourbillon, et pipeter le lysat alternativement, tout en le maintenant à 4 ° C et à assurer la sonication est effectuée sur de la glace pour empêcher la dénaturation de la protéine. Si vous utilisez un modèle différent de sonicateur, les conditions peuvent avoir besoin d&#39;être ajustée. L&#39;incubation de sonicat avec les perles devrait toujours être faite à 4 ° C sur un agitateur pour assurer une liaison suffisante, et les soins devraient être prises pour maintenir le calendrier cohérent. TPS-Rho mutants sont quelque peu instables lorsqu&#39;elles sont exprimées dans des bactéries, il est donc préférable d&#39;utiliser des billes préparées tout de suite ou dans quelques jours. Le test de précipitation (Partie 3) est le temps et sensible de température, uns GEFs actifs peuvent facilement être perdus à partir du lysat cellulaire, de sorte que des mesures devraient être effectuées aussi rapidement que possible. La section suivante contient quelques conseils de dépannage. Pas ou très faible quantité de protéines Rho mutant dans la préparation finale perle: Cela peut être causé par induction inefficace, lyse insuffisante des bactéries, ou une perte de la protéine au cours du processus de préparation ou de stockage. Pour vous aider à résoudre certaines de ces possibilités, des échantillons de bactéries peuvent être analysés avant et après l&#39;induction. Si il ya induction pauvres de la protéine répéter le processus à l&#39;aide d&#39;une colonie d&#39;une plaque fraîchement striée ou de re-transformé des cellules compétentes. Concentrations différentes IPTG et temps d&#39;induction devraient également être testés. Si la lyse est insuffisante (c.-à-la protéine reste dans le culot au lieu de le surnageant) des concentrations variables de sel et de détergent dans le tampon de lyse peut être essayé. Autres temps de sonication etparamètres doivent être pris en considération, et les échantillons avant et après sonication peut être vérifiée par microscopie afin de déterminer l&#39;efficacité de la lyse. Aucun précipité du FEM, même si la TPS-protéine est présente sur les perles: Cela peut être dû à des problèmes techniques pendant le test de précipitation, ou par une absence réelle de l&#39;activation de l&#39;étude du FEM en utilisant le stimulus appliqué. Toujours utiliser un stimulus connu comme un contrôle positif pour vérifier que votre test fonctionne. Utilisez les perles préparées en quelques jours. Si l&#39;essai de précipitation capture des quantités indétectables de la FEM étudiés dans toutes les conditions, vérifier que votre FEM est présent et il est bien détectable dans le surnageant après centrifugation qui doit être utilisé pour le dosage (étape 3.3). Assurez-vous que tous les tampons et les inhibiteurs de protéase sont fraîches, et effectuer toutes les étapes sur la glace aussi vite que possible. Augmenter la quantité de protéines d&#39;entrée (par exemple en utilisant des lysats de 2 plaques / échantillon). Si l&#39;essai de précipitation montre basale précipitationstion de votre FEM, mais aucune différence n&#39;est observée entre le contrôle et les échantillons stimulés (figure 4), commencer le dépannage en vérifiant que le stimulus appliqué travaillé à l&#39;aide d&#39;autres effets connus (par exemple en détectant l&#39;activation d&#39;autres voies de signalisation). Pensez à changer les conditions de traitement et / ou concentrations. S&#39;appuyer sur les données de la déclaration la littérature comment votre relance activent Rho ou de signalisation autres prédire le temps et les concentrations susceptibles. Lors de l&#39;optimisation du temps de traitement, utiliser les deux points dans le temps court et long terme, que l&#39;activation du FEM pourrait être la meilleure détectable à un moment avant l&#39;activation de Rho ainsi détectable. Enfin, le même stimulus pourrait se traduire par un degré variable d&#39;activation due à un changement dans la sensibilité des cellules causés par le nombre de passages, de cellules de confluence, etc

