Name: Transplantation dîlots pancréatiques dans la capsule du rein de souris diabétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T23:37:26.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Découvrez la transplantation d'îlots pancréatiques sous la capsule rénale chez des souris diabétiques. Cette méthode simple minimise le stress cellulaire et améliore les résultats thérapeutiques dans les modèles murins de diabète.

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UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. FRDJ. LifeScan Inc Johnson &amp; Johnson Company.

Préparation des îlots pour la transplantation (Tx) <ol><li> Sous un microscope inversé, la main-pick îlots en utilisant un Pipetman P200 et embout de la pipette directement à partir des îlots de culture dans une plaque de 100mm. </li><li> Comptez 100 îlots à un moment et le transfert dans chaque tube à centrifuger (~ 500 îlots / tube / souris). </li><li> Autoriser îlots pour se déposent au fond des tubes à centrifuger. </li><li> Dessinez un îlot granulés dans un Pipetman P200 (fixé à 130ul) en utilisant une pipette droite paroi mince. </li><li> Placer un adaptateur de tube silicone sur le bout de la seringue. Insérer une longueur de tube PE50 dans l&#39;adaptateur en silicone. </li><li> Accrochez le Pipetman sur le côté de la hotte et le ruban du tube PE50 au mur capuche supérieur des îlots à la pointe. Cela permettra de régler les îlots seulement dans la pointe de la pipette. </li><li> Transfert des îlots dans la tubulure PE50 par lentement composant le Pipetman et en déplaçant les îlots dans la tubulure PE50, en faisant attention de ne pas expulser les îlots de la fin. </li><li> Faire un coude dans l&#39;extrémité biseautée du tube PE50. Tout en conservant le pli, débrancher le tube adaptateur en silicone du Pipetman et sécuriser le pli avec l&#39;adaptateur en silicone. </li><li> Placez les îlots, dans le tube PE50, côté silicone tube plié l&#39;adaptateur vers le bas, dans un coniques de 15 ml avec une pipette de réduire de 5 ml et bande les tubes PE50 sur le côté de la pipette 5 ml d&#39;éviter de curling du tube PE50 tandis centrifugation. </li><li> Centrifuger les Coniques PE50/15mL à 1000 rpm et éteindre la centrifugeuse. (Ne jamais préparer plus de 10 préparations d&#39;îlots à un moment). </li><li> Placer le tube sur la glace. </li></ol> Préparation de la souris pour la transplantation <ol><li> Anesthésier la souris avec isofluorane ou avec la kétamine / Xylexene (voir protocole de préparation). </li><li> Après anesthésie a pris affectent, se raser le flanc gauche de la souris. </li><li> Swab la peau de souris, le centre-out, avec un tampon povidone iodée et puis essuyez avec un tampon d&#39;EtOH. </li><li> Localisez le rein gauche (juste à droite de la rate). Faire une petite incision dans la peau, ce qui expose le péritoine. </li><li> Faire une petite incision dans le péritoine d&#39;exposer le rein. Garder la petite incision aidera à garder les reins soulevés et exposés. </li><li> Appliquez une légère pression des deux côtés de l&#39;incision, d&#39;augmenter ou de pop le rein de la souris. </li><li> Gardez l&#39;humidité du rein en appliquant une solution saline normale avec un coton-tige. </li><li> En utilisant une seringue 23 ou 25 aiguille de la jauge, faire une petite rayure sur le flanc droit du rein, créant une entaille dans la capsule du rein; pas trop profond ou trop grand. </li></ol> Transplantation d&#39;îlots Note: Bien que la souris est en préparation pour Tx, la deuxième personne devrait préparer le Hamilton-vis de greffe d&#39;îlots entraînement de la seringue. <ol><li> Lentement retirer le tube de silicone adaptateur de la tubulure PE50 tout en gardant le coude dans le tube. </li><li> Placez l&#39;extrémité opposée du tube PE50 dans le tube adaptateur en silicone et placez le tube adaptateur en silicone sur la pointe de la pipette attaché à la «vis-lecteur&quot; seringue en verre de Hamilton. Relâchez doucement le pli dans le tube PE50, en s&#39;assurant que les îles ne s&#39;échappent. </li><li> Advance les îlots lentement vers l&#39;extrémité du tube PE50 utilisant la &quot;vis&quot; mécanisme, mais garder une petite bulle d&#39;air à l&#39;avant des îlots dans la tubulure PE50. </li><li> Into the nick faite dans les reins, glissez soigneusement le tube PE50 sous la capsule, ce qui rend une petite poche. Soyez très prudent pour ne pas crever le rein ou la perforation grâce à la capsule. </li><li> Il aide à garder la zone humide et capsule avec une solution saline normale-Gentamycine coton imbibé-tige; une capsule sèche va se déchirer facilement. </li><li> Déplacez doucement le tube dans toutes les directions, créant une «poche» pour les îlots transplantés pour se reposer. N&#39;oubliez pas de réappliquer supplémentaires sérum physiologique pour garder la zone humide. </li><li> Sous la direction de la personne qui a ouvert la souris et qui a placé le tube PE50 sous la capsule rénale, la deuxième personne, qui a préparé la souris et d&#39;une seringue Hamilton de greffe, va avancer lentement îlots sous la capsule, l&#39;intérieur de la «poche», derrière une petite bulle d&#39;air délivré par le tube PE50, jusqu&#39;à ce que tous les îlots sont transplantés. </li><li> Retirer lentement le tube PE50, sécher la zone avec un écouvillon sec et soigneusement cautériser le nick à basse température. </li><li> En utilisant un coton-tige sec, s&#39;assurer que tous les saignements ont cessé. Une fois l&#39;arrêt du saignement, ré-humidifier les reins avec une solution saline stérile, et doucement remplacer les reins dans le péritoine avant la clôture de la souris avec suture et des agrafes cutanées. </li></ol> Fermeture / Relance de la souris <ol><li> Fermer le péritoine avec un point en cours en utilisant 5-0 sutures de soie w / une aiguille 19mm C-6. </li><li> En utilisant une pince tirer des deux côtés de l&#39;incision cutanée ensemble. </li><li> Agrafer la peau avec 2 ou 3 agrafes. </li><li> Nettoyer la peau de la souris de tout le sang, à l&#39;aide d&#39;un coton-tige et Saline. </li><li> Traiter immédiatement de la souris avec une injection sous-cutanée de flunixine et la buprénorphine. </li><li> Placez la souris dans une cage, qui est placé sur un coussin chauffant ou en dessous d&#39;une lampe chauffante, jusqu&#39;à ce que la souris est pleinement active. </li><li> Retirez les agrafes cutanées dans 2 semaines. </li></ol>

