Name: Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Apprenez à mesurer quantitativement la motilité cellulaire avec le test de piste phagokinétique utilisant des nanoparticules d'or. Cette méthode permet de visualiser et quantifier le mouvement cellulaire en temps réel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (AI050677, HD-051 998, et GM103433), un Malcolm Feist bourse de recherche cardio-vasculaire, et une bourse de l&#39;American Heart Association prédoctoral (10PRE4200007).

1. Préparation de gélatine à revêtement Lamelles <ol><li> Placer les lamelles de verre lavées à l&#39;acide (15 mm de diamètre) dans un plastique stérile boîte de 100 mm (es). Placer 8-9 lamelles par boîte et assurez-vous qu&#39;ils ne se touchent pas les uns les autres ou sur les côtés du plat .. </li></ol> Remarque: lamelles, les aiguilles et les pinces doivent être stérile pour éliminer les microorganismes contaminants possibles, ainsi que les endotoxines qui affectent les fonctions cellulaires, y compris la motilité. <ol start="2"><li> Peser la poudre de gélatine et de remettre en suspension la poudre dans de l&#39;eau désionisée pour former une solution de gélatine à une concentration finale de 0,5 g/300 ml. Ensuite, la solution de gélatine doit être autoclavé. </li><li> Pipette 2-3 gouttes de gélatine (~ 100-150 ml) sur chaque lamelle. </li></ol> Remarque: Veillez à ne pas laisser la gélatine de toucher le plat ou vous ne serez pas en mesure de retirer les lamelles de la boîte. <ol start="4"&gt; <li> Cuire les lamelles recouvertes de gélatine dans la boîte de 100 mm dans une étuve à 90 ° C pendant 10 min. </li><li> Enlever tout excès de gélatine par pipetage doux. </li><li> Sécher les lamelles dans le plat 100 mm dans le four à 70 ° C pendant 45 min. </li><li> Une fois sec, retirer les lamelles de la boîte de 100 mm en utilisant une solution stérile, sans endotoxine aiguille et pince à épiler (l&#39;aiguille est utilisée pour pousser gentiment jusqu&#39;à la lamelle à la rendre accessible à la pince à épiler pour enlever délicatement). </li><li> Placez individuelles revêtues de gélatine lamelles dans des puits séparés d&#39;un plat de 24 puits. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;or colloïdal recouvertes de lamelles couvre- <ol><li> Peser une quantité appropriée d&#39;acide chloraurique (trihydrate d&#39;acide tétrachloroaurique; HAuCl 4 · 3H 2 O), puis remettre en suspension dans de l&#39;eau déminéralisée stérile pour préparer une solution finale 14,5 mM (toxique). Préparer 1,5 ml de la solution par 8-9 lamelles. </li></ol> Attention: l&#39;acide chloroaurique est hbrassée en cas d&#39;ingestion cause des brûlures graves de la peau et des lésions oculaires et peut causer une réaction allergique cutanée. Toxique en cas d&#39;ingestion. <ol start="2"><li> Peser une quantité appropriée de citrate de sodium (dihydrogénophosphate trisodique 2-hydroxy-1 ,2,3-tricarboxylate; Na 3 C 6 H 5 O 7), puis remise en suspension de la poudre dans de l&#39;eau désionisée pour obtenir une solution finale à 0,5%. Préparer 1 ml de la solution par 8-9 lamelles. </li></ol> Attention: le citrate de sodium peut irriter les yeux et la peau. Elle peut également causer une irritation des voies respiratoires et digestives. <ol start="3"><li> Dans une solution stérile, sans endotoxines bécher combiner 1,5 ml de la solution stérile 14,5 mm HAuCl4 solution et 13,5 ml d&#39;eau déminéralisée stérile, le résultat devrait donner une solution jaune pâle. Les volumes mentionnés ci-dessus permettra pour 8-9 lamelles d&#39;or colloïdal à faire. </li><li> Tout en continuant à agiter, chauffer la solution sur une plaque chaude jusqu&#39;à ce qu&#39;il commence à bhuile. </li></ol> Avertissement: Le chauffage de la solution doit être effectuée sous la hotte, sous forme de vapeurs peut être nocif / toxique. Les vapeurs sont plus destructeur pour le tissu des muqueuses et des voies respiratoires supérieures. <ol start="5"><li> Retirer le bécher de la plaque chauffante. </li><li> Tout en agitant, ajouter 0,7 ml de la solution de citrate de sodium à 0,5%. Le volume mentionné ci-dessus permettra pour 8-9 lamelles d&#39;or colloïdal à faire. </li><li> Continuez à remuer cette solution combinée pendant environ 2 minutes (Note: La couleur de la solution change graduellement du jaune pâle, d&#39;effacer, de gris, de violet, de pourpre foncé, avant d&#39;atteindre finalement un vin rouge ou, de préférence, couleur rouille) . Ce produit est la solution d&#39;or colloïdal. </li><li> Refroidir la solution d&#39;or