Name: Nano-FEM: la localisation des protéines en utilisant la microscopie Localisation Photo-actif et microscopie électronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Découvrez la localisation de protéines par microscopie de corrélation fluorescence-électronique dans C. elegans. Cette méthode nano-FEM utilise des protéines fluorescentes génétiquement encodées pour une imagerie cellulaire de haute résolution.

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Nous tenons à remercier Harald Hess et Eric Betzig pour l&#39;accès au microscope PALM pour preuve de principe expériences, Richard Fetter pour les protocoles de partage de fixation, des réactifs et des encouragements. Nous remercions Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema et Marc Hammarlund pour des constructions d&#39;ADN. Nous remercions également Carl Zeiss Inc pour fournir un accès à l&#39;Zeiss PAL-M, une version bêta du microscope Zeiss Elyra P.1 PALM.

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Production et le libre accès à cet article est sponsorisé par Carl Zeiss, Inc

Nous décrivons ici comment préserver protéines fluorescentes en plastique, de localiser les protéines fluorescentes dans les sections, et l&#39;image de l&#39;ultrastructure en microscopie électronique. Les protéines ont été localisées en dessous de la limite de diffraction en microscopie PALM à résolution nanométrique. Pour adapter ce protocole aux spécimens particuliers, les paramètres suivants doivent être considérés: fluorophore, la quantification et l&#39;alignement. Le choix d&#39;une protéine fluorescente ou fluorophore organique dépend de l&#39;application et du système modèle. Nous avons testé une variété de protéines fluorescentes, y compris EGFP, YFP, Citrine, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry et Dendra 12. La préservation de la fluorescence de chaque fluorophore était similaire, ce qui suggère que toutes les protéines fluorescentes peuvent être conservés à l&#39;aide de la méthode décrite. Nous avons choisi tdEos car il a bien exprimé dans C. elegans, les protéines demeurées fonctionnelles lorsqu&#39;il est fusionné à tdEos, et parce que sonphoto-activation caractéristiques sont optimales pour la microscopie PALM. Cependant, l&#39;expression d&#39;agrégation ou pas de tdEos a parfois été observée 12. Selon l&#39;application, un fluorophore différent peut-être mieux. Dans de nombreux cas, il n&#39;est pas nécessaire d&#39;utiliser une protéine fluorescente photo-activée. Simple microscopie électronique corrélative de fluorescence ne nécessite pas de photo-activé protéine fluorescente. GFP ou des colorants organiques peuvent être utilisés à fluorescence image à partir de protéines marquées dans les sections ci-dessus de la limite de diffraction. Par exemple, une boîte d&#39;image d&#39;un axone dans un neuropile en utilisant la microscopie par fluorescence et de corréler le signal de fluorescence d&#39;un axone particulier dans une micrographie électronique d&#39;imagerie par fluorescence sur l&#39;un microscope à fluorescence. D&#39;autres techniques de