<ol><li>Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inability+to+induce+tolerance+through+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Inability to induce tolerance through direct antigen presentation.</a> Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+transplant+rejection+following+treatment+with+anti-B7-2+and+anti-B7-1+antibodies.+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation.</a> Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+xenogeneic+pancreatic+islet+grafts+induced+by+CTLA4lg%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg.</a> Science. 257, 789-792 (1992).</li>
</ol>

Ce protocole prévoit une option pratique et efficace pour la prestation proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris diabétiques ou normale. La technique de concentration et de granulation des îlots ou de cellules dans la tubulure de livraison finale (PE50) utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale offre une méthode facile et efficace de la transplantation de cellules, tout en réduisant les stress indu aux cellules ou à la souris.

<table><tbody><tr><td>Gants chirurgicaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-95(sz)</td><td></td></tr><tr><td>Sponges pour friction chirurgicale</td><td>Moore Medical</td><td>42940AK</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Miltex Inc.</td><td>6-114 et 6-26</td><td>2 dentelées, 2 droites</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection n=2</td><td>Miltex Inc.</td><td>5-290</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir Oster (lame taille 40)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-305-10B</td><td></td></tr><tr><td>Panses stériles 4x4</td><td>Moore Medical</td><td>08252AK</td><td></td></tr><tr><td>Compresse de povidone-iodure</td><td>Moore Medical</td><td>08486AK</td><td></td></tr><tr><td>Compresse d’alcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-819-2</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Moore Medical</td><td>42508AK</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de 23G ou 25G</td><td></td><td></td><td>1&quot; de long</td></tr><tr><td>Solution de Cidex</td><td>Moore Medical</td><td>07535AK</td><td>pour le nettoyage/désinfection des instruments</td></tr><tr><td>Tuyau en polyéthylène PE50</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td>PE50, 0,965 mm de D.E. x 0,58 mm de D.I.</td></tr><tr><td>Cidex + solution 28 jours</td><td>Moore Medical</td><td>35625AK</td><td></td></tr><tr><td>Tuyau en silicone</td><td>Spectrum Chromat.</td><td>123732</td><td>5/32&amp;#8221; D.E. x 1/32&amp;#8221; D.I.</td></tr><tr><td>Récipient de stérilisation pour instruments</td><td>Moore Medical</td><td>39074AK</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de pipette droits</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0810</td><td>stériles</td></tr><tr><td>Seringue en verre avec système de vis</td><td>Hamilton Co</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Appareil de cautérisation</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS230</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Moore Medical</td><td>41-067</td><td></td></tr><tr><td>Soie 5-0</td><td>LOOK Surgical</td><td>754B</td><td>pour suture (6-C)</td></tr><tr><td>Bâtonnet de coton</td><td>Moore Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stapleuse à agrafes autoclips de 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>7630</td><td></td></tr><tr><td>Agrafe de 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>7631</td><td></td></tr><tr><td>Démembreur d’agrafes de 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>7637</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantation d&#39;îlots pancréatiques dans la capsule du rein de souris diabétiques

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Notre protocole a été développé pour offrir proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris diabétiques ou normale. Nous avons trouvé qu&#39;il était plus facile de concentrer les îlots ou de cellules en granules dans le tube de livraison finale (PE50) utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale. Cette technique offre à la fois rapidité et la facilité tout en réduisant les stress indu aux cellules ou à la souris. Chargement: Installé, cueillies à la main, d&#39;îlots ou de cellules granulées sont soigneusement aspiré au fond d&#39;un microtube de 1,5 ml en utilisant un pipetteman P200 et une droite, à paroi fine pointe de la pipette. Une longueur de tube PE50 est attaché à la pointe de la pipette en utilisant un tube en silicone petites adaptateur. Les cellules sont autorisés à s&#39;installer, dans la pointe, puis sont transférés à la tubulure PE50 par lentement composant le pipetteman. Une fois les cellules vers la fin du tube PE50, un coude est faite et le tube de silicone adaptateur est placé sur le pli. Le tube PE50 est transféré à un 15 ml conique contenant une pipette ml couper 5, et le tube PE50 est enregistrée sur le côté de la pipette 5 ml d&#39;éviter de curling lors de la centrifugation. Les cellules sont autorisés à atteindre 1000 rpm et s&#39;arrêta. Transplantation: souris receveuses sont anesthésiés, rasés et nettoyés. Une petite incision est faite sur le flanc gauche de la souris et le rein est exposé. Le rein, la graisse et les tissus sont maintenus humides avec un tampon saline normale. L&#39;extrémité distale de la PE50 est attachée à une seringue Hamilton entraînement à vis, contenant une pipette, en utilisant le tube adaptateur en silicone. Une petite incision est faite sur le côté flanc droit du rein, pas trop grand ni trop profonde. L&#39;extrémité biseautée du tube PE50, plus proche des cellules, est soigneusement placé sous la capsule, le tube est déplacé autour doucement pour faire de l&#39;espace tout en tamponnant une solution saline normale; une capsule sèche peut se déchirer facilement. Une petite bulle d&#39;air est livré sous la capsule par lentement numérotation du lecteur vis de la seringue. Les îlots sont ensuite lentement livré derrière la bulle d&#39;air. Une fois l&#39;homéostasie du rein les îlots ont été livrés est maintenue et le bric est cautérisée à basse température. Le rein est placé dans la cavité et le péritoine et la peau sont suturés et agrafées. Les souris sont immédiatement traités avec flunixine et la buprénorphine carrés et placé dans une cage sur un coussin chauffant.

Notre protocole a été développé pour offrir proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris. Les cellules sont concentrées en granules dans le tube final utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale. La facilité de cette technique réduit le stress pour les cellules et la souris.