colloïdal dans une pipette de 10 ml de 1-2 min (pour garder la couche de gélatine sur la lamelle de fusion lorsque la solution d&#39;or colloïdal est ajouté) et ensuite ajouter 1,0 à 2,0 ml de la colloidasolution d&#39;or sur chaque lamelle l revêtues de gélatine préalablement placée dans un plat de 24 puits (s) (la quantité de la solution d&#39;or colloïdal que vous ajoutez des lamelles recouvertes de gélatine dépend de la façon dont les particules d&#39;or précipité dans la solution - voir commentaires ci-dessous). </li></ol> Remarque: il peut y avoir des variations dans l&#39;efficacité de la précipitation de particules d&#39;or, il est conseillé de d&#39;abord ajouter 0,5-1 ml de la solution d&#39;or colloïdal pour les lamelles recouvertes de gélatine, puis placez le plat de 24 puits dans l&#39;incubateur pendant 0,5 heure . Après ce temps d&#39;incubation, les lamelles doivent être vérifiés au microscope optique de la densité appropriée des particules d&#39;or sur les lamelles. Voir la figure 1 pour des images de microscopie de 20x exemples de trop faible et trop forte concentration de particules d&#39;or. Voir la figure 2 pour des images de microscopie 40x d&#39;une concentration idéale de particules d&#39;or (au moins pour une utilisation avec des monocytes). L&#39;optimal densité des nanoparticules d&#39;or sur la lame doit être déterminée expérimentalement pour chaque type cellulaire utilisé, les caractéristiques des différentes cellules vont dicter leur force de mouvement sur les lamelles. Si la concentration de particules d&#39;or est insuffisant, ajouter un supplément de 0,5-1 ml de la solution d&#39;or colloïdal pour les lamelles recouvertes de gélatine. En fonction de la taille des cellules, la concentration appropriée de particules d&#39;or et peut varier, ce qui va finalement dépendre de la taille de la cellule examinée pour la motilité. Par exemple, avec des monocytes humains étant de petite taille des cellules (~ 10-20 um 28), une plus forte concentration de particules d&#39;or a été nécessaire dans nos analyses. La répartition appropriée des nanoparticules d&#39;or fournit au chercheur la possibilité de facilement et efficacement distinguer les bords de pistes cellulaires. Une concentration de particules d&#39;or qui est trop élevé nuit à la capacité des cellules à se déplacer et donc de mesurer avec précisionleur motilité, tandis que la concentration de particules d&#39;or qui est trop faible limite les capacités de délimiter une plage précise de la motilité. Note importante: Si la synthèse de nanoparticules d&#39;or est problématique, des nanoparticules d&#39;or synthétisées sont commercialement disponibles dans les tailles de 5 nm à 400 nm. En outre, des microsphères fluorescentes ont également été utilisés dans des études de 29 motilité cellulaire. Toutefois, l&#39;utilisation de ces microsphères nécessite un microscope à fluorescence pour l&#39;analyse de la migration des cellules. <ol start="9"><li> Placer le plat à 24 puits avec colloïdales d&#39;or recouvertes de lamelles dans un incubateur à 37 ° C et incuber 1 h à partir du jour au lendemain. </li><li> Après l&#39;incubation, rincer / extraire l&#39;or non lié par trempage des lamelles (3x) en phosphate stérile (PBS, pH 7,4). </li><li> Placez ces colloïdales revêtues d&#39;or lamelles dans un endroit propre et plat de 12 (es) contenant du PBS. </li><li> Conservez ces lamelles à 4 ° C jusqu&#39;au moment deutiliser (parafilm la plaque avant de les placer dans un réfrigérateur). </li></ol> Remarque importante: Toujours garder les colloïdales revêtues d&#39;or lamelles dans un certain type de liquide / médias comme les particules d&#39;or peuvent s&#39;écailler des lamelles si on les laisse sécher. Les lamelles d&#39;or colloïdal doit être utilisé dans les 2-3 mois à compter de la date à laquelle elles ont été faites. Contrôle de la qualité: Dans un dosage unique piste phagokinetic motilité, il est essentiel d&#39;utiliser des lamelles qui se caractérisent par une concentration analogue de particules d&#39;or. Ce point simple permettra aux différences quantitatives dans la motilité cellulaire entre les échantillons d&#39;être uniquement due à la nature du traitement et de ne pas les propriétés physiques des colloïdales revêtues d&#39;or lamelles. Nous sommes favorables à l&#39;utilisation des lamelles seulement faites en même temps dans des expériences individuelles, mais nous avons montré que, tant que la densité des nanoparticules d&#39;or sont égaux, l&#39;utilisation de lamellesà partir de différentes préparations est approprié. 