D'évaluation fonctionnelle de la motilité intestinale et inflammation de la paroi intestinale chez les rongeurs: analyses dans un modèle standardisé de la manipulation intestinale

L’objectif global des expériences suivantes est d’effectuer une manipulation intestinale pour étudier le développement et la dissolution de l’iléus postopératoire dans un modèle de rongeur, ceci est réalisé par une manipulation standardisée de l’intestin grêle entre deux applicateurs de coton humide. Ensuite, le transit gastro-intestinal et colique est analysé pour mesurer la motilité postopératoire. Ensuite, une analyse histochimique et une culture d’organes de l’intestin grêle, musculaire externe ou moi sont effectuées pour examiner les niveaux d’inflammation.

Les résultats obtenus montrent une forte infiltration de granulocytes neutrophiles dans le més et une production excessive d’oxyde nitrique dans les cultures d’oxyde nitrique, ce qui entraîne des retards dans les temps de transit gastro-intestinaux et coliques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le développement et la solution de l’iliose postopératoire, et à étudier une prophylaxie ou un traitement potentiel, Mario Lewison, un technicien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure Après avoir administré 0,8 à 1 % d’isoflurane dans de l’oxygène à une souris mâle. Placez l’animal en position couchée et utilisez du ruban adhésif pour fixer les extrémités.

Utilisez un léger stimulus de douleur pour tester la sédation profonde. Effectuez ensuite une laparotomie médiane, de deux centimètres de long. Ensuite, insérez deux écarteurs stériles pour garder l’abdomen ouvert et étalez soigneusement l’intestin grêle vers la gauche et placez-le sur de la gaze de coton humide.

À l’aide de deux applicateurs en coton humide, évacuez le contenu luminal de tout l’intestin grêle en roulant simultanément les applicateurs du pori au cæcum. Remettez l’intestin dans la cavité péritonéale sans le tordre pour éviter une ischémie ou une obstruction mécanique ou en utilisant deux couches de sutures continues en polyamide 5.0 non résorbables. Fermez l’incision abdominale.

Placez l’animal sous une lampe chauffante et surveillez-le jusqu’à ce qu’il se remette de l’anesthésie. Remettez ensuite la souris dans sa cage et laissez-la accéder à la nourriture et à l’eau. Le lendemain.

Après avoir complètement anesthésié la souris, hyper étendez soigneusement sa tête et utilisez des pinces émoussées Pour retirer la langue, remplissez une seringue d’un millilitre avec au moins 100 microlitres de fluorescéine marquée dextran. Connectez-le à un cathéter artériel et insérez-le soigneusement sous forme de sonde gastrique dans l’estomac. Injectez rapidement 100 microlitres de FITC dextran et retirez le cathéter.

Laissez l’animal reprendre conscience et attendez 90 minutes. Après les 90 minutes, euthanasiez la souris et retirez tout le tractus gastro-intestinal de l’estomac au rectum. Placez l’intestin sur un tampon en polystyrène et évitez de l’étirer.

Ensuite, mesurez toute la longueur de l’intestin grêle et du côlon. Utilisez des canules pour fixer l’intestin au tampon en polystyrène. Divisez l’intestin grêle en 10 segments égaux et le côlon en trois segments égaux.

Après avoir traversé l’intestin aux positions de marche, rincez une fois les sections avec un millilitre d’heli Krebs, de tampon de bicarbonate ou de KHB. Transférez les sections dans des tubes de deux millilitres étiquetés consécutivement et centrifugez vigoureusement les sondes au vortex. Transférez ensuite le supernat dans des tubes propres et numérotés de 1,5 millilitre.

Conserver à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à l’analyse. Pipette suivante. Dupliquez une centaine d’aliquotes d’un microlitre de chaque surnageant dans une plaque noire à 96 puits et utilisez un lecteur de fluorescence pour lire la plaque afin de vérifier le temps de transit du côlon après une anesthésie hebdomadaire de l’animal.

Examinez soigneusement la perméabilité du côlon en insérant une fistule. Sonde à travers l’anus dans le côlon à l’aide de la sonde. Insérez une boule de verre de deux millimètres, trois centimètres dans le côlon, et retirez la sonde.

