Le processus de monstre vert pour la génération de souches de levure portant la délétion de gènes multiples

L'objectif général de cette procédure est de générer des souches de levure portant plusieurs délétions marquées par un gène rapporteur codant pour une protéine fluorescente verte. Ceci est réalisé en préparant d'abord des mutants haploïdes simples appelés « pro-monstres », chacun portant une cassette de délétion GFP en remplacement d'un des gènes cibles. La deuxième étape consiste à associer les délétions par croisement et sporulation des souches de levure en utilisant deux jeux de marqueurs de sélection diploïdes et haploïdes appelés GM toolkit A et GM toolkit alpha, également présents dans les souches pro-monstres.

Ensuite, des cellules hautement fluorescentes sont sélectionnées au sein de la population myotique par cytométrie en flux afin d'enrichir les souches portant deux délétions. La dernière étape consiste à confirmer les génotypes des souches triées. Finalement, des cycles répétés d'accouplement et d'enrichissement par cytométrie en flux, amorcés à partir des souches obtenues, permettent de générer des souches multi-délétées à nombre accru de délétions.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la méthode G pour la réutilisation de marqueurs et la délétion séquentielle de gènes, est que plusieurs délétions peuvent être obtenues par cycle, ce qui permet une assemblage plus rapide de mutants multiples. Après la génération des pro-monstres comme décrit dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo, on commence le cycle sexuel en préparant des cultures des souches de délétion GFP de pro-monstres établies dans un tube Eppendorf de 1,6 millilitre pour les échanges gazeux. Préparer la souche de délétion de type de croisement A dans 100 microlitres de milieu synthétique complet dépourvu d'histidine, appelé milieu « moins his ». Préparer également la souche de délétion de type de croisement alpha dans 100 microlitres de milieu synthétique complet dépourvu de leucine, ou milieu « moins lu », dans un tube Eppendorf de 1,6 millilitre destiné à l'échange d'air.

Percez des trous dans les bouchons des tubes à l’aide d’une épingle à tête préalablement traitée avec de l’éthanol à 70 %. Faites tourner les tubes horizontalement à 30 degrés Celsius toute la nuit. L’axe de rotation doit être parallèle à l’axe longitudinal du tube.

Estimation à partir de la densité optique : mélanger environ 250 000 cellules haploïdes a et 250 000 cellules haploïdes alpha de souches de délétion GFP dans un tube Eppendorf de 1,6 millilitre. Ce nombre de cellules correspond généralement à sept microlitres de chaque culture de nuit agitée au vortex. Centrifuger ensuite les cellules à 800 ×g pendant deux minutes pour poursuivre le protocole.

Après avoir retiré le supinate, faites un trou sur le couvercle à l’aide d’une épingle à bouton traitée avec de l’éthanol à 70 %. Pour permettre les échanges gazeux, ajoutez 50 microlitres de milieu YPDA, puis vortexez brièvement et centrifugez votre prélèvement à 800 G pendant cinq minutes. Placez ensuite le tube dans une boîte humide réalisée à partir d’une boîte à embouts vide, d’un petit support d’embouts et d’une serviette en papier humide.

Incuber la boîte toute la nuit à 30 degrés Celsius. Transférer 10 microlitres du mélange d'accouplement dans 500 microlitres de milieu GNA sans agar contenant les antibiotiques G 4 1 8 et nat dans un tube de culture de cinq millilitres avec un bouchon desserré ; la densité optique initiale à 600 nanomètres est d'environ 0,1. Agiter la culture à 30 degrés Celsius pendant 24 heures.

Cela permet la sélection des diploïdes car seuls les diploïdes contenant à la fois MX quatre dans le kit génétique A et nat MX quatre peuvent croître en présence de G quatre 18. Transférez 20 microlitres d'une culture d'un jour dans 500 microlitres de milieu GN frais contenant G quatre 18 et nat. La densité optique initiale à 600 nanomètres est d'environ 0,2.

Faites tourner le tube à 30 degrés Celsius pendant cinq heures afin de ramener les cellules en phase logarithmique. Ensuite, corréléez les diploïdes et isolez les spores. Suivez la procédure décrite dans le protocole écrit.

Procéder à la division de la suspension de cellules liées à la SPO en deux parties de 300 microlitres et placer chacune dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre distinct. Centrifuger les tubes à 800 ×g pendant cinq minutes. Après élimination du surnageant S, faire un trou dans le couvercle de chaque tube.

À l’aide d’une épingle, ajoutez 100 microlitres de milieu moins his au culot d’un tube. Pour sélectionner les haploïdes de type PT de l’autre tube, ajoutez 100 microlitres de milieu moins loo. Pour sélectionner les haploïdes alpha.

Faites tourner les tubes à 30 degrés Celsius pendant la nuit. La densité optique finale à 600 nanomètres doit être inférieure à 0,5. Si la densité optique à 600 nanomètres a tendance à être trop élevée triol à température ambiante.

Pour induire la GFP, ajoutez 100 microlitres de milieu frais moins his ou moins LU contenant 20 microgrammes par millilitre de doxycycline aux différentes souches. La concentration finale de doxycycline est de 10 microgrammes par millilitre. Vortexez le tube et faites-le tourner à 30 degrés Celsius pendant deux jours.

Pour commencer la cytométrie en flux, ajouter 900 microlitres de tampon TE préfiltré dans un tube en polypropylène de cinq millilitres dont le bouchon a été remplacé par un bouchon filtre provenant d'un tube en polystyrène de cinq millilitres. Les tubes en polypropylène conviennent à la cytométrie en flux. Le bouchon filtre est recommandé pour éliminer les particules de grande taille.