3. L&#39;analyse de la motilité cellulaire <ol><li> Placer les colloïdes d&#39;or revêtues de lamelles dans un milieu approprié cellulaires pour les cellules d&#39;intérêt. </li><li> Transfert des cellules traitées de manière appropriée sur les colloïdales revêtues d&#39;or lamelles placées dans un plat de 24 puits (s) </li></ol> Remarque: Le nombre de cellules transférées au bien unique doit être déterminée pour chaque type cellulaire étudié. Idéalement, les cellules doivent être également répartis sur l&#39;or colloïdal enduit de lamelle, qui à son tour permettra l&#39;analyse statistique des seules traces créées par une seule cellule. Si les cellules sont étalées à une concentration trop élevée, il devient très probable que les pistes se chevauchent de plusieurs cellules on le verra. Pistes qui se chevauchent ne peuvent pas être quantifiés avec précision et, par conséquent, ils ne peuvent pas être pris en compte dans les analyses finales du mouvement des cellules testées. Chevauchement titres à la suite d&#39;l&#39;implication de plusieurs cellules sont généralement faciles à observer, comme la fusion ou croisement des routes (dans le domaine de l&#39;analyse) dans lequel deux ou plusieurs cellules peuvent être observées dans la même zone contiguë effacé. <ol start="3"><li> Incuber à 37 ° C CO / 5% 2 pendant 24 heures (ou à toute heure convenable, par exemple, nous avons analysé la motilité des monocytes entre 6 h et 24 h cellules de post-traitement et endothéliales à 12 h post-traitement). Le délai optimal pour déterminer et mesurer la motilité cellulaire varie en fonction du type cellulaire étudié, et donc doit être déterminée expérimentalement pour chaque type de cellule (un bon point de départ, cependant, est de 6 à 12 heures après le traitement). </li></ol> Remarque: Si expérimentales colloïdales revêtues d&#39;or lamelles doivent être stockés et / ou analysées à un moment plus tard, les cellules et les nanoparticules d&#39;or doivent être fixés sur les lamelles. Pour accomplir cette étape de fixation; Étape suivante 3.3, premier lavage des lamelles de soin 2 fois avec 1xPBS (trempage des lamelles est préférable, comme le retrait de nanoparticules d&#39;or à partir des lamelles doit être évité), puis utiliser une méthode de fixation de cellules standard, telles que l&#39;incubation avec du paraformaldéhyde température ambiante de 3%. Après une incubation de 15 min, le paraformaldéhyde 3% doivent être enlevés et les lamelles soigneusement lavés 3 fois avec du PBS 1x. Les lamelles fixes peuvent être stockés dans un réfrigérateur. <ol start="4"><li> L&#39;utilisation d&#39;un microscope optique, capter des images des morceaux créés par une seule cellule mobile (Remarque: Le grossissement utilisé pour prendre des photos de pistes cellulaires vont certainement varier selon le type de cellule à l&#39;étude). Des exemples de voies cellulaires créés par les cellules non-mobiles et immobiles sur colloïdales d&#39;or revêtues de lamelles sont présentés dans la figure 2. </li></ol> Remarque: Les nanoparticules d&#39;or de la taille utilisée dans le test de motilité piste phagokinetic a été trouvé pour être complètement non toxique pour les cellules 30. Si nécessaire, La viabilité des cellules examinées peut être évaluée par coloration au bleu trypan ou examinés pour d&#39;autres marqueurs de la viabilité cellulaire. Il faudrait tenir compte de la nécessité pour la fixation, le type de fixation, etc, si cette étape doit être réalisée. <ol start="5"><li> En utilisant le logiciel librement disponible, comme logiciel ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) ou NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> ), développés à l&#39; National Institutes of Health, ou ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a> ) développé à l&#39;Université du Texas Health Science Center à San Antonio, la superficie moyenne (en unités arbitraires) de l&#39;or colloïdal autorisé par 10-20 ou plusieurs cellules (par exemple) est déterminé pour chaque groupe expérimental à partir des images capturées. Les statistiques peuvent alors être exécutés sur til a recueilli les résultats. Par exemple, les résultats peuvent être tracées en moyenne ± l&#39;erreur-type des moyens (SEM) avec des tests t de Student effectués, et une valeur de P &lt;0,05 utilisés comme mesure de la signification statistique entre les échantillons. Figures 3 et 4 montrent des étapes de la analyse de la zone de l&#39;or colloïdal dégagé par la cellule. </li></ol>