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Sera bientôt disponible </td><td> Généré dans le laboratoire du Dr Keith Burridge (Université de Caroline du Nord) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Magasin -80 ° C </td></tr><tr><td> Milieu SOC </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Gardez stérile </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Les stocks en magasin à -20 ° C </td></tr><tr><td> Gélose </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyle BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420322 </td><td> Solution stock Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutathion billes de Sépharose </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> TNT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la protéase 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51-21426Z </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr&gt; <td> Complete Mini, EDTA sans 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> Laemmli Sample Buffer 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> Bleu de Coomassie </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Acide acétique </td><td> CALEDON </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> CALEDON </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Protein Assay Bio-Rad </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Échelle BluEye </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Utilisé. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td&gt; <td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> RC-5B centrifugeuse </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 Rotor </td><td> Utilisez à 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Utilisez à 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifugeuse Micro </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Utilisez à 4 ° C </td></tr><tr><td> Bactérienne agitateur </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Utilisez-le à 37 ° C ou à 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Utilisez à la température ambiante </td></tr><tr><td> Rotateur </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Utilisez à 4 ° C </td></tr></tbody></table> Équipements Tableau 2. Spécifique utilisé.

précipitation par affinité des actifs des rho gef l&#39;aide d&#39;un tps-étiqueté mutant rho protéines (tps-rhoa (g17a)) à partir de lysats cellulaires épithéliales

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Les protéines de la famille Rho des petites GTPases sont des régulateurs centraux du cytosquelette, et de contrôler une grande variété de processus cellulaires, y compris la migration des cellules, l&#39;expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et 1 d&#39;adhésion cellulaire. Protéines Rho sont des commutateurs moléculaires qui sont actives dans GTP et inactive dans le PIB lié Etat. Leur activation est médiée par une famille de guanine-nucleotide facteur d&#39;échange (FEM) des protéines. Rho-GEF constituent une grande famille, avec des chevauchements spécificités 2. Bien que beaucoup de progrès ont été accomplis dans l&#39;identification des GEFs activés par des signaux spécifiques, il existe encore de nombreuses questions subsistent sur la voie de la réglementation spécifique de ces protéines. Le nombre de Rho-GEF dépasse 70, et chaque cellule exprime plus d&#39;une protéine du FEM. En outre, bon nombre de ces protéines Rho activer non seulement, mais d&#39;autres membres de la famille, contribuant à la suite de la complexité des réseaux de régulation. Surtout, l&#39;explorationcomment GEFs sont réglementées nécessite une méthode à suivre la piscine active de GEFs individuelles dans les cellules activées par des stimuli différents. Ici, nous fournir un protocole étape par étape pour une méthode utilisée pour évaluer et quantifier les actifs disponibles Rho-GEF spécifiques en utilisant un essai de précipitation par affinité. Ce test a été développé il ya quelques années dans le laboratoire Burridge 3,4 et nous l&#39;avons utilisé dans les lignes de cellules rénales de tubulaires 5,6,7. Le test prend avantage d&#39;un &quot;nucléotide libre&quot; mutant RhoA, avec une forte affinité pour les GEF actifs. La mutation (G17A) rend la protéine incapable de se lier PIB ou le GTP et cet état imite l&#39;état intermédiaire qui est lié à la FEM. Une version TPS-étiqueté de cette protéine mutante est exprimée et purifiée à partir de E. coli, liés à des billes de sépharose glutathion et utilisé pour précipiter GEFs actifs à partir de lysats de cellules non traitées et stimulé. Comme la plupart des GEF sont activés via des modifications post-traductionnelles ou de la libération des liaisons inhibitrices, leur état actifest conservé dans les lysats cellulaires, et ils peuvent être détectés par ce test 8. Protéines capturées peuvent être sondé pour GEFs connus par la détection d&#39;anticorps spécifiques à l&#39;aide Western blot, ou analysés par spectrométrie de masse pour identifier GEFs inconnus activés par certains stimuli.

La méthode présentée ici décrit un dosage de suivre l&#39;activation de RhoA facteurs spécifiques de change GDP / GTP (GEF) dans les cellules cultivées en faisant usage d&#39;une protéine mutante RhoA fusion GST qui a une forte affinité pour GEFs activés. GEF sont précipités à partir de lysats cellulaires, détectées par Western blot et quantifiée par densitométrie.

Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF l&#39;aide d&#39;un TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales

Les protéines de la famille Rho des petites GTPases sont des régulateurs centraux du cytosquelette et contrôlent une grande variété de processus cellulaires, notamment la cellule...

