Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l'hippocampe de souris à l'aide In utero Électroporation

Le but de cette procédure est d’utiliser in utero, l’électroporation, de visualiser et de manipuler génétiquement les dendrites et les épines du cortex cérébral et de l’hippocampe de la souris. Ceci est accompli en injectant d’abord la solution plasmidique et d’ADN souhaitée dans le ventricule latéral des embryons in utero. Ensuite, en utilisant différentes positions des électrodes Palo.

Selon l’injection d’ADN, le cortex cérébral ou l’hippocampe est électroporé, puis un stade postnatal ou adulte souhaité. Des souris sont perfusées et des cerveaux sont collectés. Enfin, les cerveaux sont sectionnés avec un vibram.

En fin de compte, les dendrites et les épines peuvent être visualisées à l’aide de la microscopie confocale. La technique de l’électroporation unitaire présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes d’étude non droite et de la colonne vertébrale. En effet, cette technique permet d’abord d’étudier cet aspect directement in vivo.

De plus, par rapport à la génération de souris knock-out dans l’électro-opération, il existe une approche rapide pour étudier l’effet de la suppression des gènes ou de l’expression des gènes et de la colonne vertébrale, non seulement dans la structure cellulaire spécifique, mais également à un point spécifique du développement. L’utilisation d’un système inductible en inter-électro opération est également un outil utile pour identifier l’interaction fonctionnelle entre les gènes impliqués dans l’écriture et le développement de la colonne vertébrale. En effet, contrairement aux virus, par exemple, il est difficile pour nous de combiner plusieurs gènes HNA ou plusieurs tonnes dans la même population de cellules Pour commencer à diluer l’ADN aux concentrations souhaitées dans l’eau et ajouter un colorant vert rapide à une concentration finale de 0,05 %. Utilisez un extracteur de micro-perpet pour tirer les aiguilles de verre pour l’injection.

Placez une souris enceinte dans une chambre d’induction anesthésique à l’aide de fluor et ouvrez l’oxygène jusqu’à deux litres par minute. Lorsque l’animal perd son réflexe d’écriture, transférez-le dans un masque préopératoire. Placez une goutte d’IGEL sur chaque œil et utilisez un rasoir électrique pour raser les poils de l’abdomen.

Nettoyez une fois la zone rasée avec de la chlorhexidine pour récupérer les poils volants. Transférez l’animal sur un deuxième masque dans la zone chirurgicale, le dos sur le coussin chauffant. Commencez l’opération lorsque le réflexe des pétales a été perdu.

Mettez un masque et des gants stériles et couvrez l’animal avec un rideau stérile. Nettoyez la zone rasée au moins trois fois avec de la chlorhexidine. À l’aide d’un scalpel, faites une incision verticale le long de la ligne médiane à travers la peau.

À l’aide de ciseaux. Faites une incision similaire sur le muscle de l’abdomen le long du coude linéaire. Choisir les embryons les plus accessibles.

Placez une pince à anneau entre deux embryons et retirez délicatement la chaîne embryonnaire de la cavité abdominale. À partir de ce moment, gardez les embryons hydratés avec du PBS préchauffé stérile. À l’aide d’une pince à anneau.

Manipulez doucement la position de l’embryon à l’intérieur du sac amniotique et stabilisez la tête entre les anneaux. Serrez doucement pour pousser l’embryon plus près de la paroi utérine. De l’autre main, prenez le support capillaire et insérez soigneusement l’aiguille au milieu de l’hémisphère pour cibler le ventricule latéral.

En prenant soin de minimiser le mouvement de l’aiguille à la surface de la paroi utérine, et en évitant de percer les vaisseaux sanguins, appuyez sur la pédale pour injecter environ 0,5 microlitre de solution d’ADN vert. Placez les électrodes sur les côtés de la tête de l’embryon avec la pédale positive du même côté que le ventricule injecté pour l’électroporation du cortex, ou du côté opposé du ventricule injecté, l’électroporation de l’hippocampe. Ensuite, appliquez cinq impulsions électriques de 30 volts d’une durée de 50 millisecondes à des intervalles d’une seconde.

Évitez d’appliquer du courant à travers le placenta car cela entraînerait la mort de l’embryon Pour augmenter les chances de survie, injectez et électro-opérez tous les embryons en moins de 30 minutes lorsqu’ils sont terminés au PBS, la cavité abdominale, et utilisez la pince à anneau pour remplacer la corne utérine à son emplacement d’origine. Utilisez des sutures résorbables en vicryl pour fermer l’abdomen, la paroi et la peau. Placez l’animal dans une chambre de récupération jusqu’à ce qu’il se réveille.

Transférez-le ensuite dans une cage sur un coussin chauffant 24 et 48 heures après l’opération. Vérifiez le comportement de la souris pour évaluer la douleur, la souffrance ou la détresse, et pesez l’animal pour analyser le cerveau. Aux stades postnatals, utilisez un vibromasseur pour sectionner les cerveaux précédemment perfusés et les cerveaux postfix montent les sections en aqua poly mount pour imager les dendrites et les épines.

Cette figure montre des exemples de cellules électroporées dans le cortex cérébral, le ca one et le gyrus denté de l’hippocampe, tandis que les souris de type ont été électroporées à E 14,5, où la construction GFP et les cerveaux ont été récoltés au 14e jour postnatal. En injectant un petit volume de solution d’ADN, quelques cellules sont marquées, ce qui permet de visualiser l’arborisation dendritique des cellules GFP positives isolées, ainsi que leurs épines à plus fort grossissement. Lors de cette tentative, il est important de ne pas oublier d’injecter un petit volume d’ADN afin de ne cibler que quelques cellules, et de pouvoir visualiser et quantifier le ne pas écrire dans la colonne vertébrale ou les électro-neuros.