Placez délicatement 75 microlitres du tampon sur le bouchon du filtre à cellules. Ajoutez 25 microlitres des cellules induites à la solution présente sur le bouchon, tout en appuyant la pointe de la pipette contre le maillage. Projetez toute la solution combinée à travers le filtre.

Appuyez fermement sur le bouchon du filtre et vortexez le tube. Préparez les tubes de collecte, des tubes fendor de 1,6 millilitre contenant 200 microlitres de milieu moins hiss ou moins lube. Démarrez le trieur cellulaire et réglez les paramètres conformément au manuel du fabricant.

Vortexez les tubes de prélèvement pour tapisser les parois avec le milieu. Vortexez également le tube contenant les cellules avant de les charger sur le trieur cellulaire. Acquérez les données de cytométrie en flux de l'échantillon.

Une souche sans GFP peut servir de contrôle négatif. Dessinez des fenêtres de tri pour éviter les agrégats cellulaires, qui pourraient présenter une intensité élevée de GFP. Écartez les valeurs aberrantes ayant une largeur d'impulsion ou une aire de diffusion avant (FSC) disproportionnellement élevée, en utilisant un graphique de largeur d'impulsion contre hauteur d'impulsion, ou un graphique d'aire FSC contre hauteur FSC.

Étant donné qu'une grande FSC est attendue uniquement pour les agrégats cellulaires, ne prendre que les cellules appartenant aux 20 % inférieurs de la FSC. Éviter les régions présentant les valeurs les plus faibles de FSC et de diffusion latérale ou SSC, où l'on trouve souvent les débris cellulaires. Le signal SSC et celui de la GFP sont souvent positivement corrélés.

Pour éviter d'enrichir les cellules ayant une valeur SSC plus élevée, dessinez une fenêtre en périphérie de la population à l'aide d'un graphique représentant l'intensité de la GFP et la SSC, afin de sélectionner un pourcentage similaire des cellules les plus brillantes provenant de chaque point le long de l'axe SSC. De 0,1 à 1 % de la sous-population sélectionnée à l'aide des fenêtres FSC et SSC avant cette étape doivent être marqués pour le tri vers le tube de collecte. Agitez le tube de collecte par vortex pour recouvrir les cellules triées avec le milieu de culture, puis placez-les en plaque.

Un sous-ensemble de cellules sur une plaque A-Y-P-D-A destinée au génotypage. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius pendant deux jours après incubation. Préparer un lysat à partir d'environ 12 colonies.

Suivre les étapes décrites dans le protocole écrit pour le génotypage. Analyser un microlitre d'un lysat dilué en utilisant une réaction PCR de 10 microlitres avec un amorceur direct. Cet amorceur se fixe à la région flanquante en amont de chaque gène supprimé, en association avec un amorceur commun qui se fixe à l'intérieur de tous les loci de suppression.

La PCR peut être réalisée en format 96 ou 3 84 puits après amplification. Analyser les produits de PCR par électrophorèse.

Identifier les haploïdes susceptibles de posséder les génotypes souhaités. Mettre ces souches en culture sur une nouvelle boîte. Les congeler également à −80 °C dans du glycérol à 25 %.

Des tests supplémentaires, tels que la confirmation de l'absence de séquences de type sauvage pour les gènes supprimés et l'électrophorèse sur gel après champ, sont recommandés. Répéter le cycle sexuel avec des souches utiles. Les progénitures haploïdes issues d'un croisement entre deux souches ont été induites à exprimer la GFP.

Chaque délétion génique comportait un cassette GFP analysé à l’aide de portes sur un cytomètre de flux ; une population des cellules résultantes a été sélectionnée. Cette population est peu susceptible de contenir des débris ou des agrégats cellulaires. Les 1 % des cellules les plus brillantes ont été triées et conservées en ciblant les cellules selon la surface du scatter avant et la hauteur du scatter avant.

Les agrégats cellulaires, qui ont tendance à présenter une aire de diffusion avant démesurément élevée, ou exclus en ciblant les cellules selon la diffusion avant et la diffusion latérale, les cellules situées dans les 20 % inférieurs de la diffusion avant ont été retenues, tout en excluant les débris du jour présentant les signaux les plus faibles de diffusion avant et de diffusion latérale, en ciblant les cellules selon la diffusion latérale et le signal GFP ; parmi les cellules situées dans une plage donnée de diffusion latérale, celles présentant une fluorescence plus intense ont été sélectionnées afin de permettre la comparaison entre le mélange myotique et l'échantillon témoin négatif qui n'exprime pas GFP. Un GA identique à celui utilisé pour sélectionner la population P trois est illustré dans le schéma. Pour les cellules de contrôle négatif sélectionnées de manière similaire dans un haplos distinct, l'analyse par PCR a été réalisée après induction de l'expression de GFP et tri fondé sur la fluorescence. Le nombre attendu de délétions pour une cellule non triée résultant d'une ségrégation aléatoire était de 7,5.

Dans cette expérience particulière, les cellules triées présentaient un nombre moyen de délétions de 8,8 ± 0,3, incluant cinq cellules contenant 10 délétions. Génotype DO. Le PCL des souches triées a été réalisé à l’aide d’un amorce reverse.

Ce 10 s'aligne sur la région flanquante en aval appariée avec un amorçage direct. Ce 10 s'aligne à l'extrémité de la cassette. La présence d'une bande indique la présence de la cassette GFP.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'utiliser la méthode verte Monster pour réaliser des délétions chez la levure.