Name: Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Découvrez la génération de souris adultes à partir de cellules souches pluripotentes induites par complémentation d'embryons tétraploïdes. Cette méthode valide la pleine pluripotence des lignées iPSC pour la biologie du développement.

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Soutien à KKB, MJB, JLH et KLN a été fourni par le California Institute for Regenerative Medicine, le Pew Charitable Trusts Programme biomédicale chercheurs, la Esther B. O&#39;Keeffe famille et de la Fondation de la famille Shapiro. KKB est un E. Donald et Delia B. Baxter Foundation Scholar Faculté.

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<li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Generation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cell-derived+embryos+and+mice+by+tetraploid-embryo+complementation%22">Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li>
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<li>Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+can+support+full-term+development+of+tetraploid+blastocyst-complemented+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos.</a> Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).</li>
<li>Zhao, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+produce+viable+mice+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.</a> Nature. 461, 86-90 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li>
<li>Zhao, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li>
<li>Li, X. -y, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Génération de souris lignes iPSC en utilisant des essais TEC fournit un test rigoureux fonctionnelle pour la pluripotence d&#39;une ligne iPSC. Ce test peut être utile pour évaluer l&#39;efficacité relative des différentes méthodes de reprogrammation ou pour identifier les lignes iPSC qui peuvent être les plus utiles pour générer certains types de cellules in vitro. Souris générés par iPSCs peut être utilisé pour tester rigoureusement la stabilité à long terme et tumorigénicité des iPSC dérivées des tissus. Ce protocole sera utile aux chercheurs souhaitant générer des lignes entièrement pluripotentes iPSC ou des souris iPSC ou de comparer l&#39;utilité relative des différentes méthodes de reprogrammation. Les mécanismes qui contrôlent la génération et l&#39;identification des iPSCs pleinement pluripotentes restent mal connus et il est possible que certaines lignes iPSC produites en utilisant cette méthode ne passera pas le test TEC. De nombreux facteurs peuvent varier entre les expériences, y compris des fonds génétiques, le titre lentiviral, les modes de lentiviral insertion, les paramètres du cycle cellulaire de la population de donneurs, les différences inter-laboratoires dans les différentes étapes de la procédure TEC et les propensions variables de iPSCs pour héberger des aberrations génétiques ou épigénétiques. Pour mieux assurer le succès, nous prenons soin d&#39;établir des niveaux appropriés de l&#39;expression des gènes lentiviraux dans des expériences de dérivation iPSC en testant des dilutions virales sur le contrôle FAE afin de s&#39;assurer que chaque virus est suffisamment concentrée pour produire l&#39;expression du gène détectable au moins 80% et idéalement 100% de la MEF. Cela nous permet d&#39;identifier les lignes avec de multiples copies de lentivirus différents tout en limitant la toxicité pour le MEF et la production de colonies sans surpopulation dans les puits. Il convient de noter que plusieurs autres protocoles ont été montré pour produire des CSPi avec plein potentiel de développement, en utilisant plusieurs méthodes et sources de cellules donateurs suggérant que plusieurs chemins vers la pluripotence complète peut exister 1,8-13,15. À l&#39;heure actuelle, cependant, aucun biomarqueur définitive de tout pluripotentes iPSCa été identifié et donc le dosage du traité demeure le test de référence pour déterminer si une ligne iPSC peut générer tous les lignées cellulaires d&#39;un organisme.

