Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation

L'objectif général de cette procédure est d'analyser l'expression des microARN dans les microglies. Cela est réalisé en premier lieu par la dissection du cerveau et de la moelle épinière, puis par l'homogénéisation du tissu du système nerveux central ou SNC. Dans une deuxième étape, les cellules mononucléées du SNC sont isolées par un gradient de type Percoll, puis la population de microglies est identifiée par cytométrie en flux.

Ensuite, l'ARN microglial est isolé et la qualité de l'échantillon est analysée. Enfin, une PCR en temps réel ciblant le microARN d'intérêt particulier est réalisée. En définitive, la méthode du delta delta CT peut être utilisée pour montrer le niveau relatif d'expression d'un microARN particulier dans les microglies.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles ne parviennent pas à isoler un nombre suffisant de cellules mononucléées du SNC ou parce que l'échantillon est contaminé par de la myéline et des débris cellulaires. Ces deux cas entraînent une préparation de faible qualité, soit par une faible concentration d'ARN, soit par une contamination protéique, respectivement. La démonstration de la procédure sera effectuée par moi-même et par Vir.

Une fois la perfusion terminée pour toutes les souris, disséquer les cerveaux et les moelles épinières. Ensuite, placer un cerveau et une moelle épinière à la fois dans un homogénéisateur conique de 15 millilitres, en ajoutant cinq millilitres de PBS aux tissus à chaque fois. Après avoir effectué de 10 à 20 mouvements doux, faire passer l'homogénéat à travers des filtres cellulaires de 70 microns dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres, puis centrifuger les tubes pendant cinq à sept minutes à 834 ×g et à 4 °C.

Après avoir éliminé le surnageant, resuspendre l'homogénat de cerveau et de moelle épinière provenant de deux à trois souris dans cinq à sept millilitres de Percoll à 70 %. Ensuite, recouvrir de sept millilitres de Percoll à 40 % et centrifuger la solution de Percoll et de cellules pendant 30 minutes à 850 ×g à 20 °C sans frein. Éliminer les cellules endommagées, le mille et les débris situés au sommet du Percoll à 70 %.

Ensuite, récupérez les cellules mononucléées à l'interface entre les solutions de 70 % et 40 % par rapport à la solution de référence et diluez les cellules recueillies dans du PBS, au moins selon un rapport de un pour un. Après avoir centrifugé les cellules, resuspendez le culot dans un demi-millilitre de PBS et transférez-les dans un tube Eppendorf de 1,7 millilitre. Commencez par transférer 50 microlitres des cellules triées par gradient de densité dans un nouveau tube Eppendorf de 1,7 millilitre et ajoutez 350 microlitres de tampon FAX au tube.

Ensuite, après avoir ajouté de cinq à 10 microlitres d'anticorps anti-FCR dans le tube, incuber les cellules pendant 10 à 15 minutes sur de la glace. Répartir l'échantillon cellulaire dans deux tubes Eppendorf ; ajouter un microlitre d'anticorps anti-CD11b et deux microlitres d'anticorps anti-CD45.

Incuber les cellules encore 10 à 15 minutes sur de la glace. Étiqueter le deuxième tube comme témoin négatif et le placer sur de la glace. Après l'incubation avec les anticorps de marquage, ajouter un millilitre de tampon fax dans les deux tubes et centrifuger les cellules dans une microcentrifugeuse pendant cinq minutes à 1200 ×g.

Ensuite, fixez les culots dans 400 microlitres de paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS et vortexez les tubes pour éviter l'agglutination. Enfin, analysez les cellules par cytométrie en flux en utilisant l'échantillon de cellules contrôle négatif et les billes BD Com. Commencez par immuniser par voie sous-cutanée un groupe de cinq à dix souris C57BL/6 âgées de huit à douze semaines avec 150 milligrammes du peptide MOG 35 à 55 dans 4 milligrammes par millilitre d'adjuvant complet de Freund afin d'induire l'EAE. Puis administrez la toxine de la coqueluche par voie intrapéritonéale au jour zéro et au jour deux après l'immunisation.

Après avoir isolé et coloré les cellules comme indiqué précédemment, suspendez les culots dans 400 microlitres de PBS au lieu de fixateur juste avant le tri. Ensuite, remplissez deux tubes einor de 1,7 millilitre avec 300 microlitres de PBS supplémenté en 10 % de FBS pour la collecte des échantillons. Enfin, effectuez le tri des populations de microglie et de macrophages avec une haute pureté en utilisant la stratégie de tri illustrée dans ce graphique de densité représentatif.

Après le tri, réanalyser les populations de microglies et de macrophages afin de déterminer les puretés des échantillons cellulaires isolés. Après avoir centrifugé les populations cellulaires triées à 1200 × g pendant cinq à sept minutes dans une microcentrifugeuse, retirer soigneusement le surnageant et congeler les culots cellulaires sur de la glace sèche. Ensuite, transférer les culots cellulaires congelés sur de la glace ordinaire.

Pour la décongélation, ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse provenant d'un kit Nirvana, puis mélangez délicatement la solution cellulaire en pipetant cinq à sept fois. Ajoutez ensuite 30 microlitres de l'additif homogénéisant, vortexez la suspension cellulaire pendant 30 secondes, puis placez les tubes sur de la glace pendant 10 minutes. Ajoutez maintenant 300 microlitres de phénol acide, chloroforme, et vortexez le tube pendant encore 30 secondes.

Ensuite, après avoir centrifugé les cellules pendant cinq minutes à 9 500 ×g, transférez soigneusement les 300 microlitres supérieurs du surnageant contenant la phase aqueuse dans un nouveau tube Eppendorf de 1,7 millilitre. Mélangez la solution avec 375 microlitres d'éthanol à 100 %. Transférez l'ensemble du contenu du tube dans une cartouche filtrante du kit Nirvana et centrifugez la cartouche pendant une minute à 9 500 ×g. Ensuite, jetez le tampon de l'écoulement.

