Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

L’objectif global de cette procédure est de pouvoir mesurer quantitativement la motilité cellulaire au fil du temps à l’aide d’un test de motilité cellulaire basé sur des nanoparticules d’or. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord des lamelles de verre pour un revêtement de nanoparticules d’or. Plus précisément, les lamelles sans endotoxines sont enrobées de gélatine puis cuites.

La deuxième étape consiste à réduire l’acide chloroorique, ce qui créera des nanoparticules d’or, et à enrober uniformément les lamelles recouvertes de gélatine avec la solution. Ensuite, les cellules sont placées sur les lamelles de revêtement en nanoparticules d’or pendant la durée souhaitée des cellules d’expérience. Ensuite, la gélatine déplacera les nanoparticules d’or en créant des traces.

La dernière étape est la surveillance et la quantification de la motilité cellulaire à l’aide de la microscopie pour imager les traces créées par les cellules en mouvement. En fin de compte, les mesures de surface des pistes sont effectuées à l’aide d’un logiciel disponible gratuitement. L’un des principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’imagerie en accéléré, est que ce test ne nécessite qu’un microscope optique standard, une caméra standard et utilise un logiciel d’imagerie disponible gratuitement.

De plus, le test permet également d’analyser et de comparer facilement plusieurs échantillons à l’aide d’un méthodiste capable de cribler à haut débit. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’influence de différents facteurs physiologiques et du mouvement cellulaire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les études sur les effets des agents pathogènes sur la motilité des cellules infectées. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés parce que la méthode exige que l’on suive strictement les volumes et les températures indiqués dans le protocole.

Dans ce protocole, l’accent est mis sur l’évaluation de la couleur de la solution finale de nanoparticules d’or précipitées pour garantir le succès. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Comme le FGO cinétique piste, les étapes de test de motilité sont difficiles à apprendre.

Ils contiennent plusieurs procédures qui ne sont pas couramment utilisées dans les laboratoires de biologie cellulaire et moléculaire. Pour préparer des lamelles enrobées de gélatine, mettez d’abord en suspension la gélatine et l’eau déminéralisée pour préparer la solution avec une concentration finale de 0,5 gramme par 300 millilitres, puis autoclavez le mélange pendant 15 à 30 minutes. Il est important de le faire dans les deux heures suivant l’ajout de la gélatine dans une hotte de culture tissulaire.

Préparez les lamelles pour le revêtement en transférant d’abord huit à neuf lamelles lavées à l’acide dans un plat en plastique de 100 millimètres. Assurez-vous que les lamelles ne se touchent pas ou ne touchent pas les côtés du plat. Pipetez soigneusement deux à trois gouttes de gélatine sur chaque lamelle en évitant le débordement sur la plaque.

Placez ensuite le plat contenant les lamelles de couverture enrobées de gélatine dans un four et faites cuire à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après 10 minutes, sortez le plat du four et remettez-le dans le mouchoir. Hotte de culture.

Pipetez doucement tout excès de gélatine. Remettez le plat dans le four et séchez les lamelles à 70 degrés Celsius pendant 45 minutes. Une fois que les lamelles sont sèches, sortez le plat du four et remettez-le dans la hotte de culture de tissus.

À l’aide d’une aiguille stérile, soulevez délicatement un côté de la lamelle. Ensuite, utilisez une pince à épiler stérile pour retirer les lamelles enrobées de gélatine du plat et placez-les dans des puits séparés d’une plaque à 24 puits. L’étape suivante consiste à préparer des lamelles recouvertes d’or colloïdal.

Commencez par préparer 10 millilitres de solution de citrate de sodium à 0,5 % en travaillant dans une hotte de culture tissulaire combinée à 1,5 millilitres de la solution d’acide chloro ORIC de 14,5 millimolaires et 13,5 millilitres d’eau déminéralisée de l’autoclave dans un erlenmeyer stérile sans endotoxines. Pour chaque huit à neuf lamelles, le résultat devrait donner une solution jaune pâle. L’acide chloro-ORIC est toxique et doit être manipulé avec précaution. Il est également sensible à la lumière, de sorte que l’étape d’ébullition doit être effectuée dans un réglage de faible luminosité.

Lorsque la solution a atteint son point d’ébullition, retirez le ballon de la plaque chauffante et transférez-le dans une plaque d’agitation. Afin de former les particules d’or colloïdal en solution, ajoutez 0,7 millilitre de la solution de citrate de sodium à 0,5 % pour 15 millilitres de solution d’acide chloro ORIC tout en remuant, continuez à remuer pendant environ deux minutes. Pendant ce temps, la solution passera d’un jaune pâle à un gris clair, à un violet et à un violet foncé.