<table><tbody><tr><td>DMEM (glucose élevé)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>SFM qualifié pour cellules ES</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Sigma</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine 0,1 %</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Milieu 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF murin)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Acide valproïque</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % de trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; gratuit</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotrophine sérique de jument enceinte, pour superovulation, lyophilisée, 2 000 UI</td><td>Harbor-UCLA Research Institute</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>gonadotrophine chorionique humaine</td><td>Sigma</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Milieu FHM avec hyaluronidase</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>Milieu KSOM-1/2 AA</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HFM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Eau, pour le transfert embryonnaire, embryon testé</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale, testée sur embryon</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Sérum albumine bovine (BSA), testé sur embryon</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires de souris, non irradiés</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_contenu&quot;&gt;&lt;fort&gt;Milieux et tampons utilisés dans ce protocole&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenu&quot;&gt;Milieu de croissance pour HEK293T. 90 % de DMEM, 10 % de SFB, 100 U/ml de pénicilline et 10 mg/ml de streptomycine. Exclure la pénicilline et la streptomycine du milieu pour HEK utilisé le jour de la transfection. Le milieu pour HEK peut être conservé à 4 &amp;deg;C pendant jusqu'à 1 mois.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenu&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM de dextrose. Ajuster le pH à 7,1 ± 0,1. Le pH est critique ! Filtrer stérilement et conserver à 4 &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenu&quot;&gt;Milieu de croissance pour fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) (également utilisable avec des cellules nourricières). 70 % de DMEM, 20 % de milieu 199, 10 % de SBF, 100 U/ml de pénicilline et 10 mg/ml de streptomycine. Conserver à 4 &amp;deg;C pendant jusqu'à 1 mois.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenu&quot;&gt;Milieu de culture pour cellules souches embryonnaires. 85 % DMEM, 15 % FCS qualifié pour cellules ES, Glutamax 1x, acides aminés non essentiels 0,1 mM, 0,1 mM &amp;#946;-mercaptop&amp;#8211;éthanol, 1 000 U/ml d'ESGRO, 100 U/ml de pénicilline et 10 mg/ml de streptomycine. Le milieu pour ESC peut être conservé à 4 &amp;deg;C pendant jusqu'à trois semaines.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenu&quot;&gt;Milieu d'électrofusion. Mannitol 0,3 M, MgSO₄ 0,1 mM&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;et 3 % de BSA dans de l'eau de test pour embryons. Conserver à 4 &amp;deg;C pendant jusqu'à 3 mois.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

La production de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à partir de cellules somatiques fournit un moyen de créer des outils précieux pour la recherche fondamentale et peut également produire une source de cellules patients appariés pour les thérapies régénératives. CSPi peuvent être générées en utilisant des protocoles multiples et provenant de sources multiples de cellules. Une fois généré, iPSCs sont testées en utilisant une variété de tests, y compris immunomarquage pour les marqueurs de pluripotence, la production de trois couches germinales dans des corps embryoïdes et les tératomes, des comparaisons de l&#39;expression des gènes des cellules souches embryonnaires (CSE) et la production de souris chimériques avec ou sans lignée germinale contribution de 2 . Fait important, les lignes iPSC qui réussissent ces tests varient encore dans leur capacité à produire différents types de cellules différenciées 2. Cela a rendu difficile d&#39;établir les protocoles de dérivation iPSC, sources de cellules bailleurs de fonds ou des méthodes de sélection sont très utiles pour différentes applications. Le test le plus rigoureuxde savoir si une lignée de cellules souches a suffisamment de potentiel de développement pour générer tous les tissus nécessaires à la survie d&#39;un organisme (appelé pluripotence complet) est complémentation embryon tétraploïde (TEC) 3-5. Techniquement, le TEC implique électrofusion de deux cellules d&#39;embryons de générer des tétraploïdes (4n) d&#39;une cellule embryons qui peuvent être cultivés in vitro jusqu&#39;au stade blastocyste 6. Diploïdes (2n) Les cellules souches pluripotentes (CES par exemple ou CISP) sont ensuite injectés dans la cavité du blastocyste blastocoel tétraploïde et transféré dans une femelle receveuse pour la gestation (voir Figure 1). La composante de l&#39;embryon tétraploïde complété contribue presque exclusivement vers les tissus extra-embryonnaires (placenta, le sac vitellin), alors que les cellules diploïdes constituer l&#39;embryon proprement dite, résultant en un fœtus issu entièrement de la lignée de cellules souches injectées. Récemment, nous avons rapporté des lignées iPSC que reproductible générer des souris adultesvia TEC 1. Ces lignes iPSC donner lieu à des chiots viables avec des rendements de 5-13%, ce qui est comparable aux CES 3,4,7 et supérieure à celle observée pour la plupart des autres lignes iPSC 8-12. Ces rapports montrent que la reprogrammation directe peut produire des CSPi pluripotentes qui répondent pleinement CES dans leur potentiel de développement et l&#39;efficacité de la génération chiots dans les tests de TEC. À l&#39;heure actuelle, on ne sait pas ce que fait la distinction entre iPSCs pleinement pluripotentes et des lignes moins puissants 13-15. Il n&#39;est pas clairement quelles méthodes de reprogrammation va produire ces lignes avec la plus grande efficacité. Nous décrivons ici une méthode qui produit iPSCs pleinement pluripotentes et &quot;tout&quot; iPSC souris, qui peuvent être utiles pour les chercheurs qui souhaitent comparer la pluripotence des lignes iPSC ou d&#39;établir l&#39;équivalence des différentes méthodes de reprogrammation.