super-résolution, telles que la microscopie d&#39;émission stimulée épuisement (STED) 12, la microscopie appauvrissement de l&#39;état fondamental suivi par le retour molécule individuelle (GSDIM) 13, etmicroscopie illumination structurée (SIM) 14, n&#39;ont pas besoin de photo-activés protéines fluorescentes. En outre, de super-résolution des techniques d&#39;imagerie utilisant des colorants organiques 9,15,16 ou la propriété intrinsèque des sondes fluorescentes 17 sont facilement applicables. Dans PALM, le nombre de molécules peuvent être quantifiés en raison de fluorescence de chaque molécule est séparé spatialement et temporellement. Cependant, la quantification peut être trompeuse pour quatre raisons: oxydation, sous-estimation, surdénombrement, et la surexpression. Tout d&#39;abord, une fraction des protéines fluorescentes peuvent être dénaturé ou oxydée pendant le traitement d&#39;échantillons 5,12. Bien que ~ 90% du signal de fluorescence a été préservée grâce à la fixation et l&#39;inclusion dans notre protocole, l&#39;oxydation de la protéine fluorescente peut se produire après que l&#39;échantillon a été sectionné et la surface exposée à l&#39;oxygène. D&#39;autre part, l&#39;activation des protéines photo-activables est stochastique, et ainsi de multiples molécules peuvent êtreactivés dans une tache de diffraction donnée limitée 8. Fluorescence des molécules multiples apparaîtra comme une tache, et donc le nombre total de protéines vont être sous-estimés. Troisièmement, un problème similaire peut conduire à surdénombrement. Dans PALM, chaque protéine fluorescente est localisée puis «effacées» par le blanchiment. Toutefois, les protéines fluorescentes peut revenir de l&#39;état sombre sans être définitivement blanchi 18. Ces molécules seront ensuite comptée plusieurs fois. Quatrièmement, les protéines marquées sont exprimés en transgènes et sont souvent présents en plusieurs exemplaires, ce qui peut conduire à une surexpression. Par conséquent, la quantification de PALM peut être utilisée pour estimer, mais pas de déterminer avec précision le nombre de molécules dans un lieu donné. L&#39;alignement d&#39;une image PALM avec une micrographie électronique peut aussi être difficile à cause de la différence de résolution en microscopie optique et électronique et la distorsion provoquée par le faisceau d&#39;électrons. Les particules d&#39;or servent bien loclisés marqueurs repères dans micrographies électroniques. Cependant, fluoresecence de particules d&#39;or n&#39;est pas photo-activé, et apparaît comme une grande tache limitée par la diffraction. Ainsi, la mise en place d&#39;une image de fluorescence sur une micrographie électronique est une estimation. Distorsions peuvent également survenir des interactions des électrons avec la partie plastique. Résines acryliques tels que les GMA sont moins stables sous le faisceau d&#39;électrons, et les dimensions de la matière plastique peut être modifié. Dans ces circonstances, l&#39;alignement de la fluorescence avec ultrastructure peut exiger une transformation non linéaire des marqueurs fiduciaires.

