Name: Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Découvrez la détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel pour étudier l'expression génique dans le système nerveux central normal et pendant la neuroinflammation. Cette méthode permet d'analyser les fonctions immunitaires cérébrales.

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<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Récemment un intérêt significatif a été donné à la microglie et l&#39;implication de ces cellules dans de nombreuses pathologies associées à la neuroinflammation et la neurodégénérescence. En outre, le rôle des microARN dans la différenciation des cellules immunitaires et le cancer a considérablement augmenté au cours des dernières années, plusieurs 5,10. Nous avons déjà signalé le rôle de miR-124 dans le maintien du phénotype non activé ou au repos de la microglie dans le SNC normales 7, mais le r...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> Peuvent être préparés à partir de composants secs dans le laboratoire, pH: 7.2 à 7.4 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> Peuvent être préparés à partir de composants secs dans le laboratoire, pH: 7.2 à 7.4 </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> BCBG </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml de Percoll 100% est préparée en mélangeant 10 ml de PBS 10X et 90 ml de Percoll de Sigma. 50 ml de Percoll 70%préparé par le mélange de 35 ml de Percoll à 100% et 15 ml de DMEM 50 ml de Percoll 40% est préparée par mélange de 20 ml de Percoll 100% et 30 ml de 1X PBS </td></tr><tr><td> MOG 35-55 peptide </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Toxine de la coqueluche </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR anticorps bloquants </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE mAb </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Peut être utilisé avec différents fluorophores (par exemple AF488) </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mABs </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> Peut être utilisé avec différents fluorophores (par exemple APC) </td></tr><tr><td> Paraformalhyde (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Diluer 1:15 dans du PBS 1X </td></tr><tr><td> 15% TBE-urée Gel </td><td> Life Technologies Inc </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA TaqMan Kit de transcription inverse </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> Les dosages TaqMan microARN miR-mmu-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 001182 ID </td><td></td></tr><tr><td> Les dosages TaqMan microARN snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 001228 ID </td><td></td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Eau sans nucléase </td></tr><tr><td> Plaque 384 puits clair réaction optique </td&gt; <td> Life Technologies Inc </td><td> 4309849 </td><td> Peut être remplacé par d&#39;autres plaques (par exemple une plaque de 96 puits) dans les différents instruments de PCR en temps réel </td></tr><tr><td> Dounce homogénéisateur (15 ml) </td><td> Wheaton Science Products. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / verre </td></tr><tr><td> 40 tamis cellulaire μ en nylon </td><td> Faucon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse Big </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Diamètre du rotor 18,5 cm </td></tr><tr><td> Petite centrifugeuse </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Rotor diamètre de 6,5 cm </td></tr><tr><td> En temps réel instrument PCR </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AB 7900 HT </td><td> Peut être remplacé par d&#39;autres instruments </td></tr><tr><td> Cytomètre en flux </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Peut être remplacé par d&#39;autres instruments </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Peut être remplacé par d&#39;autres instruments </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre Nanodrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

détection des microarn dans la microglie par pcr en temps réel dans le snc normal et pendant neuroinflammation

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglie sont des cellules de la lignée myéloïde qui résident dans le système nerveux central (SNC) 1. Ces cellules jouent un rôle important dans les pathologies de nombreuses maladies associées à la neuroinflammation tels que la sclérose en plaques (MS) 2. La microglie dans quelques SNC normal exprimer macrophages marqueur CD11b et présentent un phénotype de repos en exprimant de faibles niveaux de marqueurs d&#39;activation tels que CD45. Lors d&#39;événements pathologiques dans le système nerveux central, la microglie sont activés tel que déterminé par la régulation positive de CD45 et d&#39;autres marqueurs 3. Les facteurs qui influent sur le phénotype des microglies et les fonctions dans le SNC ne sont pas bien étudiés. Les microARN (miARN) sont une famille de plus en plus de molécules conservées (~ 22 nucléotides de long) qui sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques normaux tels que la croissance et la différenciation cellulaire 4 et pathologies telles que l&#39;inflammation 5. MiARN régulent à la baisse l&#39;expression de certains gènes cibles en se liant des séquences complémentaires de laARNm ir et de jouer un rôle important dans l&#39;activation des cellules immunitaires innées dont les macrophages et la microglie 6 7. Afin d&#39;étudier les voies médiées par miRNA qui définissent le phénotype des microglies, la fonction biologique, et de distinguer les microglies d&#39;autres types de macrophages, il est important d&#39;évaluer quantitativement l&#39;expression de microARN spécifiques dans des sous-ensembles distincts de SNC-résident microglie. Les méthodes courantes pour mesurer l&#39;expression des miARN dans le SNC comprennent la PCR quantitative à partir de tissu neuronal et de toute hybridation in situ. Cependant, la PCR quantitative à partir de broyat de tissu ensemble ne permet pas l&#39;évaluation de l&#39;expression de miARN dans la microglie, qui ne représentent que 5-15% des cellules de tissu neuronal. Hybridation in situ permet l&#39;évaluation de l&#39;expression de microARN dans des types cellulaires spécifiques dans les coupes de tissus, mais cette méthode n&#39;est pas entièrement quantitative. Dans ce rapport, nous décrivons une amélioration quantitative et sensitive méthode pour la détection de miARN par PCR en temps réel dans la microglie isolés de SNC normal ou pendant l&#39;utilisation neuroinflammation encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), un modèle de souris pour MS. La méthode décrite sera utile pour mesurer le niveau d&#39;expression des microARN dans la microglie dans le SNC normal ou en neuroinflammation associée à diverses pathologies, y compris MS, accident vasculaire cérébral, un traumatisme, la maladie d&#39;Alzheimer et les tumeurs cérébrales.

