Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

L’objectif global de cette procédure est de générer des souris adultes à partir de cellules souches pluripotentes induites, ou CSP I, par complémentation embryonnaire tétraploïde. Ceci est accompli en arrivant en premier. I PSCs à partir de fibroblastes embryonnaires de souris utilisant des lentivirus, porteurs de OCT quatre, SOX deux, KLA quatre et cmic et complétant le milieu avec de l’acide valproïque ou VPA.

Une fois que les IPC sont générées, elles sont caractérisées par l’immunomarquage, le comptage des chromosomes et la formation du corps embryonnaire. L’étape suivante consiste à générer une assistance tétraploïde réceptrice par fusion et culture in vitro. Par la suite, les IPSC sont injectés dans l’assistance à la dynamisation tétraploïde et l’assistance à la dynamisation complète est transplantée chez les femelles receveuses pour la gestation.

Dans la dernière étape, les animaux nés à terme sont mis au monde par césarienne et à des mères porteuses. Ainsi, le développement postnatal peut être surveillé. En fin de compte, si des animaux à terme viables sont générés.

La lignée IPSC est considérée comme entièrement pluripotente. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes de génération de cellules I PSC est que notre méthode génère de manière reproductible des lignées cellulaires IPS entièrement pluripotentes. Les lignées cellulaires IPS générées par ces méthodes peuvent être utiles à d’autres chercheurs souhaitant comparer la pluripotence de leurs cellules IPS ou établir l’équivalence d’autres méthodes de reprogrammation. Ces méthodes seront utiles aux chercheurs souhaitant générer des lignées cellulaires IPS entièrement pluripotentes pour des applications spécifiques en aval telles que les tests de différenciation in vitro.

Poursuivre la génération de toutes les souris IPSC. L’utilisation de la complémentation telo peut servir de moyen utile pour déterminer la stabilité génétique et épigénétique de diverses lignées cellulaires. Les manipulations micrométriques impliquées dans la complémentation de l’embryon tétraploïde sont techniquement difficiles.

Il peut s’écouler plusieurs mois avant qu’une personne ne devienne compétente Dans les techniques IPSC développées par cette technique, ces conditions de culture nécessitent des conditions de culture similaires à celles utilisées dans les expériences traditionnelles de ciblage des gènes ESL. 24 heures après la transfection des cellules T HEC 2 9 3 avec le lentivirus. Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 25 millilitres de technologie préchauffée fraîche.

Milieu de retour TRANSFECTED hex dans l’incubateur pendant 24 heures, 48 heures après la transfection de cellules HEC 2 9 3 T avec lentivirus collectent le milieu de croissance contenant des particules lentivirales des cellules transfectées. Éliminer les débris particulaires du milieu contenant le virus par centrifugation à 3000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, concentrez le virus par ultracentrifugation à travers un coussin de saccharose à 20 % pendant deux heures à 112 000 G à quatre degrés Celsius.

Transvasez-le soigneusement dans un conteneur à déchets pour la décontamination sans déranger la pastille virale. Remettez en suspension la pastille virale dans 0,4 millilitre de milieu de fibroblaste embryonnaire de souris et scellez le tube. Ensuite, balancez-le doucement à quatre degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.

Stockez les particules virales et les aliquotes à usage unique à moins 80 degrés Celsius. Les lignées sont dérivées de fibroblastes embryonnaires de souris, ou cellules de méthamphétamine. Une fois que les colonies IPSC possèdent une bordure bien définie et réfractive brillante et contiennent 30 à 50 cellules, elles sont prêtes à être cueillies manuellement et étendues en lignes IPSC indépendantes.

Prélevez des colonies individuelles à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel et transférez chaque colonie directement dans un seul puits d’une plaque de 96 puits à fond en U contenant 20 microlitres de 0,25 % de trypsine, d’EDTA, d’incuber des colonies et de trypsine pendant environ huit minutes à 37 degrés Celsius ou jusqu’à ce que les colonies se dissocient en cellules uniques. Surveiller l’évolution de la dissociation par microscopie optique. Une tation douce peut être nécessaire.