À l'étape 3, « Dérivation de cellules iPS à partir de CEM », on doit observer une hétérogénéité morphologique et la formation de colonies de cellules iPS immatures à partir du 4e-5e jour suivant l'ajout de doxycycline/VPA, puis des colonies matures entre le 7e et le 10e jour.Figure 2). La production d'embryons tétraploïdes à une cellule à l'étape 5 est très efficace (Figure 3). Nous observons habituellement jusqu'à 95 % des embryons à deux cellules traités se fusionner avec succès pour produire des embryons tétraploïdes à une cellule. Le protocole suivi pour injecter des iPSC dans des blastocystes tétraploïdes (Étape 6, Figure 4) est similaire au protocole d'injection de CSE dans des blastocystes diploïdes pour la génération de souris chimériques, et peut être réalisée par un opérateur expérimenté en microinjection. Le nombre de souriceaux vivants nés dépend de la lignée cellulaire (Tableau 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">Rendement de préprogrammation des MEF : 0,01-0,03 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Rendement de production de souris iPSC par TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Nom</td>
			<td>Description</td>
			<td>Blastocystes injectés</td>
			<td>Nouveau-nés vivants</td>
			<td>Adultes vivants</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6,1 %)</td>
			<td>19 (2,2 %)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3,6 %)</td>
			<td>4 (2,1 %)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1 (0,3 %)</td>
			<td>0 (0 %)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1. Résultats représentatifs.
<img alt="Schéma de complémentation de blastocyste tétraploïde ; création de souris iPSC à partir d'embryons diploïdes au stade E13." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Schéma du dispositif expérimental. En haut à gauche : production de blastocystes tétraploïdes. Des embryons fécondés au stade deux cellules provenant de souris albinos sont fusionnés par électrofusion afin de produire des embryons uniploïdes tétraploïdes, qui sont ensuite cultivés in vitro jusqu’au stade blastocyste. En bas à gauche : reprogrammation. Des fibroblastes embryonnaires de souris sont transduits avec des particules lentivirales codant pour Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc ainsi que pour la protéine transactivante inverse de la tétracycline rtTAM2.2. L’ajout de doxycycline induit l’expression des transgènes et déclenche la reprogrammation en cellules souches induites (iPSC). À droite : production de souris iPSC. Des iPSC provenant de souris pigmentées sont injectées dans la blastocœle de blastocystes tétraploïdes, puis implantées chirurgicalement dans des souris receveuses pseudo-gestantes. Les souris iPSC nouveau-nées sont extraites par césarienne et placées sous couveuse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour voir la figure en taille agrandie</a>.
<img alt="Processus de reprogrammation cellulaire ; images de microscopie ; transformation des MEFs en iPSCs à un grossissement de 10x et 20x." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Changements morphologiques associés à la reprogrammation. De gauche à droite : exemples de l'évolution morphologique des fibroblastes vers des colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) au cours d'une expérience de reprogrammation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour voir la figure en taille plus grande</a>.
<img alt="Stades de développement de l'embryon : 2 cellules (2n), fusion des blastomères, 1 cellule (4n) ; images de microscopie." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Production d'embryons tétraploïdes. Des embryons diploïdes à deux cellules sont soumis à une impulsion électrique entraînant la fusion des blastomères et la formation d'embryons uniparentaux tétraploïdes.
<img alt="Injection de CIPi dans un blastocyste, donnant naissance à une souris CIPi néonatale et une souris de 3 semaines ; résultats de l'étude cellulaire." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Production de souris à partir de CIPi. Gauche : les CIPi sont injectées dans le blastocèle d'un blastocyste tétraploïde. Milieu : les souris CIPi nouveau-nées se distinguent par leurs yeux pigmentés. Droite : souris CIPi à trois semaines après l'accouchement.

Génération induites pluripotentes (cellules souches iPSC) lignes produit des lignes de différentes potentiel de développement, même quand ils passent des tests standard pour la pluripotence. Nous décrivons ici un protocole de produire des souris provenant entièrement de iPSCs, qui définit les lignes iPSC comme possédant la pluripotence complète<sup&gt; 1</sup&gt;.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

La production de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à partir de cellules somatiques permet de créer des outils précieux pour la recherche fondamentale et peut également...