<table border="1"><tbody><tr><td> Le nom du réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Haute pression congélateur </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPACT et HPM 100 de Leica ou hpf-01 de Wohlwend peut également être utilisé. </td></tr><tr><td> Automatisé unité cryosubstitution </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 peut également être utilisé. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon et Vutara vendent aussi des microscopes PALM commerciales. </td></tr><tr><td> Microscope électronique à balayage </td><td> FEI </td><td> Nouvelle nano </td><td> D&#39;autres haute résolution des microscopes MEB peuvent être utilisées. </td></tr><tr><td> Acétone </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Le permanganate de potassium </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine de sérum bovin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;uranyle </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH de l&#39;acétate d&#39;uranyle de cette compagnie est légèrement plus élevé. </td></tr><tr><td> Méthacrylate (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Acide faible, la qualité du TEM. </td></tr><tr><td> N, N-diméthyl-p-toluidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes Cryo </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Flacons en verre </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Film de Aclar </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM capsule </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polypropylène </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC poinçons </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Les nanoparticules d&#39;or </td><td> microsphères-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Demander 2x solution concentrée </td></tr></tbody></table>

nano-fem: la localisation des protéines en utilisant la microscopie localisation photo-actif et microscopie électronique

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Cartographie de la répartition des protéines est essentielle pour comprendre la fonction des protéines dans une cellule. La microscopie à fluorescence est largement utilisé pour la localisation des protéines, mais le contexte subcellulaire est souvent absent dans les images de fluorescence. Immuno-microscopie électronique, d&#39;autre part, peuvent localiser les protéines, mais la technique est limitée par un manque d&#39;anticorps compatibles, la préservation de la morphologie des pauvres et parce que la plupart des antigènes sont pas exposés à la surface de l&#39;échantillon. Approches corrélatives peuvent acquérir l&#39;image de fluorescence d&#39;une cellule toute la première, soit à partir de l&#39;immuno-fluorescence ou de protéines génétiquement marqués. L&#39;échantillon est ensuite fixé et intégré pour la microscopie électronique, et les images sont corrélées 1-3. Cependant, l&#39;image basse résolution fluorescence et le manque de marqueurs fiduciaires obstacle à la localisation précise des protéines. Alternativement, l&#39;imagerie de fluorescence peut être fait après préservant l&#39;échantillon dans du plastique. Encette approche, le bloc est sectionné, et les images de fluorescence et micrographies électroniques de la même section sont corrélées 4-7. Cependant, la limite de diffraction de la lumière dans l&#39;image corrélé obscurcit les emplacements des molécules individuelles, et la fluorescence s&#39;étend souvent au-delà de la limite de la cellule. Nano-résolution de fluorescence par microscopie électronique (nano-FEM) est conçu pour localiser les protéines à l&#39;échelle nanométrique par imagerie les mêmes sections en utilisant la microscopie localisation photo-activé (PALM) et la microscopie électronique. PALM surmonte la limite de diffraction individuels d&#39;imagerie par fluorescence des protéines et ensuite la cartographie du centroïde de chaque tache fluorescente 8-10. Nous décrivons la technique de nano-FEM en cinq étapes. Tout d&#39;abord, l&#39;échantillon est fixe et intégrée en utilisant des conditions qui préservent la fluorescence des protéines marquées. D&#39;autre part, les blocs de résine sont coupés en segments ultraminces (70-80 nm) qui sont montéssur un verre de recouvrement. Troisièmement, la fluorescence est représenté dans ces sections en utilisant le microscope Zeiss PALM. Quatrièmement, électrons structures denses sont imagés dans ces mêmes articles à l&#39;aide d&#39;un microscope électronique à balayage. Cinquièmement, les micrographies de fluorescence et électronique sont alignées en utilisant des particules d&#39;or comme marqueurs fiduciaires. En résumé, la localisation subcellulaire des protéines marquées par fluorescence peut être déterminée à une résolution nanométrique dans environ une semaine.

Nous décrivons une méthode pour localiser les protéines marquées par fluorescence en microscopie électronique. Fluorescence est d&#39;abord localisée en utilisant la microscopie localisation photo-activé sur coupes ultrafines. Ces images sont ensuite alignées à micrographies électroniques de la même section.

Nano-FEM: la localisation des protéines en utilisant la microscopie Localisation Photo-actif et microscopie électronique

La cartographie de la distribution des protéines est essentielle pour comprendre la fonction des protéines au sein d'une cellule. La microscopie à fluorescence est largement utilisée pour...

