Nano-FEM: la localisation des protéines en utilisant la microscopie Localisation Photo-actif et microscopie électronique

L'objectif général de l'expérience suivante est de localiser des protéines et des micrographies électroniques à l'aide d'une microscopie corrélée de fluorescence et électronique. Cette méthode, appelée nano FEM, est utilisée pour localiser des protéines dans C. elegans. Tout d'abord, un ver transgénique exprimant l'histone TD eos est inclus dans du plastique et sectionné.

Chaque section est imagée par microscopie d'activation photo-induite par localisation, ou PALM, et par microscopie électronique à balayage. Les deux micrographies de chaque section sont alignées à l'aide de marqueurs de repère en utilisant Photoshop. L'image corrélative montre la localisation des molécules d'histone dans le noyau.

Le principal avantage de la technique que nous allons décrire aujourd'hui est qu'au lieu d'utiliser la microscopie électronique immunologique, nous utilisons des marqueurs fluorescents génétiquement codés, de sorte que chaque protéine soit associée à une protéine fluorescente. Lorsqu'on utilise la microscopie électronique immunologique, de nombreux anticorps ne peuvent pas interagir avec les plastiques. Cela n'est tout simplement pas compatible, et même si c'est le cas, les anticorps ne parviennent pas à pénétrer profondément dans la section où se trouvent les antigènes.

En utilisant des protéines fluorescentes, chaque protéine est marquée avec un fluorophore. Aujourd'hui, Shige Wbi démontrera cette technique. La procédure suivante sera illustrée à l'aide de nématodes transgéniques exprimant des histones marquées par la protéine fluorescente TDE os.

Pour cette démonstration, nous utiliserons des bactéries comme agent protecteur cryogénique, mais vous pouvez également utiliser 20 % de BSA pour congeler *Caenorhabditis elegans*. Une heure avant la substitution par congélation, remplissez l'appareil automatique de substitution par congélation ou un dispositif de substitution par congélation avec de l'azote liquide. Préparez également à l'avance les fixatifs nécessaires conformément aux instructions du document joint, conservez les fixatifs en aliquots d'un millilitre dans des cryotubes, et placez-les dans de l'azote liquide jusqu'à leur utilisation.

Utilisez un pinceau pour prélever des animaux à partir d'une pelouse bactérienne et transférez-les afin de remplir un porte-échantillon de 100 microns. Remplissez légèrement le récipient pour vous assurer qu'aucun espace aérien n'est présent. Une fois prêt, placez le récipient contenant l'échantillon dans le porte-échantillon d'un congélateur à haute pression pour le congeler. Ensuite, transférez immédiatement l'échantillon dans un bain d'azote liquide situé à côté de la chambre de congélation.

Ensuite, à l'aide d'une pince et d'une paire de forceps, transférez l'échantillon dans un flacon cryogénique contenant des fixatifs. Veillez à ce que l'échantillon reste constamment immergé dans l'azote liquide. Répétez cette procédure pour chaque échantillon, puis transférez tous les flacons cryogéniques dans une unité FS.

Une fois que tous les cryotubes ont été placés dans une unité FS, lancez le programme. Le protocole de congélation et de traitement est illustré dans ce diagramme. Pendant l'incubation initiale à moins 90 degrés Celsius, la glace vitreuse est remplacée par le fixateur dans l'acétone.

Ensuite, lorsque la température de l'échantillon augmente, le fixateur contenu dans l'acétone liquide crée des liaisons croisées avec l'échantillon afin d'en préserver la structure. Lorsque la température dans une unité FS atteint moins 60 degrés Celsius, placer des vials scintillation contenant 20 millilitres d'acétone à 95 % dans l'unité FS pour les refroidir. Puis, lorsque la température atteint moins 50 degrés Celsius, utiliser une pipette Pasteur équipée d'une pointe P200 pour éliminer le fixateur et ajouter environ un millilitre d'acétone à 95 % prérefroidie à chaque échantillon.Bile.

Répétez ce processus toutes les 20 minutes pendant deux heures. Par ailleurs, pendant l'incubation à moins 50 degrés Celsius, placez un flacon de scintillation contenant 20 millilitres d'acétate d'uréthane à 0,1 % dans de l'acétone à 95 % dans une chambre FS afin de le prérefroidir à moins 50 degrés Celsius. Ensuite, après le dernier lavage à l'acétone, ajoutez environ un millilitre de solution d'acétate d'uréthane dans chaque flacon pour colorer l'échantillon et améliorer le contraste membranaire.

Si le programme a été mis en pause, redémarrez-le. Lorsque la température atteint moins 40 degrés Celsius, placez des vials de scintillation contenant de l'éthanol à 95 % dans la chambre FS. Lorsque la température atteint moins 30 degrés Celsius, utilisez une pipette Pasteur pour remplacer l'acétate d'urine par de l'éthanol à 95 % toutes les 20 minutes pendant deux heures.