L'objectif général de cette procédure est de suivre l'activation de RO par des facteurs spécifiques d'échange G-D-P-G-T-P, ou GAF, dans des cellules en culture, en utilisant une protéine de fusion mutante RO A GST ayant une forte affinité pour les protéines gs activées. Cette approche consiste d'abord à produire la protéine mutante RO marquée par GST dans des bactéries. Ensuite, la protéine RO A GST liée aux billes est purifiée.Ensuite, la pureté et la concentration de la protéine GST RO A sont évaluées par électrophorèse SDS-PAGE. Enfin, des lysats cellulaires sont préparés et un essai de précipitation GEF est réalisé à l'aide de la protéine GST RO A. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant une augmentation de la précipitation de la GS activée dans les cellules traitées, grâce à l'analyse par immunotransfert des protéines précipitées à l'aide d'un anticorps spécifique anti-GF et à la quantification par cytométrie en densitométrie.Cette méthode peut aider à répondre à un certain nombre de questions passionnantes dans le domaine des protéines G brutes, telles que la manière dont les nombreux facteurs d'échange G-D-P-G-T-P sont régulés de façon spécifique au signal et comment leur activité est coordonnée. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront initialement des difficultés, car la protéine GST RO G 17 A est relativement instable et peut se dégrader pendant la préparation. Il est également important de se rappeler d'effectuer rapidement et de manière reproductible le dosage de précipitation par GF. Cette procédure sera démontrée par Pfizer Vahid, étudiant en master de mon laboratoire, pour transformer des e coli.Placer rapidement un quart de cellules compétentes DH5α dans un bain de glace, puis ajouter un microlitre d'ADN PX row A G 17 A à une concentration de 25 à 50 nanogrammes par microlitre. Agiter doucement le tube pour mélanger et incuber sur glace pendant 30 minutes. Effectuer un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes, puis replacer le tube sur glace pendant deux minutes.Ajoutez 900 microlitres de milieu de chaussette et faites croître pendant une heure à 37 degrés Celsius sous agitation. À l’aide d’une pipette stérile courbée en forme de spaghettis, répartissez de 50 à 100 microlitres des bactéries transformées sur une plaque de gélose LB préparée au préalable contenant de la persine. Incubez la plaque à l’endroit dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis retournez-la et faites-la croître toute la nuit.Prélevez une colonie bien isolée de bactéries transformées et utilisez-la pour ensemencer 50 millilitres de milieu LB contenant de l'ampicilline. Incubez toute la nuit à 37 degrés SIU avec agitation. Lorsque la culture a atteint une densité maximale, diluez-la avec 450 millilitres de milieu LB contenant de l'ampicilline et poursuivez l'incubation pendant 30 minutes supplémentaires. À 37 degrés Celsius, induisez la production de la protéine recombinante par les bactéries en ajoutant 500 microlitres de IPTG à 100 millimolaire à une culture de 500 millilitres.Réduisez la température à 22 à 24 degrés Celsius et laissez croître pendant environ 16 heures. Centrifugez la culture à 3 600 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Congelez les culots pendant au moins une heure, ou de préférence toute la nuit, à moins 80 degrés Celsius.Après avoir préparé 200 millilitres de tampon de lyse comme indiqué dans le protocole écrit, préparez le tampon de lyse plus en complétant 10 millilitres avec du DTT à un millimolaire, du PMSF à un millimolaire et un comprimé d'inhibiteur de protéase, en travaillant sur de la glace. Ajoutez 10 millilitres de tampon de lyse plus aux culots de Thor et homogénéisez soigneusement par pipetage et vortexage. Soniquez la suspension sur glace pendant une minute au réglage quatre avec une impulsion de 50 %.Faire centrifuger le lysat soniqué à 15 000-20 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant clarifié dans un tube stérile de 15 millilitres fermé par un bouchon. Préparer les billes de glutathion sphéro en mélangeant doucement la suspension à 75 % et en utilisant une pipette à embout large pour transférer 335 microlitres dans un tube de 15 millilitres. Ajouter 10 millilitres de PBS froid et centrifuger à 500 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse plus aux billes et centrifugez à nouveau. Jetez de nouveau le surnageant et ajoutez du tampon de lyse.En outre, pour préparer une suspension à 50 %, mélanger deux prélèvements de 50 microlitres de suspension de billes équilibrée avec le surnageant préparé. Agiter à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Préparer