L'objectif général de cette procédure est de générer des souris adultes à partir de cellules souches pluripotentes induites, ou iPSC, par complémentation d'embryons tétraploïdes. Cela est réalisé en premier lieu en établissant des iPSC à partir de fibroblastes embryonnaires de souris à l'aide de lentivirus porteurs de OCT4, SOX2, KLF4 et c-Myc, et en complétant le milieu avec de l'acide valproïque ou VPA.Une fois les CPI générées, elles sont caractérisées par immunomarquage, comptage chromosomique et formation de corps embryonnaires. L'étape suivante consiste à produire des blastocystes tétraploïdes receveurs à l'aide de la fusion et de la culture in vitro. Ensuite, les CIPSc sont injectées dans les blastocystes tétraploïdes, puis les blastocystes complémentés sont transplantés dans des femelles receveuses pour la gestation.À l'étape finale, les animaux à terme complet sont délivrés par césarienne à des mères porteuses. Ainsi, le développement postnatal peut être surveillé. En fin de compte, si des animaux viables à terme complet sont obtenus.La lignée de cellules IPS de l'essai est considérée comme pleinement pluripotente. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes de génération de cellules IPS est que notre méthode produit de manière reproductible des lignées de cellules IPS pleinement pluripotentes. Les lignées de cellules IPS générées par ces méthodes pourraient être utiles à d'autres chercheurs souhaitant comparer la pluripotence de leurs cellules IPS ou établir l'équivalence d'autres méthodes de reprogrammation. Ces méthodes seront utiles aux chercheurs souhaitant générer des lignées de cellules IPS pleinement pluripotentes pour des applications spécifiques en aval, telles que des essais de différenciation in vitro.En outre, la génération de tous les souris iPS. L'utilisation de la complémentation télomérique peut constituer un moyen utile pour déterminer la stabilité génétique et épigénétique de diverses lignées cellulaires. Les manipulations microchirurgicales impliquées dans la complémentation par embryon tétraploïde sont techniquement difficiles.Il peut falloir plusieurs mois avant qu'une personne ne maîtrise les techniques. L'iPS dérivée de cette technique nécessite des conditions de culture similaires à celles utilisées dans les expériences classiques de ciblage génique des cellules souches embryonnaires. Vingt-quatre heures après la transfection des cellules HEC 2 9 3 T avec un lentivirus, retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 25 millilitres de milieu frais préchauffé.Ramener le milieu contenant les particules lentivirales au laboratoire de culture pendant 24 heures. 48 heures après la transfection des cellules HEC 293T avec le lentivirus, recueillir le milieu de croissance contenant les particules lentivirales provenant des cellules transfectées. Éliminer les débris particulés du milieu contenant le virus par centrifugation à 3000 ×g pendant cinq minutes à 4 °C. Ensuite, concentrer le virus par ultracentrifugation à travers un coussin de saccharose à 20 % pendant deux heures à 112 000 ×g à 4 °C.Versez soigneusement dans un contenant de déchets pour désinfection sans perturber le culot viral. Resuspendez le culot viral dans 0,4 millilitre de milieu pour fibroblastes embryonnaires de souris et scellez le tube. Incubez ensuite doucement à quatre degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.Conserver les particules virales et les aliquotes à usage unique à moins 80 degrés Celsius. Les lignées de CIPSc sont dérivées de fibroblastes embryonnaires de souris ou de cellules meth. Une fois que les colonies de CIPSc présentent un bord bien défini brillant et réfractile et contiennent de 30 à 50 cellules, elles sont prêtes à être sélectionnées manuellement et agrandies en tant que lignées de CIPSc indépendantes.Prélevez des colonies isolées à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel et transférez chaque colonie directement dans un puits d’une plaque 96 puits en U contenant 20 microlitres de trypsine EDTA à 0,25 %. Incubez les colonies prélevées avec la trypsine pendant environ huit minutes à 37 degrés Celsius ou jusqu’à ce que les colonies se dissocient en cellules individuelles. Surveillez l’avancement de la dissociation par microscopie optique. Une agitation douce peut être nécessaire.Transférez la suspension cellulaire dissociée dans une plaque de 96 puits contenant une couche de cellules nourricières et 150 microlitres de milieu pour cellules souches embryonnaires (ESC) supplémenté en doxycycline et en VPA. Lorsque les colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPS) réapparaissent dans chaque puits, les diviser dans des puits plus grands pour l'analyse et la cryoconservation