Transplantation d&#39;îlots pancréatiques dans la capsule du rein de souris diabétiques

Notre protocole a été mis au point pour administrer, de manière propre et facile, des îlots ou des cellules sous la capsule rénale de souris diabétiques ou normales. Nous avons constaté qu'il était plus facile...

Bonjour, je m'appelle Greg Zod. Je travaille au Centre du diabète de l'UCSF, au sein du laboratoire Bluestone, et aujourd'hui, je vais vous montrer comment transplanter des îlots pancréatiques sous la capsule rénale de souris diabétiques. Cette procédure consiste à prélever des îlots pancréatiques purifiés à partir de souris syngéniques ou allogéniques, à les purifier, puis à les transplanter sous la capsule rénale de souris diabétiques.Des souris pouvant devenir naturellement diabétiques, comme les souris NOD, ou des souris rendues artificiellement diabétiques par injection de streptozotocine. Maintenant, nous sommes prêts à sélectionner manuellement les ilots. Je vais prélever manuellement les ilots et les compter tout en les aspirant avec une pipette munie d'une pastille.Je vais éliminer tout résidu de tissu, et vous pouvez voir simplement grâce à la manière dont la lumière se réfracte dans le tissu ce qui est un œillet et ce qui n’en est pas un. Ensuite, je compte les œillets. Je les place dans un tube microcentrifuge, et nous les recueillons pour la greffe.Les œillets ont une apparence plus dense, presque rougeâtre, et l'aiguille dans le R est plus claire et plus duveteuse. Elle a également une teinte blanchâtre. Ainsi, vous allez obtenir un peu de tissu d'aiguille dans le R pendant que vous prélèverez les œillets, mais tant que vous récupérez la majorité des œillets, tout ira bien.Et vous pouvez voir qu'il y a un beau morceau important de tissu R. Puis ici, un bel oeillet avec un autre oeillet au-dessus. En revanche, il y a un peu d'ace dans r entre les deux, ce qui permet de déplacer légèrement les éléments et de saisir individuellement chaque oeillet.Et si vous le remarquez, j'utilise une pointe de pipette non conique. Cette pointe est très fine et droite. Cela permet une plus grande facilité d'insertion et de retrait des embouts dans la pointe.Veillez à ne pas essayer de saisir un ganglion lymphatique. Ce sont des ganglions lymphatiques particuliers, associés au pancréas, qui sont digérés puis purifiés. Je n'essaie de saisir que les œillets, si possible, et je laisse les ganglions lymphatiques en place.Une fois que j'ai sélectionné manuellement les œillets, j'ai 500 œillets libres au fond de ce tube de microcentrifugeuse. Maintenant, je vais transférer ces œillets dans notre tube P150 pour la greffe. Pour ce faire, je prends une pointe de pipette et j'aspire lentement les œillets depuis le fond du tube.Une fois les œilletons placés dans la pointe de pipette, je prends mon tube en silicone fixé au tube B 50 et je les laisse se déposer maintenant au bout de la pointe de pipette en les fixant avec du ruban adhésif sur le côté de la paroi de la hotte. Une fois que les pastilles se sont déposées au sein de la pointe de pipette, nous retirerons la pipette et ferons lentement avancer la pastille dans le tube à l’aide du bouton de réglage de la pipette, et non du piston. Et tandis que je tourne le bouton de la pipette, je déplace