Il est important d'utiliser de l'éthanol lors de cette étape, car la résine ne polymérisera pas en présence d'acétone. Dans la partie suivante du protocole, les échantillons sont inclus dans du plastique alors qu'ils sont à moins 30 degrés Celsius. Dans un FS, remplacer l'éthanol à 95 % par de la résine méthacrylate de glycol ou GMA à 30 % prérefroidie dans de l'éthanol à 95 % ; après trois à cinq heures, remplacer la GMA à 30 % par de la GMA à 70 % ; après quatre à six heures, éliminer la GMA à 70 % et incuber les échantillons dans de la GMA à 97 % toute la nuit.

L'augmentation progressive de la concentration de GMA permet la pénétration du milieu dans les tissus. Remarquez que, puisque 3 % d'eau est ajouté au résine GMA, le GMA à 97 % n'est pas dilué. Le lendemain, avec de l'éthanol, transférez les échantillons dans un moule d'inclusion dans l'A FS à l'aide d'une pipette Pasteur, placez les échantillons dans le moule d'inclusion, puis remplacez le GMA à 97 % par du GMA fraîchement préparé trois fois au cours de six heures à moins 30 degrés Celsius.

Après le troisième échange, tapotez doucement sur la matrice bactérienne pour séparer l'échantillon du cryoprotecteur. Ajoutez l'initiateur nn diméthyl udine au GMA à 97 % dans un flacon ventilé. La quantité d'initiateur ajoutée est de 1,5 microlitre par millilitre de GMA ; ajoutez immédiatement la solution de GMA dans chaque moule d'encapsulation et positionnez les animaux dans le moule de manière à ce qu'ils soient régulièrement espacés.

Redémarrez le programme afin que la température augmente jusqu'à moins 20 degrés Celsius. Bien que la résine polymérise rapidement en une heure, laissez le plastique durcir toute la nuit à moins 20 degrés Celsius, afin de vous assurer qu'il est complètement polymérisé.

Une fois que la plastification est terminée, conserver l'échantillon dans un sac sous vide rempli d'azote à moins 20 degrés Celsius. Le découpage des échantillons inclus en GMA doit ensuite être effectué comme décrit dans le document accompagnant la microscopie par localisation photoactivée ou l'imagerie palm. Le système microscopique doit être configuré avec la caméra E-M-C-C-D réglée à moins 70 degrés Celsius ou en dessous.

À l’aide d’une pipette, appliquez environ 50 microlitres de particules d’or de 100 nanomètres à une concentration de 1 × 10¹⁰ particules par millilitre en solution sur l’échantillon à imager. Placez un cache noir sur les échantillons et laissez la solution agir pendant 30 secondes sur la lame. Pour éliminer la solution d’or, poussez-la vers le bord de la lame et absorbez-la avec un essuie-tout.

Ensuite, appliquez de la graisse à vide sur un support circulaire pour lame couvre-objet et insérez la lame. Appliquez de l'huile à immersion sur la face inférieure de la lame. Placez-la directement sous l'échantillon.

Insérez le porte-échantillon dans la fente de la platine du microscope et ajustez-le de manière à ce qu'il soit bien serré et centre les sections au-dessus de l'objectif. Veillez particulièrement à ne pas toucher les objectifs. Ensuite, à l'aide d'un éclairage en champ clair, localisez les sections en utilisant un objectif de 10 x.

Ensuite, passez à l'objectif de 100 x et mettez l'échantillon au point. Si nécessaire, passez à l'illumination en fluorescence en utilisant le laser de 488 nanomètres avec une intensité réglée à 10 %. Attendez cinq minutes afin que la température de l'échantillon s'équilibre. Ensuite, identifiez les régions présentant la fluorescence la plus intense et mettez-les au point.

Passer aux lasers de 561 nanomètres et augmenter l'intensité à 100 %. Pour éliminer la fluorescence autofluorescente de fond, soumettre l'échantillon à un blanchiment pendant environ deux minutes. Si le foyer change pendant le blanchiment, attendre cinq minutes avant de régler le foyer et de capturer les images. Une fois le blanchiment terminé, activer le laser de 405 nanomètres et le régler à l'intensité la plus faible.

Commencez à acquérir les images à raison de 20 images par seconde. Acquérez suffisamment d'images pour atteindre l'objectif de l'expérience. Ici, 5 000 à 6 000 images sont prises afin de déterminer la localisation des protéines histones 584 au sein d'un noyau.