Transférez la suspension cellulaire dissociée dans une plaque de 96 puits contenant une couche nourricière et 150 microlitres de milieu ESC complété par de la doxycycline et du VPA Lorsque les colonies IPSC réapparaissent dans chaque puits, divisées en puits plus grands pour l’analyse et la mise en banque de cellules à l’aide des procédures standard de dérivation ESC et de culture cellulaire pour commencer la procédure de génération d’assistance à l’explosion tétraploïde. Des embryons d’une cellule prélevés sur des souris femelles sont cultivés sur deux embryons cellulaires pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone le lendemain. Placez une micro lame BTX dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.

Versez suffisamment de média d’électrofusion à température ambiante pour immerger la lame dans la solution, mais pas au point que les pôles de l’électrode soient complètement immergés. Allumez le manipulateur de cellules électrocellulaires BTX ECM 2001 et le BTX enhancer 400. Connectez les câbles ECM à l’électrode des micro-lames et fixez les câbles sur le côté de la boîte de Pétri pour éviter tout mouvement involontaire de la lame.

Exécutez une impulsion manuelle pour obtenir une lecture sur l’amplificateur BTX et notez la tension des courants continus appliqués. Le courant alternatif contrôlera la vitesse à laquelle les embryons s’alignent entre les électrodes. Le courant continu fusionnera les blasphémateurs et le temps d’impulsion définira la durée de l’impulsion CC.

Un bon point de départ est AC trois volts DC 100 volts et fois 0,05 milliseconde. Le courant continu optimal varie dans la plage de 90 à 150 volts. À l’aide d’une pipette à bouche.

Prenez 30 à 42 embryons cellulaires de la culture KSOM et transférez-les dans une goutte d’électrofusion. Laver à travers plusieurs gouttes de médium électro-fusion. Ensuite, prélevez un milieu d’électrofusion frais du plat à micro-lames dans la pipette à bouche.

Prenez des embryons lavés et placez-les dans l’espace d’un millimètre entre les électrodes sur la micro-lame. Veillez à ce que les embryons soient alignés au milieu de l’espace et ne soient pas en contact les uns avec les autres. Appliquez le courant alternatif en appuyant sur le bouton de démarrage manuel.

Les embryons tourneront dans le champ alternatif jusqu’à ce que le plan de contact plus blasier soit parallèle aux électrodes. Si les embryons ne sont pas alignés en quelques secondes, augmentez le réglage AC. Une fois les embryons alignés, appuyez à nouveau sur le bouton de démarrage manuel pour appliquer l’impulsion DC avec le milieu d’électrofusion dans la pipette.

Prélevez les embryons à partir de la micro-lame, lavez les embryons à travers plusieurs gouttes de milieu KSOM, puis cultivez les embryons dans KSOM sous de l’huile minérale à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. La fusion du blaster devrait être terminée en moins de 30 minutes. En culture, surveiller et sélectionner avec succès les embryons avec des blastomères fusionnés.

embryons fusionnés sembleront être au stade d’une cellule, jetés lysés et deux embryons cellulaires après 30 minutes de culture, continuez à cultiver des embryons fusionnés en micro-gouttes de KSOM sous de l’huile minérale à 37 degrés Celsius. 5 % de dioxyde de carbone pour préparer les IPC pour l’injection par souffle, décongeler les IPC précédemment mis en banque et les déposer sur des mangeoires dans un passage de milieu ESC vers les cellules au moins une fois sur des mangeoires. Après décongélation avant utilisation pour injection.