le tube.Ils permettent aux pastilles d'entrer dans le tube P 50. Lorsque les pastilles ont atteint environ un pouce de l'extrémité du tube, j'ai pincé le tube pour maintenir les pastilles à l'intérieur. J'ai retiré le tube en silicone et transféré jusqu'au point de pincement.Cela est ensuite placé dans un tube de centrifugeuse à l’aide d’une pipette de cinq millilitres qui a été coupée. Puis je replie le tube et le fixe avec du ruban adhésif sur la pipette de cinq millilitres. Il est maintenant prêt pour la centrifusion.La souris a été rasée et anesthésiée, et nous allons vérifier qu'elle ne réagit pas à une pincée des orteils. Je vais désinfecter la souris avec des tampons imbibés d’iodure de propylène. La chirurgie est réalisée de manière aseptique, mais toutes les pointes de mes instruments sont stériles.Juste à droite de la rate, sur le flanc gauche de la souris, je vais pratiquer une petite incision. L'idée est maintenant de garder cette incision petite afin qu'elle maintienne le rein en place. Lorsque vous isolez le rein, vous allez couper la paroi péritonéale juste au-dessus de ce rein, en faisant une petite incision.Et d'un seul mouvement, je soulève la peau vers la gauche et pousse vers le haut, puis vers le bas sur le rein pour le faire sortir juste comme ça. Je maintiens le rein humide avec un peu de sérum physiologique et de gentamicine, un antibiotique. À l’aide d’une aiguille de 25 gauge, je vais faire une petite entaille dans le rein à l’endroit où sera placée ma tubulure.Vous ne voulez pas creuser dans le rein, vous souhaitez simplement faire une petite entaille. Vous verrez une fine ligne de sang. Ensuite, vous saurez que vous êtes entré dans la capsule.En prenant mon tube P 50 qui a été coupé en biseau, je vais accrocher sous le rebord de cette coupe que j'ai réalisée et placer lentement le tube sous la capsule. Pavel maintient le rein humide pendant cette procédure, car une capsule sèche se déchire facilement. Une fois le tube P 50 positionné sous la capsule, Pavo fera avancer le pellet à l’aide d’une seringue Hamilton équipée d’un système de vis. Et vous pouvez voir le pellet s'insérer lentement ici. Vous contrôlez la libération de l'oeillet en fonction de la vis de commande. Une fois les oeillets libérés, je prends une pointe de gaze sèche, j'essuie la zone, puis à l'aide d'un fer de cautérisation, je referme l'incision et le rein.À l'aide d'un fil de soie 5/0, j'ai saisi le péritoine et je l'ai suturé. J'effectue une suture continue pour fermer la souris. Nous fermons la peau à l'aide d'agrafes cutanées.Avant de réveiller la souris, je lui administre une injection sous-cutanée de bpro, d'amines et de flu nixon, des anti-inflammatoires, ainsi qu'un analgésique. La souris est ensuite replacée dans sa cage, posée sur un tapis chauffant. Je viens donc de vous montrer comment transplanter des greffons sous la capsule rénale de souris.Ce modèle est très pertinent pour étudier la tolérance à la transplantation ou les approches thérapeutiques du diabète. Plus précisément dans notre laboratoire, nous utilisons ce modèle pour examiner les effets des lymphocytes T régulateurs sur la transplantation de cellules insulaires ou pour induire une tolérance à l’aide de différentes molécules de blocage de la costimulation.