Une fois que 5 000 images ont été collectées, toutes les molécules sont identifiées et cartographiées par le logiciel d'imagerie. L'image finale de fluorescence, ou image dite de densité, est un assemblage de toutes les fluorescences détectées par la caméra. En revanche, l'image PALM cartographie l'OID de chaque tache fluorescente et indique uniquement l'emplacement de chaque protéine.

Avant l'imagerie en MEB, colorer les sections avec de l'acétate d'urane à 2,5 % dans l'eau pendant quatre minutes. Rincer soigneusement l'acétate d'urane avec de l'eau Milli-Q filtrée. Une fois les sections sèches, utiliser un pulvérisateur cathodique pour déposer une couche de carbone sur la lame jusqu'à ce qu'elle devienne suffisamment sombre.

Appliquez un ruban conducteur au carbone sur le bord de la lame couvre-objet à une extrémité et sur le support métallique à l'autre extrémité, afin que les électrons s'accumulant à la surface de la lame couvre-objet soient mis à la terre. Montez la lame couvre-objet dans la chambre du MEB et localisez l'échantillon au microscope. Prenez une image à faible grossissement de l'échantillon, puis zoomez sur la région d'intérêt et obtenez des images à fort grossissement.

Répétez ce processus avec une nouvelle section jusqu'à ce que toutes les sections aient été imagées. Ensuite, les images de la paume et celles de microscopie électronique en transmission (MET) doivent être alignées. Pour ce faire, ouvrez d'abord les images MEB acquises dans Photoshop.

Créez une nouvelle fenêtre avec des dimensions de 5 000 sur 5 000 pixels et une résolution de 300 pixels par pouce. Copiez l'image MEB à fort grossissement dans la nouvelle fenêtre. Utilisez la commande de transformation libre située dans le menu édition pour redimensionner l'image afin qu'elle remplisse entièrement la fenêtre.

Ensuite, copiez les images MEB à plus fort grossissement et redimensionnez-les ou transformez-les selon les besoins. Sélectionnez la rotation de l'image à partir de la barre de menu déroulante image et retournez horizontalement l'image somme de la pelouse bactérienne. Copiez et collez l'image somme de la pelouse bactérienne dans un nouveau calque.

Utilisez la commande de transformation libre située dans le menu édition pour redimensionner l'image afin qu'elle ait approximativement la même taille que le micrographique électronique à faible grossissement. Ensuite, faites pivoter l'image selon les besoins afin d'aligner la fluorescence des particules d'or avec les structures correspondantes visualisées en MEB. Puis, copiez l'image de la paume sur un nouveau calque et appliquez la même transformation afin d'extraire une image à plus fort grossissement.

Zoomer sur la région d’intérêt et copier l’image de la paume à partir de cette région. Coller l’image dans une image MEB de résolution plus élevée pour la présentation. Une transparence en dégradé doit être appliquée à l’image de la paume afin que seul le fond noir, et non les signaux de la paume, devienne transparent.

Copiez l'image de la paume transformée sur un nouveau calque. Sélectionnez les signaux de la paume mais pas l'arrière-plan en utilisant la fonction « plage de couleurs » dans le menu déroulant « sélectionner ». Ensuite, sélectionnez un pixel d'arrière-plan comme référence et activez l'option d'inversion.

Coupez les signaux de paume désirés et collez-les sur un nouveau calque. Appliquez une transparence au calque d'arrière-plan et réglez-la à 10 %. Cela permet de visualiser les signaux de paume en rendant l'arrière-plan transparent sans compromettre l'intensité. Protéine d'histone.

Le TD eos marqué par la protéine His 11 a été exprimé de façon stable chez le nématode C. elegans, et les animaux transgéniques ont été traités et observés selon le protocole décrit dans cette vidéo. Des microphotographies en microscopie optique et en microscopie électronique ont été obtenues à partir de la même coupe. Les nanoparticules d'or, visibles à la fois sur les images de fluorescence et sur les micrographies électroniques, ont ensuite été utilisées pour superposer les deux images.

Ici, nous effectuons un zoom sur une région située près de l'extrémité supérieure de la micrographie. Comme on peut le voir ici, des détails subcellulaires tels qu'un noyau.

Un noyau, des pores nucléaires et un réticulum endoplasmique peuvent être observés. Cependant, les molécules d'histone marquées sont exclusivement localisées dans le noyau, mais pas dans le noyau. Comme prévu, la microscopie correlative PALM et électronique permet ainsi une localisation des protéines avec la résolution la plus élevée. Après avoir réalisé cette procédure, on peut prendre ces sections contenant la distribution des protéines et les empiler à l'aide de la tomographie en réseau afin de générer une structure tridimensionnelle, qui montre où les protéines sont réparties dans la cellule.

Et souvenez-vous que, lors de l'utilisation de l'osmium tétraoxyde, il s'agit d'une substance chimique très dangereuse, et vous devez toujours porter des gants.