L'objectif général de l'expérience suivante est de localiser des protéines et des micrographies électroniques à l'aide d'une microscopie corrélée de fluorescence et électronique. Cette méthode, appelée nano FEM, est utilisée pour localiser des protéines dans C. elegans. Tout d'abord, un ver transgénique exprimant l'histone TD eos est inclus dans du plastique et sectionné.Chaque section est imagée par microscopie d'activation photo-induite par localisation, ou PALM, et par microscopie électronique à balayage. Les deux micrographies de chaque section sont alignées à l'aide de marqueurs de repère en utilisant Photoshop. L'image corrélative montre la localisation des molécules d'histone dans le noyau.Le principal avantage de la technique que nous allons décrire aujourd'hui est qu'au lieu d'utiliser la microscopie électronique immunologique, nous utilisons des marqueurs fluorescents génétiquement codés, de sorte que chaque protéine soit associée à une protéine fluorescente. Lorsqu'on utilise la microscopie électronique immunologique, de nombreux anticorps ne peuvent pas interagir avec les plastiques. Cela n'est tout simplement pas compatible, et même si c'est le cas, les anticorps ne parviennent pas à pénétrer profondément dans la section où se trouvent les antigènes.En utilisant des protéines fluorescentes, chaque protéine est marquée avec un fluorophore. Aujourd'hui, Shige Wbi démontrera cette technique. La procédure suivante sera illustrée à l'aide de nématodes transgéniques exprimant des histones marquées par la protéine fluorescente TDE os.Pour cette démonstration, nous utiliserons des bactéries comme agent protecteur cryogénique, mais vous pouvez également utiliser 20 % de BSA pour congeler *Caenorhabditis elegans*. Une heure avant la substitution par congélation, remplissez l'appareil automatique de substitution par congélation ou un dispositif de substitution par congélation avec de l'azote liquide. Préparez également à l'avance les fixatifs nécessaires conformément aux instructions du document joint, conservez les fixatifs en aliquots d'un millilitre dans des cryotubes, et placez-les dans de l'azote liquide jusqu'à leur utilisation.Utilisez un pinceau pour prélever des animaux à partir d'une pelouse bactérienne et transférez-les afin de remplir un porte-échantillon de 100 microns. Remplissez légèrement le récipient pour vous assurer qu'aucun espace aérien n'est présent. Une fois prêt, placez le récipient contenant l'échantillon dans le porte-échantillon d'un congélateur à haute pression pour le congeler. Ensuite, transférez immédiatement l'échantillon dans un bain d'azote liquide situé à côté de la chambre de congélation.Ensuite, à l'aide d'une pince et d'une paire de forceps, transférez l'échantillon dans un flacon cryogénique contenant des fixatifs. Veillez à ce que l'échantillon reste constamment immergé dans l'azote liquide. Répétez cette procédure pour chaque échantillon, puis transférez tous les flacons cryogéniques dans une unité FS.Une fois que tous les cryotubes ont été placés dans une unité FS, lancez le programme. Le protocole de congélation et de traitement est illustré dans ce diagramme. Pendant l'incubation initiale à moins 90 degrés Celsius, la glace vitreuse est remplacée par le fixateur dans l'acétone.Ensuite, lorsque la température de l'échantillon augmente, le fixateur contenu dans l'acétone liquide crée des liaisons croisées avec l'échantillon afin d'en préserver la structure. Lorsque la température dans une unité FS atteint moins 60 degrés Celsius, placer des vials scintillation contenant 20 millilitres d'acétone à 95 % dans l'unité FS pour les refroidir. Puis, lorsque la température atteint moins 50 degrés Celsius, utiliser une pipette Pasteur équipée d'une pointe P200 pour éliminer le fixateur et ajouter environ un millilitre d'acétone à 95 % prérefroidie à chaque échantillon.Bile.Répétez ce processus toutes les 20 minutes pendant deux heures. Par ailleurs, pendant l'incubation à moins 50 degrés Celsius, placez un flacon de scintillation contenant 20 millilitres d'acétate d'uréthane à 0,1 % dans de l'acétone à 95 % dans une chambre FS afin de le prérefroidir à moins 50 degrés Celsius. Ensuite, après le dernier lavage à l'acétone, ajoutez environ un millilitre de solution d'acétate d'uréthane dans chaque flacon pour colorer l'échantillon et améliorer le contraste membranaire.Si le programme a été mis en pause, redémarrez-le. Lorsque la température atteint moins 40 degrés Celsius, placez des vials de scintillation contenant de l'éthanol à 95 % dans la chambre FS. Lorsque la température atteint moins 30 degrés Celsius, utilisez une pipette Pasteur pour remplacer l'acétate d'urine par de