Avant d’atteindre enfin une couleur vin rouge ou de préférence rouille, prélevez la solution d’or colloïdal dans une pipette de 10 millilitres et laissez la solution refroidir dans la pipette pendant une à deux minutes jusqu’à ce qu’elle atteigne la température ambiante. Ajoutez ensuite 0,5 à un millilitre sur les lamelles enrobées de gélatine dans la plaque à 24 puits Placez la plaque à 24 puits contenant les lamelles recouvertes d’or colloïdal dans un incubateur à 37 degrés Celsius et incubez pendant 30 minutes. Une fois que les particules ont eu le temps de se déposer sur les lamelles enrobées de gélatine, vérifiez leur densité au microscope optique.

La distribution appropriée des nanoparticules d’or permet de distinguer facilement et efficacement les bords des camions solaires. La densité optimale varie en fonction de la taille de la cellule. Une concentration de particules d’or trop élevée entrave la capacité des cellules à se déplacer tandis qu’une concentration de particules d’or trop faible limite la capacité de délimiter une trace précise de la motilité.

Pour cette raison, seules les lamelles fabriquées dans le même lot ou qui ont la même densité doivent être utilisées ensemble dans les expériences individuelles. Si la concentration de particules d’or est insuffisante, ajoutez 0,5 à un millilitre supplémentaire de la solution d’or colloïdal aux lamelles enrobées de gélatine. Si, toutefois, la concentration de particules d’or est trop élevée, comme dans le cas illustré ici, le seul choix efficace est de refaire la solution d’or colloïdal et d’enduire de nouvelles lamelles.

Si la densité des particules est correcte, remettez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et incubez pendant une heure pour rincer pendant la nuit les particules d’or non liées en trempant les lamelles de couverture trois fois dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate. Stockez ensuite les lamelles recouvertes d’or colloïdal dans des puits remplis de PBS d’une plaque propre de 12 puits à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées. Les lamelles ne doivent pas sécher et doivent être utilisées dans les deux à trois mois suivant la date à laquelle elles ont été fabriquées.

L’étape suivante consiste à préparer les lamelles recouvertes d’or colloïdal pour la culture cellulaire. Commencez par les placer dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits sur laquelle environ 0,3 millilitre de milieu de culture a été ajouté avant l’ajout du couvercle. Les feuillets transfèrent environ 5 000 à 50 000 cellules sur chaque feuillet recouvert d’or colloïdal. Le nombre de cellules varie selon le type de cellule, mais la densité de cellules doit être suffisamment faible pour éviter le chevauchement des pistes de cellules de plusieurs cellules dans la même zone.

Couvrez la plaque et placez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant six à 24 heures. En fonction de la motilité du type de cellule, la période optimale doit être déterminée expérimentalement pour chaque type de cellule après l’incubation, fixez les lamelles qui ne seront pas analysées immédiatement en les trempant d’abord deux fois dans du PBS, puis en les incubant dans du paraformaldéhyde à 3 % pendant 15 minutes à température ambiante à l’aide d’un Capture d’images lumineuses des traces créées par une seule cellule mobile sur des lamelles non fixes ou fixes. Le grossissement utilisé pour prendre des photos des pistes cellulaires varie en fonction du type de cellule. Cependant, le même grossissement doit être utilisé pour chaque étude afin de pouvoir comparer les résultats.

Pour les monocytes, le grossissement de 40 x fonctionne bien à l’aide de logiciels disponibles gratuitement tels que image, JNIH image ou image tool déterminer la surface moyenne de l’or colloïdal dégagée par 10 à 20 cellules ou plus pour chaque échantillon des images capturées montrées ici est le chemin dégagé des particules d’or colloïdal par un seul monocyte non stimulé pris avec un objectif 40x. Les cellules non mobiles créent autour d’elles de petites traces ovales ou circulaires caractéristiques, ce qui indique un faible niveau de mouvement vassal. En revanche, les cellules très mobiles sont caractérisées par un mouvement directionnel sous forme de voies allongées et de surfaces globales plus grandes en raison de leurs formes irrégulières.

La meilleure façon d’analyser les traces de cellules est d’utiliser l’outil à main levée du logiciel Image J pour définir leur volume. Des mesures quantitatives de surface peuvent ensuite être effectuées à l’aide de l’outil de mesure dans le menu d’analyse de l’Image J.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de suivre strictement les volumes et les températures indiqués dans le protocole, car les écarts peuvent fortement influencer les résultats finaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer des lamelles enrobées de gélatine, de la préparation de nanoparticules d’or et de lamelles enrobées de nanoparticules d’or, et de la surveillance et de l’évaluation quantitative du mouvement cellulaire à l’aide d’une microscopie optique.

N’oubliez pas que travailler avec les solutions bouillantes sur une plaque chauffante, en particulier les vapeurs de la solution bouillante de fluoro, d’acide AIC et de citrate de sodium peut être dangereuse.