En temps réel d'imagerie numérique de leucocytes-endothélial interaction dans l'ischémie-reperfusion (IRI) du muscle Cremaster Rat

La microscopie intravitale de la microcirculation du tissu matriciel CRE est une méthode pratique pour étudier l'ischémie et les lésions de reperfusion du tissu musculaire strié. Dans un protocole étape par étape, nous montrons comment débuter une anesthésie contrôlée par la respiration, sous surveillance adéquate par canulation artérielle, afin de maintenir l'animal profondément anesthésié pendant de longues périodes. Nous illustrons la technique de canulation de la veine jugulaire, puis décrivons la préparation du tissu matriciel CRE sous forme d'une fine lame plane, offrant une excellente résolution optique.

Nous fournissons un protocole d'imagerie des leucocytes dans la lésion de perfusion ischémique qui est bien établi dans nos laboratoires. Ce modèle peut être utilisé pour analyser l'activation des leucocytes lors d'une ischémie. Recherche sur la lésion de reperfusion.

La lésion de reperfusion est impliquée dans un large éventail de conditions pathologiques, telles que l'infarctus du myocarde, l'ischémie intestinale, ainsi que suite à une transplantation et à une chirurgie cardiovasculaire. L'hyperperfusion d'un tissu précédemment ischémique, bien qu'essentielle pour prévenir une lésion tissulaire irréversible, provoque une inflammation excessive du tissu affecté, associée à la production d'espèces réactives de l'oxygène, à l'activation du système du complément et à une perméabilité microvasculaire accrue. L'activation des leucocytes constitue l'un des principaux acteurs de la cascade pathologique de dommages tissulaires inflammatoires durant la reperfusion.

Nous proposons ici la microscopie intravitale du mésoentère post-capillaire comme méthode pratique pour analyser l'activation des leucocytes lors d'une lésion ischémie-reperfusion. Nous illustrons en outre les pièges courants et fournissons des conseils utiles qui permettront au lecteur d'apprécier pleinement cette méthode et de l'exécuter en toute sécurité. Après obtention de l'approbation du comité d'éthique, anesthésiez des rats mâles Sprague-Dawley d'un poids corporel compris entre 120 et 180 grammes, placez le rat dans une boîte en plexiglas et administrez 2 à 3 % en volume d'isoflurane au moyen d'un vaporisateur d'isoflurane.

Dès que le niveau approprié d'anesthésie est atteint, le rat est pesé et rasé au niveau de la région cervicale ventrale. Placez le rat en décubitus dorsal sur un tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle à 37 degrés Celsius, puis appliquez de l'isoflurane à deux pour cent en volume à l'aide d'un masque en silicone. Les préparations suivantes sont mieux réalisées à l'aide d'un microscope chirurgical.

Effectuez une incision cutanée horizontale de deux centimètres au niveau de l'incisure sternale des SRAs. Mobilisez latéralement les glandes salivaires. Vous êtes maintenant face aux muscles cervicaux ventraux.

Séparez-les soigneusement au niveau de la ligne médiane et repérez la trachée. Exposez un à deux centimètres de la trachée et placez une pince microchirurgicale par-dessous pour la soulever. Ensuite, insérez à moitié environ, par la face ventrale de la trachée, un tube de calibre 14 comme tube trachéal dans la partie inférieure de la trachée, préalablement reliée à un ventilateur pour animal.

La respiration peut ensuite être contrôlée en volume avec une fréquence de 35 à 45 cycles par minute. Un volume courant de 4,5 à cinq M et une concentration en fluorure ISO de 1,5 à deux pour cent en volume sont utilisés pour la canulation carotidienne. Le muscle sterno-hyoïdien droit est séparé par une dissection émoussée.

Pour localiser une artère carotide, séparer soigneusement le nerf vague de l'artère carotide et placer l'artère sur des pinces micro-dissectantes Anki afin d'arrêter le flux sanguin provenant du cœur, en utilisant deux ligatures situées sous l'artère carotide par rapport au cœur : la ligature la plus distale est nouée fermement, tandis que la ligature proximale est nouée lâchement autour de l'artère carotide. La pose d'une deuxième ligature proximale empêche les saignements après le retrait des pinces micro-dissectantes ; une petite incision est alors pratiquée dans l'artère carotide entre les deux ligatures à l’aide de ciseaux micro-chirurgicaux. Insérer un cathéter en polyéthylène rempli de solution saline isotonique, relié à un transducteur de pression.

Retirez la pince microchirurgicale et introduisez davantage le cathéter dans l'artère. Effectuez des analyses intermittentes des gaz sanguins artériels à l’aide d’un analyseur de gaz sanguins et maintenez le pH sanguin dans les limites physiologiques lors de l’administration intraveineuse de colorants fluorescents ou d'autres médicaments d'intérêt. Concentrez-vous sur la région de la veine jugulaire gauche à l’aide du microscope chirurgical, une pince dans chaque main, puis déchirez la fine fascia afin de mettre au jour la veine jugulaire.

Placer la veine sur une pince micro-fine inclinée afin d'arrêter l'écoulement sanguin. À l'aide de la pince, passer de chaque côté de la veine jugulaire deux morceaux de suture de même longueur, de manière identique à la canulation de la carotide ; pratiquer une petite incision dans la veine jugulaire et insérer un cathéter en polyéthylène préalablement rincé avec la solution de la lignée cellulaire. Introduire le cathéter en direction du cœur et serrer le ligature le plus proche du cœur.