Ajouter 700 microlitres de la solution de lavage 1 du kit Nirvana, puis centrifuger pendant une minute supplémentaire à 9 500 ×g après avoir lavé la cartouche. Répéter deux fois avec 500 microlitres de la solution de lavage 2 du kit Nirvana. Éluer l'ARN de la cartouche avec 60 microlitres d'eau sans nucléase préchauffée.

Enfin, utilisez un spectrophotomètre NanoDrop pour évaluer la pureté et la quantité d'ARN après avoir effectué une Q-R-T-P-C-R en temps réel afin de détecter les micro-ARN dans les échantillons de microglie et de macrophages. Des courbes de P-R-T-P-C-R pour les produits de PCR marqués par fluorescence, mer 1 24 et snow RNA 55, peuvent être établies comme indiqué ici sur le premier graphique. Des courbes typiques représentant la quantité de produits de PCR spécifiques marqués par fluorescence pour des échantillons d'ARN contrôle snow RNA 55 isolés de microglie ou de macrophages dérivés de moelle osseuse, en fonction du nombre de cycles de PCR, sont présentées.

Remarquez comment les valeurs de CT pour l'analyse de l'expression de l'ARN snow RNA 55 provenant des différentes populations cellulaires sont déterminées à l'intersection de la ligne de base avec la partie inférieure de la plage linéaire des courbes de Q-R-T-P-C-R, comme indiqué sur le graphique par les lignes verticales vertes et bleues. Sur ce second graphique, la quantité de produits d'AMP spécifiques marqués par fluorescence pour les échantillons d'ARN expérimentaux mere 1 24 provenant de microglies ou de macrophages dérivés de moelle osseuse est représentée en fonction du nombre de cycles d'AMP. Remarquez comment les valeurs de CT pour l'analyse de l'expression de mere 1 24 provenant des différentes populations cellulaires sont à nouveau déterminées à l'intersection de la ligne de base avec la partie inférieure de la plage linéaire des courbes de Q-R-T-P-C-R, comme indiqué sur le graphique par les lignes verticales vertes et bleues.

Après avoir déterminé les valeurs CT pour chacun des échantillons, comme pour l'ARNc snow RNA 55 et l'expression de mere 1 24 dans les microglies et les dms médullaires de souris normales et EAE présentées dans ce tableau, soustrayez la valeur CT de l'échantillon témoin snow RNA 55 de la valeur CT de l'échantillon expérimental mere 1 24 afin de calculer les valeurs delta CT pour chaque doublon de chaque échantillon. Ensuite, soustrayez la valeur delta CT de l'échantillon de référence des valeurs delta CT des autres échantillons pour calculer les valeurs delta delta CT. Enfin, le niveau relatif d'expression pour chaque échantillon est calculé comme étant deux élevé à la puissance moins delta delta CT, comme indiqué dans ce graphique de densité.

Dans le cas d'une bonne isolation des microglies à partir du SNC normal, 95 à 98 % des cellules correspondront à des microglies CD11b positif CD45 faible, 2 à 5 % de la suspension cellulaire étant constituée de macrophages périvasculaires CD11b positif CD45 élevé, moins de 1 % de lymphocytes CD11b négatif CD45 élevé ou d'astroglies CD11b négatif CD45 négatif ou de cellules gliales oligodendrocytaires ou de fragments cellulaires seront présents. En comparaison, dans une mauvaise préparation, une contamination importante par des cellules CD11b négatif CD45 négatif ou des fragments cellulaires tels que des astroglies ou des particules de myéline rend les cellules inappropriées pour l'isolement d'ARN et toute analyse ultérieure. En outre, la présence de cellules CD11b négatif CD45 élevé peut également indiquer une contamination par des lymphocytes sanguins due à une perfusion insuffisante. Sur ce diagramme de densité, les trois populations cellulaires présentes dans le SNC lors d'une neuroinflammation — les microglies CD11b positif CD45 faible, les macrophages CD11b positif CD45 élevé et les lymphocytes CD11b négatif CD45 élevé — sont représentées sur cette figure.

La qualité de l'ARN déterminée par électrophorèse sur gel après une isolation correcte par rapport à une mauvaise isolation est présentée. Lorsque l'ARN est isolé de manière propre, une échelle d'ARN et l'ARN ribosomique sont visibles ; lorsque le processus d'isolement est mal réalisé, des traînées et des produits de dégradation de faible poids moléculaire apparaissent. Ces données finales démontrent l'expression de mere 1 24 dans les microglies normales d'adultes, les microglies de souris atteintes de EAE et les microglies isolées de souris au stade précoce de développement.

Dans ce premier graphique en barres, l'expression relative de mere 1 24 est nettement plus élevée dans les microglies du SNC normal par rapport à celle observée dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse. De même, bien qu'il existe une augmentation de l'ARN de mere 1 24 dans les macrophages du SNC de souris atteintes de EAE, les microglies expriment encore cinq fois plus d'ARN de mere 1 24. Ce dernier graphique en barres illustre comment les variations du niveau d'expression de mere 1 24 dans les microglies au cours du développement de souris âgées d'une, deux et quatre semaines, comparées à des souris adultes de huit semaines, peuvent également être évaluées à l'aide de cette méthode lors de la réalisation de la procédure.

Il est important de se rappeler de disposer d'une quantité suffisante et d'une bonne qualité de cellules isolées, ce qui garantira de bons résultats pour l'ensemble de l'expérience.