D'évaluation fonctionnelle de la motilité intestinale et inflammation de la paroi intestinale chez les rongeurs: analyses dans un modèle standardisé de la manipulation intestinale

L'objectif général des expériences suivantes est de réaliser une manipulation intestinale afin d'étudier le développement et la résolution de l'iléus postopératoire dans un modèle rongeur, ce qui est obtenu par une manipulation standardisée de l'intestin grêle entre deux applicateurs en coton humides. Ensuite, le transit gastro-intestinal et colique est analysé pour mesurer la motilité postopératoire. Puis, une analyse histochimique et une culture d'organes de la musculeuse de l'intestin grêle, de l'externe ou de la me sont réalisées afin d'examiner les niveaux d'inflammation.

Des résultats sont obtenus, montrant une forte infiltration de granulocytes neutrophiles dans le me et une production excessive d'oxyde nitrique dans les cultures de me, entraînant des retards dans les temps de transit gastro-intestinal et colique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le développement et la résolution de l'iléus postopératoire, ainsi qu'à l'investigation de prophylaxies ou de traitements potentiels. La démonstration de la procédure sera assurée par Mario Lewison, un technicien de notre laboratoire. Après administration d'isoflurane à 0,8 à 1 % dans l'oxygène à une souris mâle, placer l'animal en position supine et utiliser du ruban adhésif pour fixer les extrémités.

Utilisez un léger stimulus douloureux pour vérifier une sédation profonde. Ensuite, pratiquez une laparotomie médiane de deux centimètres de longueur. Puis, insérez deux rétracteurs stériles afin de maintenir l'abdomen ouvert et éventez soigneusement l'intestin grêle vers la gauche, en le plaçant sur une compresse de gaze humide.

À l’aide de deux applicateurs en coton humides, évacuez le contenu luminal de tout l’intestin grêle en roulant simultanément les applicateurs de la région du pylore jusqu’au caecum. Replacez l’intestin dans la cavité péritonéale sans torsion afin d’éviter une ischémie ou une obstruction mécanique, puis fermez à l’aide de deux couches de points continus en polyamide non résorbable 5.0. Fermez l’incision abdominale.

Placer l'animal sous une lampe chauffante et le surveiller jusqu'à ce qu'il se réveille de l'anesthésie. Ensuite, remettre la souris dans sa cage et lui permettre l'accès à la nourriture et à l'eau. Le lendemain.

Après avoir anesthésié complètement la souris, étirez soigneusement sa tête en arrière et utilisez une pince effilée pour extraire la langue. Remplissez une seringue d'un millilitre avec au moins 100 microlitres de dextrane marqué à la fluorescéine. Connectez-la à un cathéter artériel, puis insérez délicatement le cathéter, comme un tube gastrique, dans l'estomac. Injectez rapidement 100 microlitres de dextrane marqué à la FITC, puis retirez le cathéter.

Laisser l'animal reprendre connaissance et attendre 90 minutes. Au bout de 90 minutes, euthanasier la souris et retirer tout le tractus gastro-intestinal, de l'estomac au rectum. Placer l'intestin sur un tampon en polystyrène et éviter de l'étirer.

Ensuite, mesurez la longueur totale de l'intestin grêle et du côlon. Utilisez des canules pour fixer l'intestin sur le tampon en polystyrène. Divisez l'intestin grêle en 10 segments égaux et le côlon en trois segments égaux.

Après avoir sectionné l'intestin aux positions indiquées, rincer les segments une fois avec un millilitre de tampon Krebs-hélice au bicarbonate, ou KHB. Transférer les segments dans des tubes de deux millilitres étiquetés consécutivement et vortexer vigoureusement avant de centrifuger les échantillons. Puis transférer le surnageant dans des tubes propres de 1,5 millilitre numérotés.

Conserver à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière jusqu'à l'analyse. Ensuite, prélever par pipette. Dupliquer des aliquotes de cent microlitres de chaque surnageant dans une plaque noire de 96 puits et utiliser un lecteur de fluorescence pour lire la plaque afin de vérifier le temps de transit colique après avoir anesthésié l'animal chaque semaine.

Examinez attentivement la perméabilité colique en insérant une fistule. Sondez par l'anus jusqu'au côlon à l'aide du sonde. Insérez une bille de verre de deux millimètres à trois centimètres dans le côlon, puis retirez la sonde.