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La transplantation d'îlots isolés a été proposé pour être un traitement potentiel pour les diabétiques de type 1. Nous décrivons ici une méthode pour isoler les îlots de souris pancréas et de les transplanter à l'espace sous-capsulaire du rein.

Une méthode pour isoler l&#39;îlot murin et transplantation rénale sous-capsulaires

Cette vidéo décrit le protocole de greffe d’îlots pancréatiques humains dans la chambre antérieure de l’œil de la souris afin de surveiller la revascularisation des greffes d’îlots pancréatiques humains in vivo. Il aide également à comprendre la contribution des cellules receveuses par rapport aux cellules donneuses dans la promotion de l’encapsulation et de la vascularisation du greffon.

Greffe d’îlots pancréatiques : méthode d’implantation d’îlots pancréatiques dans la chambre antérieure de l’œil de souris pour l’imagerie in vivo

Ce protocole démontre l'isolation des îlots murins et le semis sur un échafaud décellularisé. Les îlots soutenus par des échafaudages ont été transplantés dans la pate épididymique des souris diabétiques induites par la streptozotocine (STZ). Les îlots ont survécu au site de transplantation et ont inversé l'état hyperglycémique.

Transplantation soutenue d&#39;échafaudage d&#39;îlots dans la pate épididimale de souris diabétiques

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Modèle de souris pour une Transplantation du pancréas en utilisant une Technique mis à jour le brassard

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Une méthode pour la Transplantation d’îlots à l’épiploon dans la souris

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Intraporte Transplantation d’îlots pancréatiques dans le modèle murin

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Modèle de transplantation inguinal Subcutaneous De tissu adipeux blanc (ISWAT) des îlots de Murine

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