cellulaire en utilisant les procédures standards de dérivation des ESC et de culture cellulaire afin d'entamer la procédure de génération d'embryons aux blastocystes assistés par cellules tétraïploïdes. Des embryons uniques collectés chez des souris femelles sont cultivés durant la nuit jusqu'au stade deux cellules dans du KSOM à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone ; le lendemain, placez une lame microscopique BTX dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.Préparez suffisamment de milieu d'électrofusion à température ambiante pour immerger la lame dans la solution, sans toutefois en mettre tant que les pôles de l'électrode soient complètement submergés. Allumez l'électro-manipulateur BTX ECM 2001 et l'amplificateur BTX 400. Branchez les câbles de l'ECM à l'électrode de la micro-lame et fixez les câbles sur le côté de la boîte de Pétri afin d'éviter tout déplacement involontaire de la lame.Effectuez une impulsion manuelle pour obtenir une lecture sur l'amplificateur BTX et notez la tension des courants continus appliqués. Le courant alternatif contrôlera la vitesse à laquelle les embryons s'alignent entre les électrodes. Le courant continu provoquera la fusion des blastomères et la durée de l'impulsion déterminera la longueur de l'impulsion en courant continu.Un bon point de départ est un courant alternatif de trois volts, un courant continu de 100 volts et une durée de 0,05 milliseconde. La tension continue optimale varie entre 90 et 150 volts. Utilisation d'une pipette buccale.Prendre 30 à 42 embryons cellulaires provenant de la culture KSOM et les transférer dans une goutte de fusion électrochimique. Laver dans plusieurs gouttes de milieu de fusion électrochimique. Ensuite, aspirer du milieu frais de fusion électrochimique depuis la boîte à micro-lames dans la pipette buccale.Prenez les embryons lavés et placez-les dans l'interstice d'un millimètre entre les électrodes sur la micro-lame. Veillez à ce que les embryons soient alignés au milieu de l'interstice et ne soient pas en contact les uns avec les autres. Appliquez un courant alternatif en appuyant sur le bouton de démarrage manuel.Les embryons tourneront dans le champ CA jusqu'à ce que le plan de contact des blastomères soit parallèle aux électrodes. Si les embryons ne s'alignent pas en quelques secondes, augmentez le réglage CA. Une fois les embryons alignés, appuyez à nouveau sur le bouton de démarrage manuel pour appliquer l'impulsion CC avec le milieu de fusion électrochimique dans la pipette.Prélève les embryons à partir de la lame microscopique, lave les embryons à travers plusieurs gouttes de milieu KSOM, puis cultive les embryons dans du KSOM sous huile minérale à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. La fusion des blastomères doit être terminée en moins de 30 minutes. En culture, surveille et sélectionne les embryons dont les blastomères sont correctement fusionnés.Les embryons fusionnés apparaîtront au stade uniloculaire ; éliminez les embryons lysés et les embryons au stade deux cellules après 30 minutes de culture. Poursuivez la culture des embryons fusionnés dans de petites gouttes de KSOM sous huile minérale à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, afin de préparer les CIP pour l'injection au stade blastocyste. Décongelez les CIP préalablement conservées et mettez-les en culture sur des cellules nourricières dans un milieu pour cellules souches embryonnaires. Repiquez les cellules au moins une fois sur des cellules nourricières après décongélation, avant utilisation pour l'injection.Une cavité d'une plaque de six cavités contenant des IPC présentant une confluence de 70 à 80 % fournira un nombre de cellules largement suffisant pour l'injection. Aspirez le milieu de croissance et lavez les cellules avec trois millilitres de PBS sans calcium ni magnésium. Ajoutez 0,5 millilitre de trypsine-EDTA 0,05 % préchauffée aux cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, en agitant légèrement de temps en temps. Détachez les cellules en ajoutant 3,0 millilitres de milieu ESC et répétez l'opération afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Observez les cellules au microscope optique pour vérifier l'obtention d'une suspension monocellulaire, car les colonies ou les agrégats cellulaires risquent de boucher la pipette d'injection. Une fois la suspension monocellulaire obtenue, ajoutez un millilitre de milieu ESC dans la cavité et replacez la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius.Incuber pendant environ 15 minutes ou jusqu'à ce que la majorité des cellules nourricières aient commencé à adhérer, puis retirer délicatement le milieu contenant les IPC, en prenant soin de ne pas détacher les cellules