Au niveau de la veine et du cathéter, nous utilisons un dispositif d'imagerie crématérique de stade quatre en aluminium qui adopte rapidement la température souhaitée du coussin chauffant. Une incision initiale est pratiquée dans la peau et le phy spermaticus externe au-dessus du scrotum, à l'extrémité la plus éloignée, suivie d'une dilatation prudente de l'espace sous-dermique à l'aide de fines ciseaux. Dès que le tissu est exposé, il est humidifié avec une solution saline préchauffée.

Le tissu conjonctif situé entre la fascia spermatique externe et le muscle CRE master est soigneusement retiré afin de libérer les muscles trimestriels des tissus environnants. Une superfusion continue pendant la dissection hydrate le tissu, ce qui facilite la visibilité et le retrait, notamment à l'extrémité distale du CRE master S, pour maintenir en place et légèrement étirer l'extrémité du S à l'intérieur de l'extrémité distale du sac sur l'aspect ventral, puis allonger l'incision de façon proximale. À l'aide de ciseaux microchirurgicaux, identifier soigneusement les vaisseaux sanguins en cours de saignement le long des lignes d'incision.

À l'aide d'un cory thermique, le muscle crémastère ouvert repose à plat sur la dose de socle en aluminium, restant connecté par de minces ligaments aux EPI situés sous le testicule, y compris une petite artère et une veine. Utilisez l'électrocoagulation pour sceller les vaisseaux et sectioner les ligaments conjonctifs entre les tissus discoïdal et crémastérique. Repoussez délicatement le testicule isolé dans le canal inguinal.

En plus de la première fixation, qui comprend quatre points de fixation du tissu, fixez délicatement les fils en étalant radialement le tissu crémasterique sur la platine en aluminium. Placez les deux extrémités d'un cathéter en polyéthylène près du tissu crémasterique pour mettre en place la perfusion superficielle. Tracez une ligne de gel de pétrolatum autour du muscle crémaster à l’aide d’une seringue afin de créer une chambre liquide.

Placer une lame carrée sur le tissu cric et fixer fermement les bords sur la ligne de vaseline. Le tissu crémaster est désormais prêt pour l'imagerie microscopique. Le dispositif de base pour l'imagerie in vivo peut varier.

Nous utilisons un microscope intra-vital à épifluorescence équipé d'une source lumineuse LED de 470 nanomètres pour la laminage EP. Grâce à un objectif à immersion dans l'eau, nous obtenons un grossissement d'environ 800 x et enregistrons l'observation à l'aide d'une caméra numérique haute résolution. Pour l'imagerie en épifluorescence, l'expérience doit être réalisée dans une pièce sombre.

Pour le marquage des leucocytes, injecter par voie intraveineuse, via le cathéter jugulaire, 0,4 milligramme par kilogramme de poids corporel de rumine six J. Choisir un vaisseau post-capillaire pour l'observation. Le diamètre du vaisseau doit être compris entre 20 et 60 micromètres et le débit sanguin doit être suffisant.

Avant l'ischémie, laissez le tissu se stabiliser pendant 30 minutes. Ensuite, effectuez un enregistrement de 30 secondes afin d'établir les valeurs basales du roulement et de l'adhérence des leucocytes. Placez délicatement une pince vasculaire Bemmer autour de l'extrémité la plus proximale du tissu crémastère exposé à l'aide de forceps d'application.

Retirer la pince sur le vaisseau après 30 minutes d'ischémie. Des enregistrements supplémentaires peuvent être effectués tout au long de la période de reperfusion. Pour la quantification du roulement des leucocytes, définir une ligne virtuelle qui coupe le vaisseau perpendiculairement, et qui est identique dans tous les enregistrements.

Comptez manuellement le nombre de leucocytes roulants qui franchissent la ligne en 30 secondes. Pour la quantification des leucocytes adhérents, définissez une section de vaisseau de 200 micromètres qui soit constante. Dans tous les enregistrements.

Comptez le nombre de leucocytes clairement visibles qui restent immobiles pendant 30 secondes. Des résultats représentatifs sont fournis dans le protocole écrit. Bien que l'ischémie-reperfusion ait été impliquée dans divers systèmes organiques, nous décrivons ici une méthode permettant d'analyser l'interaction leucocytes-endothélium lors d'une lésion de reperfusion du tissu musculaire strié.

Ainsi, particulièrement pertinent pour la chirurgie de lambeau, étant donné que l'on suppose que les lésions tissulaires post-ischémiques d'autres organes impliquent les mêmes mécanismes inflammatoires. La méthode décrite peut être utilisée pour obtenir des connaissances fondamentales sur les mécanismes pathologiques de la lésion par ischémie-reperfusion. L'induction d'une ischémie sur le muscle crémaster peut être facilement réalisée et reflète parfaitement des conditions cliniquement pertinentes telles que la chirurgie de lambeau libre.

De plus, des modifications telles que l'ischémie froide, l'ischémie chaude ou la perfusion superficielle chromosomique avec des substances influençant l'inflammation peuvent être facilement appliquées. L'injection intra-orale peut être la méthode de choix lorsque le traitement est nécessaire, plusieurs heures ou jours avant l'enregistrement.