Démarrer immédiatement un chronomètre. Placer la souris dans une cage transparente et la surveiller pendant la durée nécessaire à l'élimination de la bille. Pour l'analyse histochimique d'échantillons médians à totaux.

Après avoir découpé des segments de tissu intestinal et les avoir plongés dans du KHB froid dans une boîte remplie de silicone, utilisez des aiguilles à insectes pour fixer le mésentère sur la boîte. Ouvrez les segments le long de leur bord mésentérique et étirez le tissu à 120 % de sa longueur et de sa largeur. Fixez le tissu avec des aiguilles en commençant par le mésentère. Mécaniquement.

Séparez la musculeuse externe ou me de la tunique muqueuse. Fixez et colorez les échantillons conformément à la partie écrite de ce protocole pour la culture. Le me.

24 heures après la procédure de manipulation intestinale, réséquez l'intestin grêle entier et placez-le dans du KHB froid contenant de la pénicilline, de la G et de la streptomycine. Coupez l'intestin en segments de trois centimètres de longueur et fixez chaque segment sur une boîte en verre recouverte de silicone à l'aide de ciseaux fins. Retirez le mésentère et faites glisser l'intestin sur une aiguille oscillante à l'aide de pinces effilées.

Incisez délicatement la muqueuse à l’aide d’un applicateur en coton humide. Détachez-la de la sous-muqueuse et placez-la dans du KHB froid additionné de Ps. Ensuite, découpez les bandes de muqueuse en morceaux de deux à quatre millimètres de longueur et incubez-les dans du KHB glacé additionné de PS pendant 30 minutes. Rincez l’échantillon plusieurs fois.

Ensuite, transférez environ 50 à 60 milligrammes de moi dans une plaque stérile de 24 puits contenant 500 microlitres de DMEM. Incubez le tissu à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant 24 heures. Récupérez le surnageant et centrifugez à 1000 RCF pendant cinq minutes.

Ensuite, claquez et congélez rapidement dans l'azote liquide pour les mesures de cytokines ou d'oxyde nitrique. Enfin, à l'aide d'un essuie-tout propre, séchez le tissu musculaire pendant 30 secondes, puis pesez-le. Le paramètre le plus important pour évaluer la gravité de l'iléus postopératoire est l'examen du transit gastro-intestinal ou TGI in vivo.

Cette figure illustre une distribution typique du dextran marqué à la FITC le long du tractus gastro-intestinal chez des souris contrôles non traitées et chez des souris ayant subi une manipulation intestinale, 24 heures après la chirurgie. Comme indiqué ici, les animaux ayant subi une opération factice présentaient un TRG normal, avec un centre géométrique calculé au niveau du cæcum. Alors que la manipulation intestinale (Im) a entraîné un retard significatif du TRG au niveau du jéjunum proximal, lors de l'analyse de la motilité colique à l’aide d’une bille de verre, les souris opérées factice ont expulsé la bille entre 48 et 200 secondes, tandis que la Im a prolongé le temps d’expulsion à 470-775 secondes afin de mesurer l’inflammation.

Dans le ME, les niveaux de leucocytes ont été analysés à l'aide d'une histochimie ou d'une immunohistochimie, comme illustré ici. Peu de neutrophiles polynucléaires ont été observés chez les souris témoins ; toutefois, l'iléon grêle a entraîné une forte infiltration. De nombreux médiateurs inflammatoires libérés par les cellules sont difficiles à détecter dans le tissu.

Les cultures organiques de lysats permettent la détection de marqueurs inflammatoires dans la culture. Le surnageant, un médiateur représentatif dans l’IPO, est l’oxyde nitrique, ou NO, qui constitue un neurotransmetteur inhibiteur majeur dans le tractus gastro-intestinal. Cette figure montre que le NO n’a pas pu être détecté dans l’EM.

En culture d'organes, des surnageants de contrôle, provenant de souris soumises à une opération factice, des niveaux basaux de nno ont été observés. Toutefois, les cultures de souris ayant subi une manipulation intestinale produisent significativement plus de nno après une incubation de 24 heures. Une fois maîtrisée, cette technique de manipulation intestinale peut être réalisée en moins de 15 minutes si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment induire un iléus postopératoire chez la souris et comment analyser sa gravité.