l'éthanol à 95 % toutes les 20 minutes pendant deux heures.Il est important d'utiliser de l'éthanol lors de cette étape, car la résine ne polymérisera pas en présence d'acétone. Dans la partie suivante du protocole, les échantillons sont inclus dans du plastique alors qu'ils sont à moins 30 degrés Celsius. Dans un FS, remplacer l'éthanol à 95 % par de la résine méthacrylate de glycol ou GMA à 30 % prérefroidie dans de l'éthanol à 95 % ; après trois à cinq heures, remplacer la GMA à 30 % par de la GMA à 70 % ; après quatre à six heures, éliminer la GMA à 70 % et incuber les échantillons dans de la GMA à 97 % toute la nuit.L'augmentation progressive de la concentration de GMA permet la pénétration du milieu dans les tissus. Remarquez que, puisque 3 % d'eau est ajouté au résine GMA, le GMA à 97 % n'est pas dilué. Le lendemain, avec de l'éthanol, transférez les échantillons dans un moule d'inclusion dans l'A FS à l'aide d'une pipette Pasteur, placez les échantillons dans le moule d'inclusion, puis remplacez le GMA à 97 % par du GMA fraîchement préparé trois fois au cours de six heures à moins 30 degrés Celsius.Après le troisième échange, tapotez doucement sur la matrice bactérienne pour séparer l'échantillon du cryoprotecteur. Ajoutez l'initiateur nn diméthyl udine au GMA à 97 % dans un flacon ventilé. La quantité d'initiateur ajoutée est de 1,5 microlitre par millilitre de GMA ; ajoutez immédiatement la solution de GMA dans chaque moule d'encapsulation et positionnez les animaux dans le moule de manière à ce qu'ils soient régulièrement espacés.Redémarrez le programme afin que la température augmente jusqu'à moins 20 degrés Celsius. Bien que la résine polymérise rapidement en une heure, laissez le plastique durcir toute la nuit à moins 20 degrés Celsius, afin de vous assurer qu'il est complètement polymérisé.Une fois que la plastification est terminée, conserver l'échantillon dans un sac sous vide rempli d'azote à moins 20 degrés Celsius. Le découpage des échantillons inclus en GMA doit ensuite être effectué comme décrit dans le document accompagnant la microscopie par localisation photoactivée ou l'imagerie palm. Le système microscopique doit être configuré avec la caméra E-M-C-C-D réglée à moins 70 degrés Celsius ou en dessous.À l’aide d’une pipette, appliquez environ 50 microlitres de particules d’or de 100 nanomètres à une concentration de 1 × 10¹⁰ particules par millilitre en solution sur l’échantillon à imager. Placez un cache noir sur les échantillons et laissez la solution agir pendant 30 secondes sur la lame. Pour éliminer la solution d’or, poussez-la vers le bord de la lame et absorbez-la avec un essuie-tout.Ensuite, appliquez de la graisse à vide sur un support circulaire pour lame couvre-objet et insérez la lame. Appliquez de l'huile à immersion sur la face inférieure de la lame. Placez-la directement sous l'échantillon.Insérez le porte-échantillon dans la fente de la platine du microscope et ajustez-le de manière à ce qu'il soit bien serré et centre les sections au-dessus de l'objectif. Veillez particulièrement à ne pas toucher les objectifs. Ensuite, à l'aide d'un éclairage en champ clair, localisez les sections en utilisant un objectif de 10 x.Ensuite, passez à l'objectif de 100 x et mettez l'échantillon au point. Si nécessaire, passez à l'illumination en fluorescence en utilisant le laser de 488 nanomètres avec une intensité réglée à 10 %. Attendez cinq minutes afin que la température de l'échantillon s'équilibre. Ensuite, identifiez les régions présentant la fluorescence la plus intense et mettez-les au point.Passer aux lasers de 561 nanomètres et augmenter l'intensité à 100 %. Pour éliminer la fluorescence autofluorescente de fond, soumettre l'échantillon à un blanchiment pendant environ deux minutes. Si le foyer change pendant le blanchiment, attendre cinq minutes avant de régler le foyer et de capturer les images. Une fois le blanchiment terminé, activer le laser de 405 nanomètres et le régler à l'intensité la plus faible.Commencez à acquérir les images à raison de 20 images par seconde. Acquérez suffisamment d'images pour atteindre l'objectif de l'expérience. Ici, 5 000 à 6 000 images sont prises afin de déterminer la localisation des protéines histones 584 au sein d'un noyau.Une fois que 5 000 images ont été collectées, toutes les molécules sont identifiées et cartographiées par le logiciel d'imagerie. L'image finale de fluorescence, ou image dite de densité, est un assemblage de toutes les fluorescences détectées par la caméra. En revanche, l'image PALM cartographie l'OID de chaque tache fluorescente et indique uniquement l'emplacement de chaque protéine.Avant l'imagerie en MEB, colorer les sections