<ol><li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+cell+motility+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The control of cell motility during embryogenesis.</a> Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+traffic+to+tune+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stop and go traffic to tune T cell responses.</a> Immunity. 21, 305-314 (2004).</li>
<li>Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+tissue+repair%3A+from+wound+healing+to+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).</li>
<li>Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+proteins+in+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Polarity proteins in migration and invasion.</a> Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).</li>
<li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%3A+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li>
<li>Mitchison, T. J., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+cell+motility+and+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-based cell motility and cell locomotion.</a> Cell. 84, 371-379 (1996).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112, 453-465 (2003).</li>
<li>Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+membrane+flow+and+the+cytoskeleton+to+cooperate+in+moving+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells.</a> Cell. 87, 601-606 (1996).</li>
<li>Albrecht-Buehler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagokinetic+tracks+of+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The phagokinetic tracks of 3T3 cells.</a> Cell. 11, 395-404 (1977).</li>
<li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+induces+monocyte+differentiation+and+migration+as+a+strategy+for+dissemination+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence.</a> J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).</li>
<li>Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalmisano%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 622, Humana Press. 379-392 (2010).</li>
<li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOXD3-Overexpression+Increases+Integrin+Alpha+V+Beta+3+Expression+and+Deprives+E-Cadherin+while+It+Enhances+Cell+Motility+in+A549+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).</li>
<li>Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+chemotactic+motility+and+trans-endothelial+migration+of+human+neutrophils+by+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate.</a> FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).</li>
<li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-WASP+and+WAVE2+acting+downstream+of+phosphatidylinositol+3-kinase+are+required+for+myogenic+cell+migration+induced+by+hepatocyte+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor.</a> J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).</li>
<li>Ando, Y., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+insulin-like+growth+factor+I+enhance+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).</li>
<li>Todt, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha+on+human+trophoblast+cell+adhesion+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).</li>
<li>McAuslan, B. R., Reilly, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+phagokinesis+in+response+to+specific+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions.</a> Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).</li>
<li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCMV+activates+PI%283%29K+in+monocytes+and+promotes+monocyte+motility+and+transendothelial+migration+in+a+PI%283%29K-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner.</a> J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).</li>
<li>Smith, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+phosphatidylinositol+3-kinase+and+NF-kappaB+in+human+cytomegalovirus-mediated+monocyte+diapedesis+and+adhesion%3A+strategy+for+viral+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence.</a> J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).</li>
<li>Bentz, G. L., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CMV+infection+of+endothelial+cells+induces+an+angiogenic+response+through+viral+binding+to+EGF+receptor+and+beta1+and+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).</li>
<li>Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+EGFR+on+monocytes+is+required+for+human+cytomegalovirus+entry+and+mediates+cellular+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).</li>
<li>Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCMV-Regulated+Paxillin+in+Monocytes+Links+Cellular+Pathogenic+Motility+to+the+Process+of+Viral+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry.</a> J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).</li>
