Microfluidique endothélialisée pour étudier les interactions microvasculaires dans Hémopathies

L'objectif général de cette procédure est de créer un dispositif microfluidique recouvert de cellules endothéliales. Cela est réalisé en fabriquant d'abord le moule microfluidique, puis en créant le canal en PDMS.

Ensuite, les cellules endothéliales sont semées dans le dispositif. La dernière étape consiste à cultiver les cellules à l'intérieur du dispositif. En définitive, les dispositifs microfluidiques revêtus de cellules endothéliales sont utilisés pour montrer les interactions entre cellules in vitro.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait qu'elle offre au chercheur un contrôle rigoureux des conditions biologiques et biophysiques et qu'elle est compatible avec la microscopie à fluorescence. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions biophysiques entre cellules dans les maladies hématologiques, elle peut également être appliquée à des phénomènes tels que la biologie des leucocytes, la métastase cancéreuse et la biologie des cellules souches hématopoïétiques. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les conditions doivent être strictement contrôlées afin d'obtenir un ancrage cellulaire réussi.

En prévision de la fabrication, créez un masque photographique en soumettant une image de conception assistée par ordinateur du dispositif microfluidique à un fournisseur externe de masques. Une fois reçu, le masque est constitué d'une couche de chrome sur du verre au calcaire sodé. Ici, la largeur du canal microfluidique est de 30 micromètres.

Pour commencer la fabrication du dispositif microfluidique, nettoyez un wafer de silicium nu avec du piranha pendant 15 minutes, puis rincez à l’eau déionisée pendant 10 secondes. Ensuite, immergez le wafer de silicium dans de l’acide fluorhydrique pendant 30 secondes, et rincez à l’eau déionisée pendant environ 10 secondes. Puis, à l’aide d’un spin coater, appliquez par centrifugation la résine photosensible SU 8 20 25 Micro Chem sur le wafer jusqu’à une épaisseur de 30 micromètres, en utilisant une vitesse de rotation de 3 000 tours par minute.

Placer la plaquette recouverte de SU 8 20 25 sur une plaque chauffante réglée à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes afin d'éliminer le solvant en excès. L'utilisation d'un four n'est pas recommandée pour cette étape. Placer ensuite le masque photolithographique sur la plaquette et exposer à la lumière UV dans un aligneur de masque afin de réticuler la résine photosensible SU 8 20 25.

Après la réticulation, replacer la plaquette sur la plaque chauffante à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes supplémentaires, afin d'accélérer davantage la polymérisation de la résine photosensible SU 8 20 25. Ensuite, immerger la plaquette dans le révélateur SU eight, composé principalement de P-G-M-E-A, pendant quatre minutes.

Cela permettra d'éliminer le photo-résiste SU 8 20 25 non réticulé. Rincez la plaquette nouvellement développée avec de l'alcool isopropylique à 100 % pendant 10 secondes, puis séchez-la à l'aide d'azote comprimé ou en laissant le solvant s'évaporer de la plaquette dans une hotte chimique propre pendant plusieurs minutes. Ensuite, fixez la plaquette sèche au centre de la boîte de Pétri à l'aide d'un ruban adhésif, en prenant soin de placer l'adhésif sur les bords de la plaquette.

Enfin, pipetez 500 microlitres de revêtement sigma sur la plaquette. Couvrez la boîte de Pétri avec son couvercle, puis faites tourner doucement la boîte afin d'assurer un enduit complet de la plaquette. Retirez le couvercle et laissez sécher la plaquette plusieurs minutes jusqu'à ce que tout le solvant se soit évaporé.

Après avoir mélangé le polymère PDMS et l'agent de réticulation selon un rapport de 10 à 1 en poids, éliminer les bulles d'air à l'aide d'un dessiccateur sous vide pendant plusieurs minutes à une heure, selon la puissance du système sous vide disponible. Une fois toutes les bulles d'air éliminées, verser le mélange dans la coupelle de manière à recouvrir complètement la plaquette et la surface de la coupelle. Pour obtenir une feuille de PDMS d'une épaisseur d'environ cinq millimètres.

Créez également un fin morceau sans caractéristique particulière en PDMS d'un millimètre d'épaisseur. Incubez ensuite le mélange toute la nuit dans un four à 60 degrés Celsius. Le lendemain, utilisez un couteau ou un scalpel pour découper autour de la plaquette et retirer plusieurs dispositifs microfluidiques en PDMS.

Ensuite, découpez la feuille pour isoler les dispositifs individuels. Découpez la feuille de PDMS légèrement plus grande que le dispositif microfluidique. Utilisez maintenant un foret de précision Harris Unicorn ou un dispositif similaire pour créer les orifices d'entrée et de sortie sur le dispositif microfluidique.

Ensuite, nettoyez les surfaces du dispositif microfluidique et de la feuille à l'aide de ruban adhésif. Puis utilisez un nettoyeur à plasma pour exposer les surfaces du dispositif microfluidique et de la feuille de PDMS à un plasma d'oxygène pendant 30 secondes. Le plasma d'oxygène crée des espèces réactives sur la surface exposée du PDMS, qui s'unissent lorsqu'elles sont mises en contact physique.