nourricières faiblement adhérentes. Placer les IPC dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu pour cellules souches embryonnaires, puis centrifuger à 200 G pendant cinq minutes.Aspirez le surnageant et retirez le reste du milieu ESC à l’aide d’une micropipette. Tapez doucement sur le tube pour détacher le culot et remettez délicatement les cellules en suspension dans 0,2 à 0,5 millilitre de milieu FHM prérefroidi. Conservez les cellules sur glace avant et pendant l’injection dans des blastocystes tétraploïdes. Pour le protocole d’injection dans les blastocystes, veuillez vous référer à l’article accompagnant cette publication ainsi qu’à un article précédemment publié dans Strove, dont un extrait est affiché à l’écran ici.Des exemples de la progression morphologique, allant des fibroblastes aux colonies de CIP, au cours d'une expérience de reprogrammation sont présentés dans ces images. Une hétérogénéité morphologique et la formation de colonies de CIP partiellement reprogrammées devraient être observées à partir de quatre à cinq jours après l'ajout de doxycycline et de VPA, comme illustré dans les panneaux B à EESC. Des colonies de CIP typiques devraient apparaître entre sept et dix jours, comme indiqué dans le panneau F. La production d'embryons télo à une cellule par fusion électrochimique d'embryons diploïdes à deux cellules est très efficace.Il est habituel d'observer jusqu'à 95 % des embryons à deux cellules traités correctement fusionnés pour produire des embryons tétraploïdes à une cellule. Le protocole utilisé dans cette expérience pour injecter des IPSC dans des blastocystes tétraploïdes est similaire au protocole d'injection de cellules souches embryonnaires (ESES) dans des blastocystes diploïdes afin de générer des souris chimériques. Pour exclure facilement la formation de chimères diploïdes, la pigmentation des souches de souris utilisées pour générer les IPSC et les embryons tétraploïdes est soigneusement choisie, lorsque cela est possible. Dans cet exemple, les embryons tétraploïdes sont produits à partir d'une souche albinos et les IPSC sont générées à partir d'une souche pigmentée.Ainsi, les souriceaux IPSC nouveau-nés présentent des yeux pigmentés et une couleur de pelage uniformément pigmentée à l'âge adulte, tandis que les diploïdes kyras afficheraient une coloration mixte albinos et pigmentée. Le nombre de souriceaux vivants nés dépend de la lignée cellulaire, comme indiqué dans ce tableau. Pour une lignée IPSC moyenne de bonne qualité, les expérimentateurs doivent s'attendre à ce qu'entre 1 % et 10 % des blastocystes injectés donnent naissance à des souriceaux vivants.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des cellules IPS entièrement pluripotentes, ainsi que de la façon de valider leur potentiel développemental. En utilisant le test de complémentation par cellules tétraploïdes, une fois maîtrisée cette technique allant de l'obtention des MES jusqu'aux souris nouveau-nées à partir de cellules IPS, le processus peut être mené à bien en deux à trois mois. Le développement et le maintien des cellules IPS nécessitent un haut niveau de compétence en technique de culture cellulaire.L'expérience préalable avec la culture ESL est essentielle. N'oubliez pas que travailler avec le lentivirus, en particulier le lentivirus concentré, peut être extrêmement dangereux. On doit toujours porter les équipements de protection individuelle exigés par votre établissement et s'assurer de traiter tout ce qui a été en contact avec le virus à l'aide d'une solution d'eau de Javel à 10 % pendant au moins 20 minutes, conformément à cette procédure.Toutes les souris IPSC et leurs tissus peuvent être analysées pour des phénotypes physiologiques, pathologiques et comportementaux.

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Biologie

Cette vidéo montre la procédure pour générer des cellules souches pluripotentes induites à l'aide de lentivirus inductibles qui expriment Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4.

Générer des cellules iPS de MEFS travers l&#39;expression forcée de Sox-2, Oct-4, c-Myc et Klf4

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Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

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Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

Ce protocole décrit la procédure détaillée pour la cryoconservation de cellules iPS humaines dans un milieu de cryoconservation KnockOut SR et la récupération de ces cellules en complète KnockOut Feeder SR gratuit (KSR-FF) moyen ou le chargeur milieu à base de SR huitièmes de finale.

Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen

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