Microfluidique endothélialisée pour étudier les interactions microvasculaires dans Hémopathies

L’objectif global de cette procédure est de créer un dispositif microfluidique recouvert de cellules endothéliales. Ceci est accompli en fabriquant d’abord le moule microfluidique. La deuxième étape consiste à créer le canal PDMS.

Ensuite, les cellules endothéliales sont ensemences dans le dispositif. La dernière étape consiste à cultiver les cellules à l’intérieur du dispositif. En fin de compte, des dispositifs microfluidiques recouverts de cellules endothéliales sont utilisés pour montrer les interactions de cellule à cellule in vitro.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle offre au chercheur un contrôle strict des conditions biologiques et biophysiques et qu’elle est compatible avec la microscopie à fluorescence. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des interactions biophysiques entre les cellules dans les maladies hématologiques, elle peut également être appliquée à des phénomènes tels que la biologie des leucocytes, les métastases cancéreuses et la biologie des cellules souches hématopoïétiques. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à s’asseoir dans les cellules, car les conditions doivent être étroitement contrôlées pour réussir l’installation dans les cellules.

En préparation de la fabrication, crée un masque photo en soumettant une image de conception assistée par ordinateur du dispositif Microfluid à un fournisseur de masque externe. Une fois reçu, le masque est composé d’une couche de chrome sur du verre sodocalcique. Ici, la largeur du canal microfluidique est de 30 microns.

Pour commencer la fabrication du dispositif microfluidique, nettoyez une plaquette de silicone nue avec du piranha pendant 15 minutes, puis rincez-la à l’eau déminéralisée pendant 10 secondes. Plongez ensuite la plaquette de silicone dans de l’acide fluorhydrique pendant 30 secondes et rincez à l’eau déminéralisée pendant environ 10 secondes. Ensuite, à l’aide d’un spin coter spin micro chem SU 8 20 25 photo resist sur la plaquette à une hauteur de 30 microns en utilisant une vitesse de rotation de 3000 rotations par minute.

Placez la plaquette enrobée SU 8 20 25 sur une plaque chauffante réglée à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer l’excès de solvant. Un four n’est pas recommandé pour cette étape. Maintenant, placez le masque photo sur la plaquette et exposez-le à la lumière UV dans une doublure de masque pour réticuler la résine photo SU 8 20 25.

Après la réticulation, replacez la plaquette sur la plaque chauffante à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes supplémentaires. Pour accélérer encore la polymérisation de la résine photo SU 8 20 25. Plongez ensuite la plaquette dans le révélateur SU eight, qui est composé principalement de P-G-M-E-A pendant quatre minutes.

Cela supprimera la photo SU 8 20 25 non réticulée. Résister. Rincez la plaquette nouvellement développée avec de l’alcool isopropylique à 100 % pendant 10 secondes, puis séchez-la à l’aide d’azote sous pression ou en laissant le solvant s’évaporer de la plaquette dans une hotte propre pendant plusieurs minutes. Maintenant, collez la gaufrette séchée au centre de la boîte de Pétri, en prenant soin de placer le ruban sur les bords de la plaquette.

Enfin, pipetez 500 microlitres de sigma coat sur la plaquette. Couvrez la boîte de Pétri avec le couvercle, puis faites tourner le plat pour assurer une recrue complète de la gaufrette. Retirez le couvercle et laissez sécher la plaquette pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que tout le solvant se soit évaporé.

Après avoir mélangé le polymère PDMS et l’agent de durcissement à un rapport de 10 pour un poids par poids, éliminez les bulles d’air à l’aide d’un dessiccation sous vide pendant plusieurs minutes à une heure, en fonction de la force du système de vide disponible. Une fois que toutes les bulles d’air ont été éliminées, versez le mélange dans le plat de manière à ce que la gaufrette et la surface du plat soient couvertes. Pour créer une feuille de PDMS d’environ cinq millimètres d’épaisseur.

Créez également un mince morceau sans caractéristique de PDMS d’un millimètre d’épaisseur. Ensuite, faites durcir le mélange dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, à l’aide d’un couteau ou d’un scalpel, coupez autour de la plaquette et retirez plusieurs dispositifs microfluidiques PDMS.

Coupez ensuite la feuille pour isoler les appareils individuels. Coupez la feuille de PDMS légèrement plus grande que le dispositif microfluidique. Utilisez maintenant une goupille, un étau Harris, une licorne ou un dispositif similaire pour créer des trous d’entrée et de sortie dans le dispositif microfluidique.

Ensuite, nettoyez les surfaces du dispositif microfluidique et de la feuille à l’aide de ruban adhésif. Ensuite, utilisez un nettoyant plasma pour exposer les surfaces du dispositif microfluidique et de la feuille PDMS au plasma d’oxygène pendant 30 secondes. Le plasma d’oxygène crée des espèces réactives sur la surface exposée du PDMS, qui se lient lorsqu’elles sont mises en contact physique.

Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille à pointe émoussée de calibre 20 avec 50 microgrammes par millilitre. La fibronectine du plasma humain dans le PBS ajuste ensuite une longueur de tube sur l’aiguille. Insérez un morceau de tube plus mince dans le premier morceau de tube pour créer un ajustement par friction entre les deux morceaux de tube.

Fixez ensuite l’autre extrémité du morceau de tube le plus mince à l’entrée du dispositif microfluidique. Appliquez une pression sur la seringue pour remplir complètement les canaux avec la solution de fibronectine et pour créer une petite goutte de 100 microlitres au niveau de l’orifice d’observation pour vous assurer que les canaux restent humides. Maintenant, incubez le dispositif microfluidique dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes.

Après l’incubation, connectez une seringue fraîche remplie de PBS à l’aiguille à pointe émoussée. Appliquez une pression pour rincer le dispositif microfluidique avec du PBS. Préparez 500 000 à 2 millions de cellules par millilitre de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine, ou ayez dans un milieu de croissance endothéliale avec 8 % de dextran.

L’ajout de dextran augmente la probabilité que les cellules adhèrent et se cultivent avec succès dans le dispositif microfluidique. Remplissez, nettoyez la seringue équipée d’une aiguille à pointe émoussée et d’un tube plus large avec la suspension cellulaire et connectez une longueur de tube plus longue d’environ un mètre de long. Il est essentiel de s’assurer que le tube est bien ajusté pour éliminer les fuites entre les connexions.

Amorcez le tube avec une solution cellulaire, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles présentes dans la seringue ou dans l’un des tubes pour optimiser les performances du système. Il est essentiel à ce stade d’empêcher toute fuite ou bulle de pénétrer dans le système. Toute fuite de solution ou présence de bulles dans le milieu empêchera l’installation réussie des cellules endothéliales.

Une fois que toutes les bulles ont été éliminées et que toute la longueur du tube est amorcée avec une suspension cellulaire, placez la seringue sur la pompe et fixez l’autre extrémité à l’entrée microfluidique. Le pousse-seringue est réglé à la même hauteur que le dispositif microfluidique. La grande longueur du tube est soigneusement enroulée à l’intérieur de l’incubateur pour s’assurer que les cellules et les milieux sont suffisamment chauffés avant d’entrer en contact avec l’appareil.

Ensuite, la suspension cellulaire est infusée dans le dispositif microfluidique à un débit volumétrique de 1,23 microlitre par minute pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans notre système. Le taux volumétrique de grippe de 1,23 microlitre par minute correspond à une vitesse d’un millimètre par seconde dans les plus petits canaux. Cela correspond à une contrainte de cisaillement de paroi d’un centime par centimètre carré dans ces canaux en utilisant du sang total.

Une fois la perfusion de suspension cellulaire terminée, utilisez le même pousse-seringue et un long tube avec une seringue plus grande pour infuser un milieu de croissance frais pendant deux à huit jours à un taux de 1,23 microlitre par minute. Lorsque la monocouche cellulaire se trouve au niveau de confluence souhaité, injectez du sang ou une suspension cellulaire dans le système pour l’expérimentation. Ici, le dispositif microfluidique est montré avant l’endothélialisation.

Le dispositif microfluidique a été infusé avec du colorant alimentaire pour illustrer la taille, l’échelle et la conception globale du dispositif qui imite la physiologie du système vasculaire. La microscopie à fond clair révèle l’endothélialisation d’un dispositif microfluidique. Cette image a été acquise moins de 48 heures après l’ensemencement en utilisant le protocole décrit, la technique de perfusion optimisée permet aux cellules endothéliales de cultiver avec fluidité toute la surface interne du système microfluidique.

Dans les 24 à 48 heures suivant l’ensemencement cellulaire. Comme le montre cette image confocale, la tumeur microvasculaire sur une puce avec des microcanaux se rapproche de la taille de 30 microns des veles post-capillaires, le site de la plupart des événements d’obstruction microvasculaire drépanocytaire. Dans cette expérience, le sang total de patients en bonne santé est infusé dans un système vasculaire sur un dispositif à puce dans des conditions de désoxygénation.

Ce film montre que le flux de sang total dans notre système microfluidique endothélial est régulier, régulier et continu, sans zones d’obstruction des microcanaux. Ici, le sang total de patients atteints de drépanocytose est perfusé dans un microsystème vasculaire sur un dispositif à puce. Dans des conditions désoxygénées, des changements significatifs dans le flux sanguin sont observés avec des occlusions complètes présentes dans plusieurs canaux.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas introduire de bulles d’air lors du changement de tube. L’appareil fini est compatible avec la microscopie à fluorescence et peut être adapté aux tests de fluorescence traditionnels. Cette technique ouvre la voie aux hématologues expérimentaux pour mener des expériences en utilisant des cellules uniques dans un environnement biophysique et hémodynamique contrôlé.

Pas de bulles.