Un puits d’une plaque à six puits contenant 70 à 80 % d’IPC confluents fournira plus qu’un nombre suffisant de cellules pour l’injection d’un milieu de croissance par aspiration et lavera les cellules avec trois millilitres de PBS sans calcium ni magnésium à 0,5 millilitre de préchauffage, 0,05 % d’EDTA dans les cellules et incubera à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avec un balancement occasionnel à 3,0 millilitres de milieu ESC et itérera pour obtenir un seul suspension cellulaire. Observez les cellules par microscopie optique pour vous assurer qu’une suspension unicellulaire, des colonies ou des agrégats cellulaires obstrueront la pipette d’injection. Une fois qu’une suspension à cellule unique a été obtenue, ajoutez un millilitre de milieu ESC dans le puits et remettez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Incuber pendant environ 15 minutes ou jusqu’à ce que la majorité des cellules nourricières aient commencé à adhérer, retirer délicatement le milieu contenant les IPC. En prenant soin de ne pas déloger les cellules nourricières adhérentes hebdomadaires. Placez les IPC dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de centrifugeuse moyenne ESC à 200 G pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et retirez le reste du milieu ESC à l’aide d’une micro-pipette. Tapotez le tube pour déloger la pastille et remettez doucement les cellules en suspension dans 0,2 à 0,5 millilitres de milieu FHM pré-réfrigéré. Pour le protocole d’injection d’assistance par explosion, veuillez vous référer au manuscrit accompagnant cet article et à un article précédemment publié, dont un extrait est montré à l’écran ici.

Des exemples de la progression morphologique des colonies de fibroblastes aux colonies IPSC au cours d’une expérience de reprogrammation sont présentés dans ces images. Une hétérogénéité morphologique et une formation de colonies IPSC partiellement reprogrammées doivent être observées à partir de quatre à cinq jours après l’édition de la doxycycline VPA, comme le montrent les panneaux B au CESE. Comme l’IPSC, les colonies devraient apparaître entre sept et 10 jours, comme le montre le panneau F.La production d’embryons de télo-cellules d’une cellule par électrofusion d’embryons diploïdes à deux cellules est très efficace.

Il est courant d’observer jusqu’à 95 % des embryons à deux cellules traités fusionnés avec succès pour produire des embryons tétraploïdes à une cellule. Le protocole utilisé dans cette expérience pour l’injection d’IPSC dans l’assistance à l’explosion tétraploïde est similaire au protocole pour l’injection d’E SES dans l’assistance à l’explosion diploïde pour générer des souris chimériques afin d’exclure facilement la génération de chimères diploïdes, la pigmentation des souches de souris utilisées pour générer des IPS et les embryons tétraploïdes sont soigneusement choisis lorsque cela est possible. Dans cet exemple, les embryons tétraploïdes sont produits à partir d’une souche albinos et les IPSC sont générés à partir d’une souche pigmentée.

Ainsi, les souris IPSC nouveau-nées présentent des yeux pigmentés et une couleur de pelage uniformément pigmentée à l’âge adulte, tandis que les kyras diploïdes présenteraient une coloration mixte albinos et pigmentée. Le nombre de petits vivants nés dépend de la lignée cellulaire, comme le montre ce tableau. Pour une bonne lignée IPSC moyenne, les expérimentateurs devraient s’attendre à ce qu’entre 1 % et 10 % d’assistance par explosion injectée produise des nouveau-nés vivants.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dériver des cellules IPS entièrement pluripotentes et aussi comment valider leur potentiel de développement. Une fois que cette technique a été maîtrisée, de la dérivation du MES à l’IPSC nouveau-né, les souris peuvent être complétées de deux à trois mois. Le développement et la maintenance des CSP I nécessitent un haut niveau de technique de culture cellulaire.

Une expérience préalable de la culture ESL est essentielle. N’oubliez pas de travailler avec des lentivirus, en particulier des lentivirus concentrés, qui peuvent être extrêmement dangereux. Il faut toujours porter l’équipement de protection individuelle requis par votre établissement et s’assurer de traiter tout ce qui est en contact avec le virus, avec 10 % d’eau de Javel pendant au moins 20 minutes Après cette procédure.

Toutes les souris IPSC et leurs tissus peuvent être analysés pour détecter des phénotypes physiologiques, pathologiques et comportementaux.