Ensuite, remplir une seringue de un millilitre munie d'une aiguille émoussie de calibre 20 avec 50 microgrammes par millilitre de fibronectine provenant du plasma humain dans du PBS, puis adapter un morceau de tubulure sur l'aiguille. Insérer un tube plus fin dans le premier morceau de tubulure afin de créer un raccordement par frottement entre les deux éléments.

Ensuite, reliez l'autre extrémité du tube plus fin à l'entrée du dispositif microfluidique. Appliquez une pression sur la seringue pour remplir complètement les canaux avec la solution de fibronectine et former une petite goutte de 100 microlitres à l'orifice de sortie afin de garantir que les canaux restent humides. Incubez maintenant le dispositif microfluidique dans une étuve humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes.

Après l'incubation, raccorder une seringue neuve remplie de PBS à l'aiguille à extrémité émoussée. Appliquer une pression pour rincer le dispositif microfluidique avec du PBS. Préparer 500 000 à 2 millions de cellules par millilitre de cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines, ou hve, en milieu de croissance endothélial contenant 8 % de dextran.

L'ajout de dextran augmente la probabilité que les cellules adhèrent et se développent avec succès dans le dispositif microfluidique. Remplir une seringue propre munie d'une aiguille à bout émoussé et d'un tube plus large avec la suspension cellulaire, puis raccorder un tronçon de tube plus long d'environ un mètre de longueur. Il est essentiel de s'assurer que le tube est bien ajusté afin d'éliminer tout risque de fuite au niveau des raccords.

Amorcez le tube avec la solution cellulaire, en vous assurant qu'il n'y ait aucune bulle présente ni dans la seringue ni dans les tubes, afin d'optimiser le fonctionnement du système. À ce stade, il est essentiel d'empêcher toute fuite ou formation de bulles dans le système. Toute fuite de solution ou présence de bulles dans le milieu empêchera le bon ancrage des cellules endothéliales.

Une fois toutes les bulles éliminées et sur toute la longueur du tube rempli de suspension cellulaire, placez la seringue sur la pompe et reliez l'autre extrémité à l'entrée microfluidique. La pompe à seringue est placée à la même hauteur que le dispositif microfluidique. La longue portion de tube est soigneusement enroulée à l'intérieur de l'incubateur afin de s'assurer que les cellules et le milieu soient correctement réchauffés avant d'entrer en contact avec le dispositif.

Ensuite, la suspension cellulaire est introduite dans le dispositif microfluidique à un débit volumétrique de 1,23 microlitres par minute pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans notre système. Le débit volumétrique de 1,23 microlitres par minute correspond à une vitesse en zone centrale d'un millimètre par seconde dans les canaux les plus étroits. Cela correspond approximativement à une contrainte de cisaillement pariétal d'un dyne par centimètre carré dans ces canaux en utilisant du sang total.

Une fois l'infusion de la suspension cellulaire terminée, utilisez la même pompe à seringue et le même tube long avec une seringue plus grande pour infuser du milieu de croissance frais pendant deux à huit jours à un débit de 1,23 microlitres par minute. Lorsque la monocouche cellulaire atteint le niveau de confluence souhaité, injectez du sang ou une suspension cellulaire dans le système pour l'expérimentation. Ici, le dispositif microfluidique est montré avant endothélialisation.

Le dispositif microfluidique a été rempli de colorant alimentaire afin d'illustrer la taille, l'échelle et la conception globale du dispositif, qui imite la physiologie du système vasculaire. La microscopie en champ clair révèle l'endothélialisation d'un dispositif microfluidique. Cette image a été acquise moins de 48 heures après l'ensemencement à l'aide du protocole décrit ; la technique de perfusion optimisée permet aux cellules endothéliales de former une culture confluente sur toute la surface interne du système microfluidique.

Entre 24 et 48 heures après l'ensemencement des cellules. Comme le montre cette image confocale, la tumeur microvasculaire sur puce avec des microcanaux présente une taille d'environ 30 microns, comparable à celle des veinules postcapillaires, site des événements obstructifs microvasculaires liés à la drépanocytose. Dans cette expérience, du sang total provenant de patients sains est perfusé dans une microvasculature intégrée à un dispositif sur puce, dans des conditions désaturées en oxygène.

Ce film montre que l'écoulement du sang total dans notre système microfluidique endothélial est régulier, homogène et continu, sans zones d'obstruction dans les microcanaux. Ici, du sang total provenant de patients atteints de drépanocytose est perfusé dans un réseau microvasculaire sur un dispositif en puce. Dans des conditions désossygénées, des modifications importantes de l'écoulement sanguin sont observées, avec des occlusions complètes présentes dans plusieurs canaux.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas introduire de bulles d'air lors du changement des tubulures. Le dispositif final est compatible avec la microscopie à fluorescence et peut être adapté à des essais de fluorescence classiques. Cette technique ouvre la voie aux hématologues expérimentaux pour mener des expériences sur des cellules uniques dans un environnement biophysique et hémodynamique contrôlé.

Pas de bulles.