le tampon HBS plus en complétant 100 millilitres de tampon HBS avec du chlorure de magnésium à cinq millimolaire et du DTT à un millimolaire. Centrifuger le surnageant et les billes à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant et lavez les billes deux fois avec 10 millilitres de tampon de lyse plus et deux fois avec 10 millilitres de HBS plus. Après le dernier lavage, préparez une suspension à 50 % en resuspendant les billes dans du HBS plus supplémenté par un inhibiteur de protéase. Diluez 10 microlitres de la préparation finale de billes avec deux fois le tampon d'échantillonnage lam ly contenant beamr cap deux éthanol.Préparez ensuite trois échantillons standards de BSA en mélangeant respectivement 10 microlitres, 5 microlitres, puis 2,5 microlitres d'une solution mère de BSA à deux milligrammes par millilitre avec 10 microlitres de tampon lammy.Faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes, puis effectuez une courte centrifugation et faites-les migrer tous avec un marqueur de poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide SDS à 10 % ; après coloration et décoloration du gel, estimez la protéine GST row A G 17 A en utilisant les standards de BSA comme référence. Répartissez dans des tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre un volume égal de billes contenant environ 10 à 15 microgrammes de protéine. Pour préparer le test de précipitation par GF, faites croître les cellules à utiliser jusqu'à confluence dans des boîtes de 10 centimètres et privez-les de sérum pendant au moins trois heures avant le test.Juste avant le début du test, préparez le tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéases et travaillez sur glace. Retirez le milieu de culture des boîtes et rincez avec du HBS glacé.Retirer tout le HBS et ajouter 700 microlitres de lyse. Ajouter le tampon plus à chaque boîte. Faire gonfler les boîtes pour recouvrir toutes les zones.Ensuite, racler et recueillir les lysats dans des tubes numérotés de 1,5 millilitre. Centrifuger à 15 000 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Conserver le supranatant pour le dosage ; si le nombre de cellules était équivalent dans chaque plaque, prélever 30 microlitres de chaque supranatant et les mélanger avec 30 microlitres de tampon d'échantillonnage réducteur deux fois concentré.Ensuite, faire bouillir et mettre de côté sur de la glace. Ajouter les surnageants restants à des aliquotes de billes GST Row a G 17 A et incuber en rotation pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Centrifuger les billes à 6 800 ×g pendant 10 secondes à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant et lavez les billes trois fois avec du tampon de lyse. À l’aide d’une seringue de 1 cm³ munie d’une aiguille de calibre 30, retirez complètement le dernier lavage et ajoutez 20 microlitres de tampon d’échantillonnage réducteur 2×. Portez les échantillons à ébullition pendant cinq minutes, centrifugez-les pour faire tomber les billes en culot, puis déposez les lysats cellulaires totaux et les échantillons de protéines précipitées sur un gel SDS-PAGE du pourcentage approprié en fonction de la taille de la GF étudiée.Enfin, réalisez un immunotransfert pour détecter le facteur GFA pertinent dans un dosage GF réussi. La détection de l'activation du facteur d'échange GFH1 est illustrée ici. La protéine A G 17 A de la rangée A capte une partie du GFH1 à partir des lysats cellulaires témoins, ce qui suggère que le GFH1 possède une activité basale.La quantité précipitée a toutefois augmenté dans les cellules traitées avec la cytokine inflammatoire facteur de nécrose tumorale alpha, ce qui est conforme à l'idée que le TNF alpha active la G FH une. Importamment, le lysat total de cellules montre des quantités similaires de gfh une dans l'échantillon témoin et dans l'échantillon traité, suggérant que le traitement n'a pas modifié les niveaux de G FH une et que la quantité utilisée en entrée dans le test était équivalente. Lors de l'adaptation de cette procédure, il est important de maintenir la protéine GSE RO G 17 A et les CELLIS huit sur glace.Réalisez le test GF rapidement et de manière reproductible, et utilisez des contrôles positifs adéquats qui permettront l'invalidation et le dépannage.

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Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF laide dun TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales (Vidéo) | JoVE Journal

Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF l'aide d'un TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales

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