<li>Turkevich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+nucleation+and+growth+processes+in+the+synthesis+of+colloidal+gold%5BTitle%5D)+AND+%22Discuss.+Faraday.+Soc%22%5BJournal%5D)">A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.</a> Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).</li>
<li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+and+sol+stability+in+mental+colloids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+%26+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Particle size and sol stability in mental colloids.</a> Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).</li>
<li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+nucleation+for+the+regulation+of+the+particle+size+in+monodisperse+gold+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Sci%22%5BJournal%5D)">Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions.</a> Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).</li>
<li>Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+capillary+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of capillary endothelial cell migration.</a> Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).</li>
<li>Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+the+production+of+gold+colloid+monolayers+for+use+in+the+phagokinetic+track+assay+for+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility.</a> Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).</li>
<li>Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+blood+monocyte%3A+two+subpopulations+with+different+sizes%2C+phenotypes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions.</a> Immunology. 77, 298-303 (1992).</li>
<li>Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+behavior+screen%3A+identification%2C+sorting%2C+and+enrichment+of+cells+based+on+motility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14(2005).</li>
<li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound-healing assay.</a> Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel%28R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li>
<li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li>
<li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le dosage de piste phagokinetic motilité présenté dans cet article est une méthode simple et très efficace pour l&#39;analyse quantitative de la migration cellulaire. Parce que plusieurs types de cellules peuvent être analysées 9-17, cette méthode présente l&#39;utilisation vaste potentiel dans de multiples disciplines. L&#39;utilisation de lamelles de verre colloïdales revêtues d&#39;or permet la mesure d&#39;une zone de route autorisée par une cellule mobile. Le test permet de mesurer l&#39;effet de stimuli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lamelles de verre (15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> Gélatine 300 Bloom </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Trihydrate d&#39;acide tétrachloroaurique </td><td> Fisher Chemical </td><td> G54-1 </td><td> 14,5 mm (une solution de travail final) </td></tr><tr><td> Citrate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP327-500 </td><td> 0,5% (solution de travail final) </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> O4042 </td><td> 3% (solution de travail final) </td></tr><tr><td> Boîte de 100 mm Tissue Culture </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 12 puits </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques à 24 puits </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Four Techne Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> Le four de laboratoire standard sera suffisant </td></tr><tr><td> 10 pipettes sérologiques ml </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid de remplissage / Distributeur </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 Single-Channel Pipette manuelle </td><td> Rainin </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Filtres barrière ml </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel ImageJ </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>p :/ / rsb.info.nih.gov / ij / </td><td></td><td> Licence: Public Domain </td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE300 avec un CoolSNAPfx photométriques monochrome 12-bit caméra CCD </td><td> Nikon </td><td></td><td> Discontinued; La spécification la plus comparable a Nikon Eclipse Ti, mais une extrémité inférieure Nikon 80i sera adapté aussi bien. Les autres marques également fournir des microscopes comparables. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Remarque: Les réactifs et équipements énumérés ci-dessous ont été utilisés par nous dans nos différentes études. Autres fournitures, des fournisseurs, des réactifs et de l&#39;équipement peut être utilisé, dans la mesure où ils ont des spécifications similaires. </td></tr></tbody></table>