avec de l'acétate d'urane à 2,5 % dans l'eau pendant quatre minutes. Rincer soigneusement l'acétate d'urane avec de l'eau Milli-Q filtrée. Une fois les sections sèches, utiliser un pulvérisateur cathodique pour déposer une couche de carbone sur la lame jusqu'à ce qu'elle devienne suffisamment sombre.Appliquez un ruban conducteur au carbone sur le bord de la lame couvre-objet à une extrémité et sur le support métallique à l'autre extrémité, afin que les électrons s'accumulant à la surface de la lame couvre-objet soient mis à la terre. Montez la lame couvre-objet dans la chambre du MEB et localisez l'échantillon au microscope. Prenez une image à faible grossissement de l'échantillon, puis zoomez sur la région d'intérêt et obtenez des images à fort grossissement.Répétez ce processus avec une nouvelle section jusqu'à ce que toutes les sections aient été imagées. Ensuite, les images de la paume et celles de microscopie électronique en transmission (MET) doivent être alignées. Pour ce faire, ouvrez d'abord les images MEB acquises dans Photoshop.Créez une nouvelle fenêtre avec des dimensions de 5 000 sur 5 000 pixels et une résolution de 300 pixels par pouce. Copiez l'image MEB à fort grossissement dans la nouvelle fenêtre. Utilisez la commande de transformation libre située dans le menu édition pour redimensionner l'image afin qu'elle remplisse entièrement la fenêtre.Ensuite, copiez les images MEB à plus fort grossissement et redimensionnez-les ou transformez-les selon les besoins. Sélectionnez la rotation de l'image à partir de la barre de menu déroulante image et retournez horizontalement l'image somme de la pelouse bactérienne. Copiez et collez l'image somme de la pelouse bactérienne dans un nouveau calque.Utilisez la commande de transformation libre située dans le menu édition pour redimensionner l'image afin qu'elle ait approximativement la même taille que le micrographique électronique à faible grossissement. Ensuite, faites pivoter l'image selon les besoins afin d'aligner la fluorescence des particules d'or avec les structures correspondantes visualisées en MEB. Puis, copiez l'image de la paume sur un nouveau calque et appliquez la même transformation afin d'extraire une image à plus fort grossissement.Zoomer sur la région d’intérêt et copier l’image de la paume à partir de cette région. Coller l’image dans une image MEB de résolution plus élevée pour la présentation. Une transparence en dégradé doit être appliquée à l’image de la paume afin que seul le fond noir, et non les signaux de la paume, devienne transparent.Copiez l'image de la paume transformée sur un nouveau calque. Sélectionnez les signaux de la paume mais pas l'arrière-plan en utilisant la fonction « plage de couleurs » dans le menu déroulant « sélectionner ». Ensuite, sélectionnez un pixel d'arrière-plan comme référence et activez l'option d'inversion.Coupez les signaux de paume désirés et collez-les sur un nouveau calque. Appliquez une transparence au calque d'arrière-plan et réglez-la à 10 %. Cela permet de visualiser les signaux de paume en rendant l'arrière-plan transparent sans compromettre l'intensité. Protéine d'histone.Le TD eos marqué par la protéine His 11 a été exprimé de façon stable chez le nématode C. elegans, et les animaux transgéniques ont été traités et observés selon le protocole décrit dans cette vidéo. Des microphotographies en microscopie optique et en microscopie électronique ont été obtenues à partir de la même coupe. Les nanoparticules d'or, visibles à la fois sur les images de fluorescence et sur les micrographies électroniques, ont ensuite été utilisées pour superposer les deux images.Ici, nous effectuons un zoom sur une région située près de l'extrémité supérieure de la micrographie. Comme on peut le voir ici, des détails subcellulaires tels qu'un noyau.Un noyau, des pores nucléaires et un réticulum endoplasmique peuvent être observés. Cependant, les molécules d'histone marquées sont exclusivement localisées dans le noyau, mais pas dans le noyau. Comme prévu, la microscopie correlative PALM et électronique permet ainsi une localisation des protéines avec la résolution la plus élevée. Après avoir réalisé cette procédure, on peut prendre ces sections contenant la distribution des protéines et les empiler à l'aide de la tomographie en réseau afin de générer une structure tridimensionnelle, qui montre où les protéines sont réparties dans la cellule.Et souvenez-vous que, lors de l'utilisation de l'osmium tétraoxyde, il s'agit d'une substance chimique très dangereuse, et vous devez toujours porter des gants.

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JoVE Journal

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