Démarrez immédiatement une minuterie. Placez la souris dans une cage transparente et surveillez-la pendant le temps nécessaire à l’excrétion de la balle. Pour l’analyse histochimique d’échantillons de toal moyen.

Après avoir coupé des segments de tissu de l’intestin et les avoir immergés dans du KHB froid dans un plat rempli de silicone, utilisez des aiguilles à insectes pour épingler le mésentère sur le plat. Ouvrez les segments le long de son bord mésentérique et étirez le tissu à 120 % de sa longueur et de sa largeur. Fixez le tissu avec des aiguilles en commençant par le mésentère. Machinalement.

Séparez la musculeuse externe ou moi de la tunique muqueuse. Fixez et colorez les échantillons selon la partie écrite de ce protocole de culture. Le moi.

24 heures après la procédure de manipulation intestinale, réséquez tout l’intestin grêle et placez-le dans du KHB froid contenant de la pénicilline, du G et de la streptomycine. Coupez l’intestin en longueurs de trois centimètres et épinglez chaque segment sur un plat en verre recouvert de silicone à l’aide de ciseaux fins. Retirez le mésentère et faites glisser l’intestin sur une aiguille à pencher avec une pince tranchante.

Introduisez doucement le moi à l’aide d’un applicateur en coton humide. Retirez-le de la sous-muqueuse et placez-le dans du KHB plus PS froid. Ensuite, coupez les bandes ME en morceaux de deux à quatre millimètres de longueur et incubez-les dans du KHB plus PS glacé pendant 30 minutes. Rincer l’échantillon plusieurs fois.

Transférez ensuite environ 50 à 60 milligrammes d’EM dans une plaque stérile à 24 puits contenant 500 microlitres de DMEM. Incuber le tissu à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24 heures. Récupérez le surnageant et centrifugez-le à 1000 RCF pendant cinq minutes.

Ensuite, prenez-le, congelez-le dans de l’azote liquide pour des mesures de cytokines ou d’oxyde nitrique. Enfin, à l’aide d’une tache de mouchoir en papier propre, séchez le tissu musculaire pendant 30 secondes, puis pesez-le. Le paramètre le plus important pour évaluer la sévérité de l’iléus postopératoire est l’examen du transit gastro-intestinal ou GIT in vivo.

Cette figure démontre une distribution typique du FITC dextran le long du tractus gastro-intestinal chez les témoins non traités et les souris manipulées intestinalement 24 heures après la chirurgie. Comme le montre ici, les animaux simulés ont montré un GIT normal avec un centre géométrique calculé dans le cæcum. Alors que Im a entraîné un retard significatif de la GIT dans le jéjunum proximal, dans l’analyse de la motilité colique à l’aide d’une boule de verre, des souris simulées ont excrété la balle en 48 à 200 secondes, et Im a prolongé le temps d’excrétion à 470 à 775 secondes pour mesurer l’inflammation.

Dans l’EM, les niveaux de leucocytes ont été analysés à l’aide de la chimie histo ou de l’immunohistochimie, comme on le voit ici. Peu de neutrophiles polymorphonucléaires ont été observés chez les souris témoins, cependant, je suis de l’intestin grêle conduit à leur forte infiltration. De nombreux médiateurs inflammatoires libérés des cellules sont difficiles à détecter dans les tissus.

Les cultures d’organes de lysats permettent de détecter des marqueurs inflammatoires dans la culture. Le surnageant, un médiateur représentatif dans le POI, est l’oxyde nitrique, ou non, qui est un neurotransmetteur inhibiteur majeur dans le tractus gastro-intestinal. Cette figure montre que nno n’a pas pu être détecté chez moi.

Culture d’organes, surnageants de contrôle, animaux chez des souris simulées, des niveaux basaux de nno ont été observés. Cependant, mes cultures de souris manipulées intestinalement produisent significativement plus de nno après une incubation de 24 heures Une fois maîtrisé. Cette technique de manipulation intestinale peut être réalisée dans les 15 minutes si elle est effectuée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire un iléus postopératoire chez la souris et de la façon d’analyser sa gravité.