une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste phagokinetic

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

La motilité cellulaire est un processus biologique important pour les deux organismes unicellulaires et multicellulaires. Il est essentiel pour le mouvement des organismes unicellulaires vers une source de nutriments ou de loin des conditions inappropriées, ainsi que dans les organismes multicellulaires pour le développement des tissus, la surveillance immunitaire et la cicatrisation des plaies, pour n&#39;en citer que quelques rôles 1,2,3. La déréglementation de ce processus peut entraîner de graves maladies neurologiques, cardio-vasculaires et immunologiques, ainsi que exacerbé la formation de tumeurs et la propagation 4,5. Moléculaire, polymérisation de l&#39;actine et de recyclage des récepteurs ont été montré à jouer un rôle important dans la création d&#39;extensions cellulaires (lamellipodes), qui animent le mouvement vers l&#39;avant de la cellule 6,7,8. Cependant, de nombreuses questions sur la migration des cellules biologiques restent sans réponse. Le rôle central de la motilité cellulaire sur la santé humaine et la maladie souligne l&#39;importance de comprendre le mec spécifiquehanisms impliqués dans ce processus et fait des méthodes précises d&#39;évaluation de la motilité cellulaire particulièrement important. Microscopes sont généralement utilisés pour visualiser le mouvement des cellules. Cependant, les cellules se déplacent assez lentement, ce qui rend la mesure quantitative de la migration des cellules d&#39;un processus consommateur de ressources nécessitant de coûteux appareils photographiques et des logiciels pour créer quantitatives temps périmé films de cellules mobiles. Par conséquent, la possibilité d&#39;effectuer une mesure quantitative de la migration cellulaire qui est rentable, non-laborieux, et qui utilise l&#39;équipement de laboratoire commun est une grande nécessité pour de nombreux chercheurs. Le dosage piste phagokinetic motilité utilise la capacité d&#39;une cellule mobile pour dégager des particules d&#39;or de sa trajectoire pour créer une piste mesurable sur une lamelle de verre enduit d&#39;or colloïdal, 9,10. Avec l&#39;utilisation de logiciels librement disponibles, plusieurs pistes peuvent être évalués pour chaque traitement pour accomplir les exigences statistiques. Le test peut être utilisé pour évaluermotilité de nombreux types de cellules, comme les cellules cancéreuses, 11,12 fibroblastes 9, 13, neutrophiles cellules musculaires squelettiques 14, 15, kératinocytes trophoblastes 16, les cellules endothéliales et les monocytes 17, 10,18-22. Le protocole implique la création de lames recouvertes de nanoparticules d&#39;or (Au ​​°) qui sont générés par une réduction de l&#39;acide chloroaurique (3 Au +) par le citrate de sodium. Cette méthode a été développée par Turkevich et al., En 1951 23, puis améliorée dans les années 1970 par Frens et al. 24,25. À la suite de cette étape de réduction chimique, des particules d&#39;or (10-20 nm de diamètre) précipiter à partir du mélange réactionnel et peuvent être appliqués à des lamelles de verre qui sont alors prêts à être utilisés dans des analyses de migration cellulaires 9,26,27. En général, le dosage piste phagokinetic motilité est une mesure rapide, quantitative et facile de la motilité cellulaire. En outre, ilpeut être utilisé comme un simple test à haut débit, pour une utilisation avec types de cellules qui ne se prêtent pas à temps caduc imagerie, ainsi que d&#39;autres utilisations en fonction des besoins du chercheur. Ensemble, la capacité de mesurer quantitativement la motilité cellulaire de plusieurs types de cellules, sans la nécessité pour les microscopes coûteux et des logiciels, ainsi que l&#39;utilisation de matériel de laboratoire et produits chimiques commun, faire l&#39;essai de piste phagokinetic motilité un choix solide pour les scientifiques ayant un intérêt dans la compréhension cellulaire motilité.

Montré est un exemple de photos prises au microscope optique montrant une zone de piste effacée par une seule cellule (un monocyte de nos expériences est illustré à la figure 2). Cellules non-mobiles de créer typique de petite taille, de forme ovale ou un cercle en forme de tracts autour d&#39;eux indiquant un faible niveau basal de mouvement de ces cellules non stimulées (Figures 2A et 2B). En revanche, les cellules très mobiles [dans notre système, le cytomégalovirus humain (HCMV)-cel...

Le test de motilité phagokinetic piste est une méthode utilisée pour évaluer le mouvement des cellules. Plus précisément, le test mesure chimiokinèse (motilité cellulaire aléatoire) au fil du temps de manière quantitative. Le dosage tire parti de la capacité des cellules à créer une piste mesurable de leur mouvement sur colloïdales revêtues d&#39;or lamelles.

Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

La motilité cellulaire est un processus biologique important tant pour les organismes unicellulaires que multicellulaires. Elle est essentielle au mouvement des organismes unicellulaires...