Les microglies sont les macrophages résidents qui fournissent la première ligne de défense et de la surveillance immunitaire du système nerveux central. Les microARN sont des molécules régulatrices qui jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques, y compris l&#39;activation et la différenciation des macrophages. Dans cet article, nous décrivons la méthode de mesure des microARN dans la microglie.

Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation

Les microglies sont des cellules de la lignée myéloïde qui résident dans le système nerveux central (SNC)1. Ces cellules jouent un rôle important dans les pathologies de nombreux...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser l'expression des microARN dans les microglies. Cela est réalisé en premier lieu par la dissection du cerveau et de la moelle épinière, puis par l'homogénéisation du tissu du système nerveux central ou SNC. Dans une deuxième étape, les cellules mononucléées du SNC sont isolées par un gradient de type Percoll, puis la population de microglies est identifiée par cytométrie en flux.Ensuite, l'ARN microglial est isolé et la qualité de l'échantillon est analysée. Enfin, une PCR en temps réel ciblant le microARN d'intérêt particulier est réalisée. En définitive, la méthode du delta delta CT peut être utilisée pour montrer le niveau relatif d'expression d'un microARN particulier dans les microglies.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles ne parviennent pas à isoler un nombre suffisant de cellules mononucléées du SNC ou parce que l'échantillon est contaminé par de la myéline et des débris cellulaires. Ces deux cas entraînent une préparation de faible qualité, soit par une faible concentration d'ARN, soit par une contamination protéique, respectivement. La démonstration de la procédure ser

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Recherche

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l'exception des protocoles d'extraction d'ARN, la procédure peut être étendue à l'ARN extrait à partir d'autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.

Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

activation de cellules microgliales et microgliose sont des réponses clés à la neurodégénérescence chronique. Ici, nous présentons les méthodes pour in vivo, la visualisation à long terme de la rétine CX3CR1-GFP + cellules microgliales par ophtalmoscopie confocale, et pour le seuil et analyses morphométriques d'identifier et de quantifier leur activation. Nous surveillons changements microgliales durant les premiers stades de glaucome liée à l'âge.

En Vivo Dynamique de la rétine microglial activation cours neurodégénérescence: confocale ophtalmoscopique Imaging and Cell Morphometry dans Souris glaucome

Les microglies (cellules immunitaires du cerveau), sont utilisées comme biocapteur de substitution pour déterminer comment les nanoparticules influencent la neurotoxicité. Nous décrivons une série d’expériences conçues pour tester la réponse microgliale aux nanoparticules et l’exposition des neurones hypothalamiques au surnageant de la microglie activée afin de déterminer la neurotoxicité.

Microglies comme un biocapteur Surrogate pour déterminer Nanoparticules neurotoxicité

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.

Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires

Cet article décrit une méthode d’observation chronique in vivo de la microglie au repos dans l’hippocampe de souris CA1 à l’aide d’une chirurgie contrôlée avec précision et d’une microscopie à deux photons.

In vivo Imagerie chronique à deux photons de la microglie dans l’hippocampe de souris

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules microgliales de l’hypothalamus de souris (ou de petites structures cérébrales équivalentes) en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), dans un délai relativement court. La microglie hypothalamique triée par MACS peut être utilisée pour l’analyse ex vivo et peut être utilisée pour effectuer des essais in vitro .

Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme  

Cet article démontre une méthode pour visualiser et quantifier la motilité et le contact de la microglie avec les points postsynaptiques de la rétine à l’aide de la microscopie confocale à disque tournant.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie et des interactions avec les synapses dans la rétine murine malade

Le logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) est un pipeline d’analyse convivial qui ne nécessite aucune expertise en codage et qui automatise semi-automatisé l’analyse de morphologie microgliale unicellulaire à partir d’images d’immunofluorescence. Validé dans un modèle de neuroinflammation induit par des lipopolysaccharides de rongeurs, le MMPS détecte de manière reproductible les changements morphologiques associés à l’activation et permet un phénotypage microglial...

Logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) : un outil open source et convivial pour l’analyse quantitative de la morphologie de la microglie

Découvrez la détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel pour étudier l'expression génique dans le système nerveux central normal et pendant la neuroinflammation. Cette méthode permet d'analyser les fonctions immunitaires cérébrales.

Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation

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