L'objectif général de cette procédure est de pouvoir mesurer quantitativement la motilité cellulaire au fil du temps à l'aide d'un test de motilité cellulaire basé sur des nanoparticules d'or. Cela est réalisé en préparant tout d'abord des lamelles en verre pour un revêtement de nanoparticules d'or. Plus précisément, des lamelles exemptes d'endotoxines sont recouvertes de gélatine, puis chauffées au four.La deuxième étape consiste à réduire l'acide chloroaurique, ce qui permet de créer des nanoparticules d'or, puis à recouvrir uniformément les lamelles préalablement revêtues de gélatine avec cette solution. Ensuite, les cellules sont déposées sur les lamelles recouvertes de nanoparticules d'or pendant la durée souhaitée de l'expérience. Puis, la gélatine déplace les nanoparticules d'or, formant ainsi des sillons.La dernière étape consiste à surveiller et quantifier la motilité cellulaire à l'aide de la microscopie afin d'obtenir des images des trajectoires créées par les cellules en mouvement. En fin de compte, des mesures de surface des trajectoires sont effectuées à l'aide d'un logiciel librement accessible. L'un des principaux avantages de cette technique par rapport aux méthode

a-quantitative-evaluation-cell-migration-phagokinetic-track-motility

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

Cette méthode permet le suivi des cellules en temps réel et des mesures quantitatives de différents paramètres de migration cellulaires tels que la vitesse, le déplacement et la vitesse. Contrairement aux méthodes traditionnelles, cette approche temps réel n'est pas basée sur des mesures quantitatives de point de terminaison de migration, mais plutôt il permet de surveiller et de calcul des paramètres différents en permanence.

Analyse quantitative des migrations au hasard des cellules en utilisant la microscopie vidéo time-lapse

Nous présentons une analyse ex vivo de la migration cellulaire qui permet une quantification précise du potentiel de la migration des cellules de la crête neurale entérique en présence de divers facteurs de croissance.

Un test migration cellulaire quantitative pour murins de neurones entériques progéniteurs

Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l'invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l'invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Une méthode quantitative pour étudier la migration spontanée des cellules dans un micro-environnement confiné à une dimension est décrite. Ce procédé tire parti de canaux micro-usinés et peut être utilisée pour étudier la migration d'un grand nombre de cellules dans des conditions différentes dans des expériences simples.

Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

La migration des cellules est un phénomène biologique qui est impliquée dans une grande variété de physiologiques, telles que la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires, et des processus physiopathologiques, comme le cancer. La détermination de la migration de la matrice 3D-collagène est un outil polyvalent pour analyser les propriétés de migration de différents types de cellules à l'intérieur dans un environnement physiologique analogue à 3D.

Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

De nombreux gènes régulés à la hausse stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales, ce qui entraîne un mauvais pronostic. Il est essentiel de déterminer quels gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Ce protocole présente une méthode permettant d’étudier en temps réel les effets de l’augmentation de l’expression d’un gène sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.

Mesure quantitative en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules tumorales après une transfection d’ARNm synthétique

Cette procédure décrit comment visualiser, suivre et quantifier Acanthamoeba spp. motilité.

Quantification d’Acanthamoeba spp. Motilité

Ce protocole fournit une méthode d’isolement primaire des lymphocytes T murins et de microscopie à intervalle de la migration des lymphocytes T dans des conditions environnementales spécifiques avec une analyse quantitative.

Essai de migration in vitro en temps réel pour les lymphocytes T CD8+ murins primaires

Quantification de l'inflammation cellulaire dans le SNC blessé / pathologiques par cytométrie en flux est compliquée par des lipides / myéline des débris qui peuvent avoir la même taille et la granulation des cellules, diminution de la sensibilité / précision. Nous avons avancé une méthode de préparation des cellules pour enlever les débris de myéline et améliorer la détection de cellules par cytométrie en flux dans la moelle épinière lésée.

Évaluation quantitative des cellules immunitaires dans le tissu blessés médullaires par cytométrie en flux: une nouvelle utilisation pour un procédé de purification cellulaire

Apprenez à mesurer quantitativement la motilité cellulaire avec le test de piste phagokinétique utilisant des nanoparticules d'or. Cette méthode permet de visualiser et quantifier le mouvement cellulaire en temps réel.

Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

Explorer plus de vidéos